一种新的肺炎球菌结合疫苗及其制备方法
专利名称：一种新的肺炎球菌结合疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新的肺炎球菌结合疫苗。具体而言，本发明涉及一种肺炎球菌多
个血清型荚膜糖与蛋白载体结合的新的肺炎球菌结合疫苗，来源于不同血清型的荚膜糖通
过与蛋白载体的化学结合后，以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。本发明还涉及所述的新的肺炎球菌结合疫苗的制备方法，以及新的细菌荚膜糖蛋白结合疫苗的制备方法。
背景技术：
肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)引发的疾病是全球儿童尤其是发展中国家儿童发病率和死亡率的最主要病因，肺炎球菌的疾病负担主要来自于2岁以下儿童和老年人，肺炎球菌疾病已成为全球一个严重的公共健康问题。全球每年约1，060万5岁以下儿童罹患肺炎球菌疾病，WH0估计每年有160万人死于肺炎球菌疾病，包括70 100万5岁以下的儿童，其中大多数是生活在发展中国家的儿童(http:〃www.who. int/biologicals/areas/vaccines/pneumo/en/)。 全球通过接禾中疫苗可予页防的小于5岁儿童死亡疾病中，肺炎球菌疾病为第l位，占28% (杨永弘，中国疫苗和免疫，2008 ;14:4:376-377)。肺炎球菌疾病死亡人数已超过艾滋病、疟疾和麻疹死亡人数的总和(Obaro，Expert Rev Vaccines. 2009 ;8 (8) :1051-1061)。季节性流感病毒、H1N1流感病毒、HIV病毒感染和其他与免疫缺陷相关的病症使罹患肺炎球菌病的几率大增。美国CDC公布上世纪每次流感大流行，继发的肺炎球菌疾病是发病和死亡的最主要病因，在季节性流感流行期间也观察至Ll同样的情况(http://www. cdc. gov/hlnlflu/vaccination/provider/provider_pneumococcal, htm)。 肺炎球菌诱发的严重疾病包括肺炎、脑膜炎和败血症，中耳炎、鼻窦炎和气管炎也为常见，但感染的临床症状略轻。暴露于肺炎球菌后，常出现暂时性鼻咽部细菌定植但并不发病，当机体抵抗力下降，肺炎球菌可造成呼吸系统的局部感染，如急性中耳炎、鼻窦炎等；肺炎球菌进入下呼吸道导致肺炎；进一步，肺炎球菌侵入血液、脑脊液或其他原本无菌的部位时所形成的感染性疾病，称为侵袭性肺炎球菌疾病(Invasive Pneumococcal Disease,IPD)，菌血症性肺炎、菌血症发热、败血症和脑膜炎是IPD的主要临床表现。
肺炎球菌感染的高发人群是< 5岁儿童和^ 65岁的老人，其中< 2岁儿童发病率最高。美国在大规模使用肺炎球菌结合疫苗前，IPD在《12月龄幼儿中的年发病率为167/10万，在6 11月龄幼儿中的发病率达到235/10万的高峰，在12 23月龄幼儿中的发病率为203/10万，而整体人群的发病率只有24/10万。在欧洲和美国，IPD的年发病率为10 100例/10万。发展中国家中5岁以下儿童中IPD的发病率要比工业化国家高好几倍。我国1996 2000年< 5岁儿童死亡监测结果分析中，肺炎是首位原因(773/10万)，占全部死亡的19% (杨永弘，中国疫苗和免疫，2008 ;14 :4 :376-377)。
肺炎球菌是革兰阳性、具有荚膜的双球菌。荚膜多糖(Polysaccharides, PS)为其主要致病毒力因子。根据荚膜多糖的成份差异，将肺炎球菌区分46个血清群91个血清型。不同年龄、时间和地理区域的优势流行血清型分布谱也有所不同，但常见的血清型在全球各地都有所发现，且全球常见的致病血清型是一致的。从全球范围来看，约20余种血清型与超过80%发生在各年龄段的IPD有关。全球最常见的血清群是6、14、19，然而在发展中国家幼儿IPD中主要是1、5、8血清群。 肺炎球菌对抗生素(如青霉素、头孢菌素、复方新诺明、大环内酯类和氟喹诺酮类)的耐药性在全世界已经成了一个相当严峻的、急剧发展的现象。随着肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性日益增加，当前亟需有效的疫苗来控制肺炎球菌疾病(WHO. WeeklyEpidemiological Record. No. 12， 2007 ;93-104)。目前，有2个预防肺炎球菌疾病疫苗已上市，分别是含有23个血清型荚膜多糖抗原的疫苗(Pneumococcal PolysaccharideVaccine, PPV23)和含有7个血清型荚膜糖与蛋白载体结合的结合疫苗(PneumococcalConjugate Vaccine, PCV7)。 荚膜糖(包括荚膜多糖和荚膜寡糖)抗原是非T细胞依赖型抗原，不能产生免疫记忆反应，在2岁以下儿童中免疫原性弱。因此PPV23主要用于预防成人和^ 2岁儿童肺炎球菌性疾病。PPV23每剂0. 5毫升，含有23个血清型(1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)的纯化荚膜多糖，每个血清型荚膜多糖为25 ii g。这23个血清型在美国和其他一些工业化国家覆盖大多数的成人IPD约90%， PPV23也包括最常见的耐药血清型。30多年来，尽管进行了多个研究，PPV23在儿童和成人的效力和效果仍然难以定论，存在诸多争议。对PPV23疫苗的效力和效果进行综合性的meta分析(包括2007年WHO委托开展的meta分析和一个对RCTs的综合分析)发现，在健康年轻人中PPV23对IPD和全因肺炎具有保护作用，在老年人中对IPD至少也有一定程度的保护。但这些试验并未证实PPV23在高风险人群(如患有可增加感染风险的基础疾病的成人和儿童、所有年龄段的严重免疫抑制者)对IPD和全因肺炎具有保护作用(Moberley S et al. Cochrane Database ofSystematic Reviews,2008 :1 ;CD000422，HussA et al. Canadian Medical Associationjournal, 2008.)。许多工业化国家推荐老人和其他高风险人群接种PPV23, WHO建议在资源有限的国家，现有证据不支持老人和高风险人群常规接种PPV23 (WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 42， 2008 ;373-584)。
荚膜糖抗原和蛋白载体经化学键结合后，转变为T细胞依赖型抗原，可诱导T细胞介导的免疫应答，其特征是促进保护性免疫力的形成，尤其是在婴儿中产生保护，以及诱导免疫记忆。每0. 5ml剂量的PCV7含2 ii g血清型4、9V、 14、 19F和23F的荚膜多糖；2 y g血清型18C的寡糖；4 g血清型6B的多糖。每一血清型荚膜糖都与无毒性的白喉CRM. 197蛋白结合，并由磷酸铝佐剂吸附。在美国，在引进该疫苗开展大规模免疫接种之前，该疫苗中包含的血清型约占儿童侵袭性肺炎链球菌株的86%。美国的大规模现场研究表明，由PCV7疫苗血清型诱导的针对IPD的保护性免疫力在接种了至少3针次的儿童中可达97. 4%，在至少接种1针次的儿童中可达93. 9%。在将PCV7引进国家免疫接种规划1年后，由该疫苗中含有的肺炎球菌血清型所致的IPD在所有1岁以下接种者中的发病率降低了 100%。在引进该疫苗3年后，1岁以下儿童中所有IPD的发病率降低了 84. 1%;在20 39岁成人中降低了52%，在60岁以上个体中降低了27%。后续监测表明，在引进该疫苗2年后，IPD在5岁以下儿童中的发病率降低了 75% 。在5岁以上、未接种疫苗的人群中IPD发病率的下降可能是因为来自5岁以下、已接种疫苗的婴幼儿的细菌传播减少了 ，即所谓"群体免疫"现象。在美国，在所有被防止的IPD中约有68X可归功于这种间接效应。PCV7已通过在全球 不同地区开展的试验中接受了检验，并已被证实是有效的、安全的、耐受性好，即便是在HIV 患儿中也是如此。WHO全球疫苗安全咨询委员会在2006年11月对PCV7的安全性进行了 评估，结论认为，有关PCV7和其他肺炎球菌结合疫苗的安全性的证据是令人信服的(WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 12，2007 ;93—104)。 然而，PCV7大规模接种后，肺炎球菌血清型流行病确出现了变化，PCV7于2000 年在美国大规模接种后，在小于1岁儿童中观察到非疫苗血清型IPD成为最大增长，达到 10. 8/10万。在小于5岁儿童中19A血清型引发的IPD发病率从1998 1999年的2. 6/10 万增长至2005年的9. 3/10万。2005年，在小于5岁儿童中的IPD的40%是非疫苗血清型 19A引起的，19A成为发病率增长最高的血清型。2005年在小于5岁儿童中尽管PCV7疫苗 血清型疾病继续下降，但是2002 2005年IPD总体发病率却呈现平稳状态(Reingold et al.Morbidity & Mortality WeeklyR印ort. 2008 ;57 :6 :144-148.)。另一研究者也指出， 2002 2005年小于5岁儿童中每年IPD的72 91 %是非疫苗血清型菌株引发的(Pelton et al.Pediatr Infect DisJ. 2007 ;26 (6) :468-472.)。 有鉴于成功的疫苗对肺炎球菌疾病所带来的巨大的公共卫生影B向，WHO认为应优 先开发安全、有效、价格适中，并能为肺炎球菌疾病提供更广谱保护的肺炎球菌疫苗。需要 有更有效的结合疫苗或其他类型的疫苗，这些疫苗可涵盖导致全球大龄儿童和成人严重疾 病的大多数肺炎球菌血清型(往往也是对常用抗菌药物耐药的血清型)。WH0支持当前正 在开展的这类疫苗产品的研发工作(WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 42， 2008 ; 373-584)。因此，扩大PCV7疫苗血清型就凸显为急迫的任务。 近年来，鉴于1 、3、5、6A、7F和19A血清型侵入性肺炎疾病的严重性和危害，在PCV7 疫苗基础上增加血清型1和5的PCV9、继续增加血清型7F的PCV10、再增加血清型3的 PCV11、进一步增加血清型6A和19A的PCV13相继在开发中。PCV7在美国、欧洲、亚洲和拉 丁美洲的覆盖率分别为80 90%、 60 80%、 40 80%。在PCV7中增加6个型别荚膜糖 蛋白结合物，成为13价结合疫苗。13价结合疫苗对美国和欧洲的覆盖率均提升至90%以 上，对亚洲和拉丁美洲的覆盖率也提升至70 80%。然而，相比较PPV23疫苗在全球的覆 盖率和考虑到大规模接种疫苗后将出现非疫苗血清型流行增加的趋势，PCV13覆盖率仍需 要继续扩大。 现有肺炎球菌结合疫苗在技术上均是将每一个血清型的荚膜糖独立与蛋白载体 经化学键结合后，形成单价血清型荚膜糖_蛋白结合体，再将各个单价血清型荚膜糖_蛋白 结合体合并，进而配制成为含多个血清型荚膜糖的肺炎球菌结合疫苗。肺炎球菌结合疫苗 中各个荚膜糖抗原以单价荚膜糖-蛋白结合体独立存在，彼此并无结构上的链接。例如， PCV7是将来源于7个血清型的不同荚膜糖分别与蛋白载体CRM197经化学键结合形成7个 单价荚膜糖_蛋白结合体，即4PS-CRM197、9VPS-CRM197、14PS-CRM197、19F PS-CRM197、23F PS-CRM197、6B PS-CRM197禾P 18C 0S-CRM197，再将上述7个单价荚膜糖-蛋白结合体按比 例合并配制成多价成品疫苗。因此，利用现有技术将超过13个血清型的更多血清型荚膜糖 与蛋白载体分别结合，形成多个单价的血清型荚膜糖-蛋白结合体，再将多个单价血清型 荚膜糖-蛋白结合体合并，并制成单一疫苗制剂，在技术上仍存在困难(中国专利申请号 200680053139. 6)。同时，现有的PCV7和即将上市的PCV13与Hib结合疫苗相比较，在生产
7过程和生产成本方面分别相当于7个和13个Hib结合疫苗。这些因素限制了肺炎球菌结合疫苗的进一步发展。 本发明提供的新型肺炎球菌结合疫苗，系将来源于2个不同血清型荚膜糖抗原或多个不同血清型荚膜糖抗原，与载体蛋白进行化学结合，形成2价血清型荚膜糖_蛋白结合体或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体；再将一个或两个或两个以上这样的结合体配制成肺炎球菌结合疫苗。因此，本发明的肺炎球菌结合疫苗继承了现有肺炎球菌结合疫苗的安全性、良好的免疫原性、诱导免疫记忆的优势；又成功地解决了将更多的血清型荚膜糖抗原纳入其中的技术困难，使疫苗覆盖范围更广；进一步，显著性地縮短了疫苗生产过程和降低了生产成本。
发明内容
本发明一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合与其它型荚膜糖相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。换言之，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键相互间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。本发明提供的肺炎球菌结合疫苗用于婴幼儿、儿童及成人预防肺炎球菌感染引发的疾病。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜多糖，这些来源于不同血清型的荚膜多糖与蛋白载体进行化学键结合，荚膜多糖通过与蛋白载体的化学键结合与其它型荚膜多糖相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜多糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜多糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜多糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键相互间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜寡糖，这些来源于不同血清型的荚膜寡糖与蛋白载体进行化学键结合，荚膜寡糖通过与蛋白载体的化学键结合与其它型荚膜寡糖相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜寡糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜寡糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键相互间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜多糖和寡糖，这些来源于不同血清型的荚膜多糖和寡糖与蛋白载体进行化学键结合，荚膜多糖和寡糖通过与蛋白载体的化学键结合与其它型荚膜多糖和寡糖相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜多糖和寡糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜多糖和寡糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖和寡糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜多糖和寡糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键相互间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。
本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜多糖和寡糖，这些来源于一组不同血清型的荚膜多糖与蛋白载体进行化学键结合，这组荚膜多糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜多糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜多糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。这些来源于另外一组的不同血清型的荚膜寡糖与蛋白载体进行化学键结合，这组荚膜寡糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于一组不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖和来源于另外一组不同血清型的荚膜寡糖抗原分别与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述各型荚膜多糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述各型荚膜寡糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。2价或多价血清型荚膜多糖_蛋白结合体和2价或多价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体分别独立存在疫苗中，相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，此2 45个血清型荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。来源于不同血清型的荚膜糖以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体独立存在疫苗中，换言之，本发明疫苗中包含的每个2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体与其他2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，此2 45个血清型荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，其中，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体分别含有相等价数的血清型荚膜糖，并且该价数均介于2 45之间。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。来源于不同血清型的荚膜糖以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体独立存在疫苗中，其中，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式独立存在于疫苗中，并且该相等价数均介于2 45之间。换言之，本发明疫苗中包含相等价数的血清型荚膜糖-蛋白结合体的组合，例如，包含两个以上2价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含两个或两个以上3价血清型荚膜糖-蛋白结合体；或包含两个或两个以上4价血清型荚膜糖-蛋白结合体；或包含两个或两个以上5价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上6价血清型荚膜
9糖-蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上7价血清型荚膜糖-蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上8价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上9价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上10价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上11价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上12价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上13价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上14价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上15价血清型荚膜糖-蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上16价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上17价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上18价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上19价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上20价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上21价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上22价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上23价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上24价血清型荚膜糖_蛋白结合体；以此类推，直至包含一个或两个45价血清型荚膜糖_蛋白结合体；并且，每个2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体与其他2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，此2 45个血清型荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，其中，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以不相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，且该不相等价数介于2 45之间。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。来源于不同血清型的荚膜糖以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体独立存在疫苗中，其中，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以不相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式独立存在于疫苗中，且该不相等价数介于2 45之间。换言之，本发明疫苗中同时包含不相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合，既可包含2价血清型荚膜糖_蛋白结合体，也包含3价血清型荚膜糖_蛋白结合体、4价血清型荚膜糖_蛋白结合体、5价血清型荚膜糖_蛋白结合体、直至45价血清型荚膜糖_蛋白结合体的任选组合。并且，每个2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体与其他2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体相互间没有结构上的链接。
本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，此2 45个血清型荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，其中，所述两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以部分相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，且该相等价数介于2 45之间。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫
10苗，所述荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。来源于不同血清型的荚膜糖以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体独立存在疫苗中，其中，所述两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以部分相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式独立存在于疫苗中，且该相等价数介于2 45之间。换言之，本发明疫苗中同时包含相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体和不相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合，并且，每个2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体与其他2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些来源于不同细菌血清型(群)的荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，各型(群)荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于肺炎球菌多个血清型、脑膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的联合疫苗，所述各型(群)荚膜糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌2群(A、 C)荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些来源于不同细菌血清型(群)的荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，各型(群)荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于肺炎球菌多个血清型、脑膜炎球菌2群(A、 C)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的联合疫苗，所述各型(群)荚膜糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些来源于肺炎球菌不同血清型的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合形成彼此间结构上的链接，以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。这些来源于脑膜炎球菌不同血清群的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合形成各群荚膜糖彼此间结构上的链接，以4价血清群荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。来源于b型流感嗜血杆菌的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合，以单价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于肺炎球菌多个血清型、脑膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的联合疫苗，所述肺炎球菌以每2价和/或多价血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述脑膜炎球菌各群荚膜糖以被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述b型流感嗜血杆菌荚膜糖以被蛋白载体结合的形式存在于疫苗中。肺炎球菌荚膜糖、脑膜炎球菌荚膜糖、b型流感嗜血杆菌荚膜糖相互间没有结构上的链接。
本发明又一方面提供一种肺炎球菌_脑膜炎球菌_b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌2群(A、 C)荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些来源于肺炎球菌不同血清型的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合形成彼此间结构上的链接，以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。这些来源于脑膜炎球菌不同血清群的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合形成各群荚膜糖彼此间结构上的链接，以2价血清群荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。来源于b型流感嗜血杆菌的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合，以单价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于肺炎球菌多个血清型、脑膜炎球菌2群(A、 C)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的联合疫苗，所述肺炎球菌以每2价和/或多价血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述脑膜炎球菌各群荚膜糖以被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述b型流感嗜血杆菌荚膜糖以被蛋白载体结合的形式存在于疫苗中。肺炎球菌荚膜糖、脑膜炎球菌荚膜糖、b型流感嗜血杆菌荚膜糖相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体的多价细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤 (a)从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型(群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖； (b)将步骤(a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群)的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖； (c)将步骤(b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合并纯化，制成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原； (d)将步骤(c)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。 在本发明术语中，荚膜糖包括荚膜多糖和荚膜寡糖；所述荚膜寡糖是荚膜多糖经水解法(包括酸、碱、酶水解)、氧化法和消除法(包括碱或裂解酶介导的P消除法)等化学方法降解后的荚膜寡糖；进一步，所述荚膜寡糖还包括荚膜多糖经超声波降解法和机械剪切等物理方法降解后的荚膜寡糖。 在本发明术语中，单价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体是指一个单一血清型
(群)荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，该荚膜糖与其它型(群)荚膜糖没有结构上的链接。2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体是指2个不同血清型(群)荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成结合物，此2个型(群)荚膜糖经与蛋白载体生成化学键彼此间建立结构上的链接。换言之，蛋白载体经化学键将2个不同型(群)荚膜糖链接在一起。多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体是指3个或3个以上的不同血清型(群)荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成结合物，此3个或3个以上的型(群)荚膜糖经与蛋白载体生成化学键相互间建立结构上的链接。换言之，蛋白载体经化学键将3个或3个以上的不同型(群)荚膜糖链接在一起。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，制备荚膜糖的肺炎球菌血清型选自于 肺炎球菌全部血清型菌株，优选45个型菌株，更优选1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株，最优选1、2、3、4、5、6A、6B、 7F、9V、 14、 18C、 19A、 19F、23F型菌株。进一步，制备荚膜糖的肺炎球菌血清型菌株是依据流 行病学流行优势血清型菌株而确定的。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，来源于多个血清型菌株的荚膜糖抗原 任选地以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在 于疫苗中。优选45价血清型荚膜糖_蛋白结合体；更优选24价血清型荚膜糖_蛋白结合 体；最优选14价血清型荚膜糖_蛋白结合体；进一步，优选12价血清型荚膜糖_蛋白结合 体；优选11价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选10价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选9 价血清型荚膜糖-蛋白结合体；优选8价血清型荚膜糖-蛋白结合体；优选7价血清型荚膜 糖_蛋白结合体；优选6价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选5价血清型荚膜糖_蛋白结 合体；优选4价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选3价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选2 价血清型荚膜糖-蛋白结合体。换言之，例如，来源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株的荚膜糖优选地以24价血清 型荚膜糖_蛋白结合体形式存在；更优选以12价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在；最 优选以8价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在；进一步，优选以6价血清型荚膜糖_蛋 白结合体形式存在；优选以4价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在；优选以3价血清型 荚膜糖_蛋白结合体形式存在；优选以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在。所述来 源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、 33F型菌株的荚膜糖是以任选方式划分为24价(l组)；12价(2组)；8价(3组)；6价(4 组)；4价(6组)；3价(8组)；2价(12组)。每组荚膜糖与蛋白载体结合后再混合组成本 发明疫苗。因此，24价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由1个24价血清型荚膜糖_蛋 白结合体所组成；12价血清型荚膜糖-蛋白结合体疫苗是由2个不同的12价血清型荚膜 糖_蛋白结合体所组成；8价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由3个不同的8价血清型荚 膜糖_蛋白结合体所组成；6价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由4个不同的6价血清 型荚膜糖_蛋白结合体所组成；4价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由6个不同的4价 血清型荚膜糖_蛋白结合体所组成；3价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由8个不同的3 价血清型荚膜糖_蛋白结合体所组成；2价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由12个不同 的2价血清型荚膜糖_蛋白结合体所组成。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，来源于多个血清型菌株的荚膜糖抗原 任选地以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式并以 组合方式存在于疫苗中。在本发明疫苗中，抗原优选2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体 进行组合；更优选2 24价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；最优选2 14价血清型 荚膜糖_蛋白结合体进行组合；进一步，优选2 12价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 11价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 10价血清型荚膜糖_蛋 白结合体进行组合；优选2 9价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 8价血清 型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 7价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优 选2 6价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 5价血清型荚膜糖_蛋白结合 体进行组合；优选2 4价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 3价血清型荚膜 糖-蛋白结合体进行组合。换言之，例如，来源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株的荚膜糖优选地以2 24价血清 型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；更优选以2 14价血清型荚膜糖_蛋白结合体的 组合形式存在；最优选以2 12价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；进一步， 优选以2 11价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 10价血清型荚 膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 9价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形 式存在；优选以2 8价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 7价血 清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 6价血清型荚膜糖_蛋白结合体的 组合形式存在；优选以2 5价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 4 价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 3价血清型荚膜糖_蛋白结合 体的组合形式存在。2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和多价血清型荚膜糖_蛋白结合体混 合后组成本发明疫苗。因此，本发明疫苗可同时包含2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和多 价血清型荚膜糖_蛋白结合体。 本发明提供由2价血清型肺炎球菌荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型肺炎球 菌荚膜糖-蛋白结合体的组成的肺炎球菌结合疫苗，在本发明优选的实施方案中，预先将 肺炎球菌荚膜糖划分为2个和/或多个组，每个组包含2个血清型荚膜糖或多个血清型荚 膜糖。每个组所含的血清型荚膜糖经合并后再与蛋白载体进行化学键结合，形成2价血清 型荚膜糖_蛋白结合体或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，进而配制成疫苗成品。因此，将 血清型荚膜糖划分成组的数量并且确定每组包含2个血清型荚膜糖或多个血清型荚膜糖 是依据荚膜糖分子量大小、总氮、磷、糖醛酸、己糖胺、甲基戊糖、0-乙酰基含量划分。进一 步，随机地任选血清型荚膜糖进行组合。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗，荚膜糖抗原任选地以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血 清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。其中，所述的2价血清型荚膜糖_蛋白结合 体的制备是预先将2个来源于不同血清型荚膜糖合并，然后再与蛋白载体进行化学结合， 形成2价血清型荚膜糖_蛋白结合体。2个血清型荚膜糖均与载体蛋白产生化学键链接， 载体蛋白又依据化学键将2个荚膜糖在结构上形成链接。所述的多价血清型荚膜糖_蛋白 结合体的制备是预先将多个来源于不同血清型荚膜糖合并，然后再与蛋白载体进行化学结 合，形成多价血清型荚膜糖-蛋白结合体。多个血清型荚膜糖均与载体蛋白产生化学键链 接，载体蛋白又依据化学键将多个荚膜糖在结构上形成链接。因此，来源于不同血清型荚膜 糖预先合并的相互间比例是确定本发明结合疫苗成品中各型抗原含量的主要条件之一，荚 膜糖合并比例根据荚膜糖种类(多糖或寡糖)、荚膜糖结构特征、荚膜糖_蛋白结合体价数、 结合方法及工艺条件等因素而变化。在本发明优选的实施方案中，荚膜糖相互间合并重量 比优选为l : 0.05 20(w/w)(本发明所述w/w系指重量比，例如iig/iig)的比例合并，更
14优选的合并重量比为i : o. i 10(w/V)，最优选的合并重量比为i : o. 2 5(w/w)。荚 膜糖合并有多种其它的重量比，在此所述重量比仅仅是用于说明本发明。所以，可以采用各
种等同的荚膜糖合并重量比实现本发明所述的2价血清型荚膜糖-蛋白结合体或多价血清
型荚膜糖-蛋白结合体。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，所述蛋白载体选自破伤风类毒素(TT)、 白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒变异体(CRM197) 、 B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球 菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血杆菌 D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、铜绿假单胞菌 外毒素A(PEA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)。更优选TT、DT、CRM197和0MP。最优选DT和CRM197。 总之，选用上述蛋白作为最常见的载体和细菌类荚膜糖结合制备结合疫苗是本领域技术人 员公知的方案，例如选用这些蛋白载体制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗、制备肺炎球菌结 合疫苗、制备脑膜炎球菌结合疫苗(Lee， Chi-Jen等人Infect Medl9(3) : 127-133， 2002)。 在本发明优选的实施方案中，结合肺炎球菌多糖的蛋白载体最优选为DT。如果满足需要，也 可采用其它蛋白载体，此处给出的蛋白载体仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明的肺炎球菌结合疫苗的又一方案，将来源于肺炎球菌的蛋白PspA、 PsaA、
Ply等合并成为肺炎球菌蛋白复合物，再将此蛋白复合物作为蛋白载体与荚膜糖进行结合。
一方面，肺炎球菌蛋白复合物发挥蛋白载体的功效，将荚膜糖由T细胞非依赖型抗原转变 成T细胞依赖型抗原，产生免疫记忆反应。另一方面，肺炎球菌蛋白复合物又作为蛋白抗原 参与免疫应答反应，并且扩大了结合疫苗交叉免疫保护范围，增强疫苗的免疫效力。
在本发明中，肺炎球菌荚膜糖的制备和质量控制的方法及标准是本领域技术人员 所公知的。在本发明优选的实施方案中，技术人员可依据世界卫生组织正式颁布的肺炎球 菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)和中华人民共 和国药典三部(2005年版)等技术文件制备荚膜糖并进行质量检定。 在本发明中，单价荚膜糖和蛋白载体结合的方法以及对单价荚膜糖-蛋白结合 体进行质量控制的方法及标准是本领域技术人员所公知的(Pawlowski et al. Vaccine 2000 ;18 :1873-1885 ;Wessels et al. J. Clin. Invest. 1990 ;86 :1428-1433 ;WHOTechnical Report Series.No. 897. 2000 ;WHO Technical Report Series. No. 924. 2004 ;WHO Technical R印ort Series. No. 927. 2005 ;罗宾逊等，疫苗关键技术详解。化学工业出版社， 2006年，165-178页；张延龄等，疫苗学。科学出版社，2004年，506_517、652-653、679_681、 699-700、896-902、918-925、943-945、961-964、968-978页；)。在本发明优选的实施方案 中，2价或多价荚膜糖和蛋白载体结合方法可选用任何已知的单价荚膜糖和蛋白载体结合 的方法进行制备，优选自还原胺法、酰胺縮合法、硫醚縮合法、二硫化反应法、硫代氨甲酰反 应法、0-烷基异脲化反应法、重氮结合反应法，更优选还原胺法和酰胺縮合法，最优选2种 法或多种方法的联合应用。技术人员可参照世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制 造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)制备2价或多价荚膜糖-蛋 白结合体并进行质量检定。在本发明优选的一个实施方案中，先用溴化氰(CNBr)或氰化剂 (1-氰基_4- 二甲基氨基-吡啶四氟硼酸，CDAP)对2价荚膜糖或多价荚膜糖进行活化处 理，再以己二酰肼(ADH)为双功能亲核间隔基加入已活化的荚膜糖中，形成荚膜糖-ADH衍生物，再经过碳二亚胺(EDAC)介导的縮合作用与蛋白载体共价结合，形成2价荚膜糖-蛋 白结合体或多价荚膜糖_蛋白结合体，再经纯化获得用于配制肺炎球菌结合疫苗的抗原组 分。荚膜糖与蛋白的结合有多种已知的方法，在此所述的结合方法仅仅是用于说明本发明。 所以，可以采用各种等同的方法实现本发明所述的结合，因此任何用于荚膜糖与蛋白载体 结合的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。 本发明提供制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型 (群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法。其中，所述细菌包括但不限于肺 炎球菌、脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌、葡萄球菌、B群链球菌等具有荚膜 糖的细菌。在本发明优选的实施方案中，细菌优选肺炎球菌、脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆 菌。在本发明中，制备荚膜糖的细菌菌种购自中国药品生物制品检定所医学细菌保藏管理 中心(CMCC)或美国标准生物收藏中心(ATCC)。 本发明提供制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型 (群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法。在本发明优选的一个实施方案 中，两个或两个以上血清型(群)荚膜糖依据重量比合并后，对其进行匀化处理，益于不同 血清型(群)荚膜糖与蛋白载体的结合较为均衡。优选的匀化处理方法是超声处理；优选 的参数是25 75Hz 2 10分钟。 本发明提供制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型 (群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法。在本发明优选的一个实施方案 中，对2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合 体抗原进行脱毒处理，益于降低多价细菌荚膜糖结合疫苗在大量增加荚膜糖抗原价数后的 副反应。脱毒剂优选自甲醛、戊二醛、过氧化氢，更优选戊二醛。 因此，本发明提供制备含有2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血 清型(群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法。所述方法进一步包括以下 步骤 (a)从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型 (群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖。其中，所述细菌包括但不限于肺炎球菌、脑膜炎 球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌、葡萄球菌、B群链球菌等具有荚膜糖的细菌；
(b)将步骤(a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群) 的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖。其中，所述荚膜糖合并后进 一步经匀化处理； (c)将步骤(b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学结合，制 成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗 原； (d)将步骤(c)的产物脱毒处理并纯化制成2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合 体抗原或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原； (e)将步骤(d)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型 (群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。 在本发明提供的肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗中，疫苗剂量按照药学 领域一般技术人员所公知的技术标准来确定。例如，在确定剂量时应考虑到抗原特性、佐剂
16性质、接种者的年龄、疫苗接种途径等诸因素。在本发明优选的实施方案中，成品疫苗优选 的每一血清型(群)荚膜糖剂量为0. 1 50 g，更优选的每一血清型(群)荚膜糖剂量为 1 25 i！ g，最优选的每一血清型(群)荚膜糖剂量为2 10 i！ g。 在本发明优选的实施方案中，肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗还可包含 本领域常用的佐剂。优选的佐剂有铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素B亚单位(CTB)、皁角素 Q21、类脂体、单磷酸类脂A(MPL)、 MF59、大肠杆菌不耐热毒素(LT)，更优选的佐剂是铝佐 剂，如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。 在本发明提供的肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗中，疫苗的剂型和配伍 按照药学领域一般技术人员所公知的技术标准来确定。在本发明优选的实施方案中，疫苗 剂型优选是液体剂型、冻干剂型、丸剂、片剂、胶囊剂型，更优选是液体剂型或冻干剂型，最 优选是液体剂型。 在本发明优选的实施方案中，肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗可以是无 防腐剂疫苗。在本发明优选的另一实施方案中，联合疫苗包含防腐剂，优选的防腐剂是硫柳 汞、2_苯氧乙醇、苯甲醇。 本发明提供的肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗，接种途径包括皮内注 射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，还包括经鼻腔、口腔、肛门、阴道、黏膜途径给药。
本发明的肺炎球菌结合疫苗及细菌荚膜糖结合疫苗制备方法与现有肺炎球菌结 合疫苗及其制备方法相比较，包括与当前已上市的肺炎球菌结合疫苗例如PCV7和即将上 市的PCV13及其制备方法的比较，进一步与已公开的专利文本所述的肺炎球菌结合疫苗及 制备方法例如中国专利200680017776. 8、00807773. 8、92100700. 0、00807759. 2、02827993. X、01815748. 3、200680052954. 0、200680053139. 6、200610054832. 7的比较，更进一步与中 国专利03141407. 9的比较，其区别及有益效果在于 (1)本发明疫苗所含抗原结构不同。现有肺炎球菌结合疫苗在技术上均是将来源 于每一个血清型的荚膜糖独立与蛋白载体经化学结合后，形成单价的血清型荚膜糖-蛋白 结合体，再将各个单价血清型荚膜糖-蛋白结合体混合，进而配制成为含多血清型荚膜糖 的肺炎球菌结合疫苗。因此，现有肺炎球菌结合疫苗中所含各个血清型荚膜糖抗原以单价 荚膜糖-蛋白结合体独立存在，各个血清型荚膜糖彼此并无结构上的链接。本发明疫苗是 将不同血清型的荚膜糖按两个或两个以上的血清型荚膜糖预先合并后再与蛋白载体经化 学键结合后，形成2价血清型荚膜糖_蛋白结合体或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，再将 各个2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体混合，进而配 制成为含多血清型荚膜糖的肺炎球菌结合疫苗。因此，本发明疫苗中所含各个血清型荚膜 糖抗原以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体存在，并 且，2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和多价血清型荚膜糖_蛋白结合体中各个血清型荚膜糖 彼此有结构上的链接。 (2)本发明疫苗所含抗原分子量更大。本发明疫苗所含的2价血清型荚膜糖_蛋 白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，由于依据与蛋白载体的化学键结合2价 或多价荚膜糖在结构上相互间形成链接，荚膜糖抗原分子量间接被增大。因此，本发明疫苗 较单价血清型荚膜糖-蛋白结合体有更好的免疫原性。 (3)本发明疫苗减少蛋白载体免疫竞争。本发明疫苗所含抗原是2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，不同血清型荚膜糖依据与蛋白载 体的化学键结合在结构上相互间形成链接。因此，较单价血清型荚膜糖-蛋白结合体而言， 本发明疫苗所含的2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体 抗原中的蛋白载体总量减少，导致与荚膜糖应答的B细胞较与蛋白载体应答的B细胞占优 势，并竞争更多Th细胞参与到B细胞应答荚膜糖的过程中，从而减少蛋白载体诱导的表位 抑制效应。 (4)本发明疫苗所含抗原更稳定。本发明疫苗所含的2价血清型荚膜糖_蛋白结 合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，由于依据与蛋白载体的化学键结合2价血清 型荚膜糖或多价血清型荚膜糖在结构上相互间形成链接，因此，本发明疫苗所含荚膜糖抗 原较现有技术的单价荚膜糖更具稳定性。 (5)本发明提供了一种制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多 价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以下步 骤 (a)从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型 (群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖； (b)将步骤(a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群) 的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖； (c)将步骤(b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合并 纯化，制成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白 结合体抗原； (d)将步骤(c)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型 (群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。 (6)本发明进一步提供一种制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/ 或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以 下步骤 (a)从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型 (群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖。其中，所述细菌包括但不限于肺炎球菌、脑膜炎 球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌、葡萄球菌、B群链球菌等具有荚膜糖的细菌；
(b)将步骤(a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群) 的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖。其中，所述荚膜糖合并后进 一步经匀化处理； (c)将步骤(b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，制 成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗 原； (d)将步骤(c)的产物脱毒处理并纯化制成2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合 体抗原或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原； (e)将步骤(d)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型 (群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。 本发明通过如下实施例，但非限制，举例进一步描述本发明的核心内容，所述实施例阐述本发明的概念和几个优选的实施方案。本发明的其它实施例在不背离本发明的核心 的前提下为本领域技术人员所预见。
具体实施例方式
本发明可通过如下实施例进一步了解，所述实施例选择了几个优选实施方案，仅 为了更好展示本发明，而非对发明内容进行限制。
实施例 实施例1肺炎球菌发酵培养及荚膜多糖的制备 将低温保藏的肺炎球菌冻干菌种启开，用生理氯化钠溶液复溶后，接种至5 10%羊血琼脂斜面培养基，置5 8% C02环境中，于35 37t:培养16 24小时。转种至 肺炎球菌液体基础培养基，于35 37t:培养10 18小时。继续转种至肺炎球菌液体基础 培养基进行增菌培养，于35 37t:培养10 18小时。按5 10%接种量将增菌后的肺炎 球菌液体培养物接种至已加入液体基础培养基的发酵罐内，搅拌、通气培养，于35 37°C 培养8 12小时，pH控制在6. 0 7. 4之间。发酵培养期间监测细菌浓度变化，镜检培养 物纯度及菌体形态特征。发酵培养结束时，按发酵罐内培养基的量加入终浓度为0.05 0. 20%去氧胆酸钠裂解菌体细胞，搅拌20 60分钟，终止发酵培养。 用连续流离心机离心去除菌体细胞碎片，收集上清液。对上清液进行超滤浓縮，超 滤膜规格选用50 IOOKD，浓縮倍数至原体积的1/5 1/20。置超滤后的浓縮液于生理氯 化钠溶液中进行透析。向透析后的浓縮液加入乙酸钠至终浓度3 10%，搅拌至充分溶解， pH调至4. 8 6. 4。继续于2 8t:环境中缓慢加入预先冷却的乙醇至终浓度15 60%， 搅拌15 45分钟，经12， 000 16， 000g、2 8"超速离心，收集上清液。于上清液中继续 加入乙酸钠至终浓度5 15X，搅拌至充分溶解，pH维持4. 8 6. 4。继续于2 8"环境 中缓慢加入预先冷却的乙醇至终浓度30 80%，搅拌15 45分钟，经2， 200 2， 800g、 2 『C离心，收集粗多糖沉淀物。抽真空，_201:储存，待进一步纯化。
将粗多糖加入0. 3 0. 6M的乙酸钠溶液中，pH调至6. 5 7. 2，于2 8T环境 中搅拌至完全溶解。再加入冷酚至终浓度65 75%进行抽提，经14， 000 18， 000超速离 心，收集上清液。重复冷酚抽提步骤2 4次。收集的上清液于2 『C经透析，除去残留 酚，透析液为注射用水。于2 『C环境中缓慢加入预先冷却的乙醇至终浓度40 90%， 搅拌15 45分钟，经2， 200 2， 800g、2 8t:离心，收集多糖沉淀物。多糖沉淀物经无水 乙醇和丙酮浸泡、洗涤各2 4次，干燥后用注射用水溶解，再经0. 22 ii m除菌过滤得到纯 化多糖，以液体或冻干形式储存于-2(TC以下。按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫 苗制造及检定规程(WHO TechnicalR印ort Series, No. 927,2005)规定方法和标准对纯化 多糖进行检定。 按照上述方法分别制备肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖。
实施例2肺炎球菌荚膜寡糖的制备 将纯化多糖溶解于0. 2 1. 0M乙酸溶液中至终浓度1 4mg/ml，浸入70 IO(TC 油浴或水浴中水解6 40小时。水解后将pH调至7. 0，于2 8"透析。再经S印harose 4FF层析柱纯化，用15mM NaCl液洗脱，收集寡糖。通过0. 22 y m除菌过滤得到纯化寡糖，以液体或冻干形式储存于-20°C以下。按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及 检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)规定方法和标准对纯化寡糖进行 检定。 按照上述方法分别制备肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、
12F、 14、 15B、 17F、 18C、 19A、 19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖。 实施例3脑膜炎球菌荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖的制备 按照中国专利200710007045. 1方法制备A群、C群、W135群、Y群脑膜炎球菌荚膜
多糖和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖。 再按照本发明实施例2方法制备A群、C群、W135群、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖和 b型流感嗜血杆菌荚膜寡糖。 按世界卫生组织正式颁布的脑膜炎球菌多糖疫苗制造及检定规程(WHOTechnical R印ort Series, No. 658， 1980)和b型流感嗜血杆菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 897， 2000)规定方法和标准对纯化多糖和寡糖进行检定。
实施例4蛋白载体_白喉类毒素(DT)的制备 将低温保存的白喉杆菌冻干菌种启开，用生理氯化钠溶液复苏，接种至血琼脂斜 面培养基，于33 36t:培养16 20小时。转种至改良林氏肉汤培养基，于33 36。C培 养16 20小时。再转种至改良林氏肉汤培养基，于33 36t:培养16 20小时。继续转 种至含改良林氏肉汤培养基的菌种瓶内进行增菌培养，于33 36t:培养36 72小时。将 菌种瓶内培养物转种至含改良林氏肉汤培养基的发酵罐内，在通气、搅拌、PH7. 0 8. 5条 件下，于33 36t:培养40 56小时。发酵完毕，加入终浓度O. 1 0. 5%的甲醛灭菌处 理，经离心收集上清液。上清液经0. 22 ii m滤器除菌过滤，再经30 50KD膜超滤浓縮。分 别加入NaHC03至终浓度0. 45 0. 55%、活性碳至终浓度0. 72 0. 78 % 、 (NH4) 2S04至终浓 度28.0 30.0%，搅拌30分钟，置室温静置12 18小时。离心收集上清液。于收集的上 清液中加入(NH4)2S04至终浓度42. 0 45. 0%，搅拌30分钟，置室温静置4 8小时。离 心收集沉淀并溶于0. 1 % NaHC03溶液中。于2 8°C 、透析60 72小时后，再经0. 22 y m 滤器除菌过滤。除菌过滤后的液体加入赖氨酸至终浓度1. 0 2. 0%，再加入甲醛至终浓度 0. 4 0. 6%， pH调至6. 8 7. 0，置37 40。C脱毒42 48天。脱毒后的DT原液按《中 华人民共和国药典》(2005年版)规定项目和方法检定，检定合格后原液置2 8t:保存备 用。 实施例5荚膜糖-蛋白结合疫苗的制备 (1)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(24价多糖-蛋白结合体)
将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖用注射用水稀释并按各型多糖1 : 1 5 (w/ w)重量比合并，合并后的多糖浓度为2.0 10. Omg/型多糖/ml。超声匀化处理25 75Hz 2 10分钟。加入溴化氰活化多糖至终浓度1. 0 4. Omg/mg总多糖，用NaOH调节pH并维持 pH9. 5 11. 5，于20 26。C搅拌30 60分钟。再加入己二酰肼至终浓度12. 0 18. Omg/ ml，调节并维持pH8. 0 10. O，保持15 30分钟。于20 26。C搅拌30 60分钟，再置 在2 『C搅拌18 24小时，形成多糖_己二酰肼衍生物。将多糖_己二酰肼衍生物于 2 8。C透析72 96小时，再经0. 45 ii m滤器除菌过滤。将DT稀释至1. 0 4. Omg/ml，按
20多糖_己二酰肼衍生物DT为1 : 0. 5 2比例(v/v)将DT加入多糖-己二酰肼衍生物 中，调节并维持pH5. 0 6. 0。加入碳二亚胺至终浓度20 30mg/ml，调节并维持pH5. 0 6. O，维持60 90分钟后，调节并维持p朋.5 7. 5。加入戊二醛至终浓度0. 05 0. 15% 脱毒处理，维持4 6小时。置2 8"透析72 120小时，经100 300KD超滤膜超滤浓 縮。用S印harose 4FF层析柱纯化多糖_DT结合物，收集多糖_DT结合物，再经0. 22 y m滤 器除菌过滤，获得24价肺炎球菌多糖-DT结合体原液。用注射用水稀释24价肺炎球菌多 糖-DT结合体原液、磷酸铝、氯化钠、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量分别为结合DT 的各血清型多糖2 lOii g/ml、磷酸铝1. 0 1. 5mg/ml、氯化钠7. 5 9. 5mg/ml、2_苯氧 乙醇5. 0 6. Omg/ml，pH调至5. 8 7. 2。按吸出量X). 5ml分装西林瓶并封口 。按世界 卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)规定方法和标准进行检定，检定合格后为肺炎球菌多糖结合疫苗。
(2)肺炎球菌24价寡糖结合疫苗的制备(24价寡糖-蛋白结合体)
将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖用注射用水稀释并按各型寡糖1 : 1 5 (w/ w)重量比合并，合并后的寡糖浓度为2. 0 10. Omg/型寡糖/ml。加入溴化氰活化寡糖至 终浓度1. 0 4. Omg/mg总寡糖，用NaOH调节pH并维持pH9. 5 11. 5，于20 26。C搅拌 30 60分钟。再加入己二酰肼至终浓度12. 0 18. Omg/ml，调节并维持pH8. 0 10. 0， 保持15 30分钟。于20 26。C搅拌30 60分钟，再置在2 8。C搅拌18 24小时， 形成寡糖_己二酰肼衍生物。将寡糖_己二酰肼衍生物于2 『C透析72 96小时，再 经0. 45 ii m滤器除菌过滤。将DT稀释至1. 0 4. Omg/ml，按寡糖-己二酰肼衍生物DT 为1 : 0. 5 2比例(v/v)将DT加入寡糖-己二酰肼衍生物中，调节并维持pH5. 0 6. 0。 加入碳二亚胺至终浓度20 30mg/ml，调节并维持pH5. 0 6. 0，维持60 90分钟后，调 节并维持P朋.5 7. 5。置2 8t:透析72 120小时，经100 300KD超滤膜超滤浓 縮。用S印harose 4FF层析柱纯化寡糖-DT结合物，收集多糖-DT结合物，再经0. 22 y m滤 器除菌过滤，获得24价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液。用注射用水稀释24价肺炎球菌寡 糖-DT结合体原液、磷酸铝、氯化钠、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量分别为结合DT 的各血清型寡糖2 10ii g/ml、磷酸铝1. 0 1. 5mg/ml、氯化钠7. 5 9. 5mg/ml、2-苯氧 乙醇5. 0 6. Omg/ml，pH调至5. 8 7. 2。按吸出量X). 5ml分装西林瓶并封口 。按世界 卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)规定方法和标准进行检定，检定合格后为肺炎球菌寡糖结合疫苗。
本实施例(1)方法与本实施例(2)方法不同之处在于，后者没有超声匀化处理和 戊二醛脱毒处理两个步骤。 (3)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(12价多糖-蛋白结合体+12价多糖-蛋 白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖分为2组；第1组包括1、2、3、4、5、6B、7F、9V、 14、 18C、 19F、23F，第2组包括6A、8、9N、IOA、IIA、 12F、 15B、 17F、 19A、20、22F、33F。分别用注 射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型多糖的12价肺炎球菌 多糖-DT结合体原液，再将此2组不同血清型多糖的12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (4)肺炎球菌24价寡糖结合疫苗的制备(12价寡糖-蛋白结合体+12价寡糖-蛋 白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖分为2组；第1组包括1、2、3、4、6A、6B、7F、 10A、14、18C、20、23F，第2组包括5、8、9N、9V、IIA、 12F、 15B、 17F、 19A、 19F、22F、33F。分别用 注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型寡糖的12价肺炎球 菌寡糖-DT结合体原液，再将此2组不同血清型寡糖的12价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液 按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (5)肺炎球菌24价荚膜糖结合疫苗的制备(12价多糖-蛋白结合体+12价寡 糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜糖分为2组；第1组包括1、2、3、4、5、7F、IOA、IIA、 14、15B、20、23F多糖，第2组包括6A、6B、8、9N、9V、12F、17F、18C、19A、19F、22F、33F寡糖。分
别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1)方法制备一组不同血清型多糖的 12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和另一组不同血清型寡糖的12价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液，再将此2组不同血清型多糖和寡糖的12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和12 价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(6)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(8价多糖-蛋白结合体+8价多糖-蛋白 结合体+8价多糖_蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖分为3组；第1组包括1、3、4、7F、9V、 14、 18C、 19F，第2组包括6A、8、9N、12F、15B、17F、19A、22F，第3组包括2、5、6B、IOA、 11A、20、23F、
33F。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备3组不同血清型多糖的 8价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此3组不同血清型多糖的8价肺炎球菌多糖-DT结 合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (7)肺炎球菌24价寡糖结合疫苗的制备(8价寡糖-蛋白结合体+8价寡糖-蛋白 结合体+8价寡糖_蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖分为3组；第1组包括1、3、4、7F、9N、9V、 18C、 20，第2组包括2、6A、6B、12F、14、15B、17F、22F，第3组包括5、8、IOA、IIA、 19A、 19F、23F、
33F。分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备3组不同血清型寡糖的 8价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此3组不同血清型寡糖的8价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (8)肺炎球菌24价荚膜糖结合疫苗的制备(8价多糖-蛋白结合体+8价寡糖-蛋 白结合体+8价多糖_蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜糖分为3组；第1组包括1、3、4、7F、IOA、IIA、 14、20 多糖，第2组包括6A、6B、9N、9V、18C、19A、19F、23F寡糖，第3组包括2、5、8、 12F、 15B、 17F、
2222F、33F多糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1)方法制备2组不 同血清型多糖的8价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和另一组不同血清型寡糖的8价肺炎球 菌寡糖-DT结合体原液，再将此3组不同血清型多糖和寡糖的8价肺炎球菌多糖-DT结合 体原液和8价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检 定。 (9)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(6价多糖-蛋白结合体+6价多糖-蛋白 结合体+6价多糖_蛋白结合体+6价多糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖分为4组；第1组包括1、3、4、7F、 18C、 19F，第 2组包括6A、8、9N、 12F、 17F、 19A，第3组包括2、9V、 IIA、 14、23F、33F，第4组包括5、6B、 IOA、 15B、20、22F。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备4组不同血清 型多糖的6价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型多糖的6价肺炎球菌 多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(10)肺炎球菌24价寡糖结合疫苗的制备(6价寡糖-蛋白结合体+6价寡糖-蛋 白结合体+6价寡糖_蛋白结合体+6价寡糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖分为4组；第1组包括3、4、7F、9N、 12F、 18C，第 2组包括5、6A、8、17F、19A、19F，第3组包括2、9V、 IOA、 11A、22F、23F，第4组包括1、6B、14、 15B、20、33F。分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备4组不同血清 型多糖的6价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型寡糖的6价肺炎球菌 寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(11)肺炎球菌24价荚膜糖结合疫苗的制备(6价多糖-蛋白结合体+6价寡糖-蛋 白结合体+6价多糖_蛋白结合体+6价寡糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜糖分为4组；第1组包括1、3、4、 11A、20、33F多糖， 第2组包括6A、6B、 18C、 19A、 19F、23F寡糖，第3组包括2、5、8、 15B、 17F、22F多糖，第4组包 括7F、9N、9V、10A、12F、14寡糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1) 方法制备2组不同血清型多糖的6价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和另2组不同血清型寡 糖的6价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型多糖和寡糖的6价肺炎球 菌多糖-DT结合体原液和6价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫 苗成品并进行检定。 (12)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(12价多糖-蛋白结合体+6价多糖-蛋 白结合体+4价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖分为4组；第1组包括1、2、3、4、6A、6B、7F、 10A、14、18C、20、23F，第2组包括IIA、 12F、 15B、 17F、22F、33F，第3组包括5、8、9N、9V，第4 组包括19A、19F。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备4组不同血 清型多糖的12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、6价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、4价肺 炎球菌多糖-DT结合体原液和2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型
23多糖的12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、6价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、4价肺炎球 菌多糖-DT结合体原液和2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫 苗成品并进行检定。 (13)肺炎球菌14价多糖结合疫苗的制备(14价多糖-蛋白结合体)将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜多糖
用注射用水稀释合并，按本实施例(1)方法制备14价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将
此14价肺炎球菌多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 本实施例(1)方法与本实施例(12)方法不同之处在于，后者成品疫苗配制时不添
加2-苯氧乙醇。因此本实施例(12)成品疫苗中不含任何防腐剂。 (14)肺炎球菌14价寡糖结合疫苗的制备(14价寡糖-蛋白结合体)将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡糖
用注射用水稀释合并，按本实施例(1)方法制备14价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将
此14价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 本实施例(1)方法与本实施例(13)方法不同之处在于，后者成品疫苗配制时不添
加2-苯氧乙醇。因此本实施例(13)成品疫苗中不含任何防腐剂。 (15)肺炎球菌14价多糖结合疫苗的制备(7价多糖-蛋白结合体+7价多糖-蛋 白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜多糖 分为2组；第1组包括1、2、3、4、5、9V、23F多糖，第2组包括6A、6B、7F、 14、 18C、 19A、 19F多
糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型多糖的7 价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此2组不同血清型多糖的7价肺炎球菌多糖-DT结 合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (16)肺炎球菌14价寡糖结合疫苗的制备(7价寡糖-蛋白结合体+7价寡糖-蛋 白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡糖 分为2组；第1组包括4、5、7F、9V、14、19A、19F寡糖，第2组包括1、2、3、6A、6B、 18C、23F寡 糖。分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型寡糖的7 价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此2组不同血清型寡糖的7价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (17)肺炎球菌14价荚膜糖结合疫苗的制备(7价多糖-蛋白结合体+7价寡糖-蛋 白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜糖分 为2组；第1组包括1、2、3、4、7F、9V、14多糖，第2组包括5、6A、6B、 18C、 19A、 19F、23F寡糖。 分别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1)方法制备一组不同血清型多糖 的7价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和另一组不同血清型寡糖的7价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液，再将此2组不同血清型多糖和寡糖的7价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和7价 肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(18)肺炎球菌14价多糖结合疫苗的制备(4价多糖-蛋白结合体+4价多糖-蛋 白结合体+4价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋白结合体)
将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜多糖 分为4组；第1组包括1、7F、9V、18C多糖，第2组包括14、 19A、 19F、23F多糖，第3组包括2、 3、4、5多糖，第4组包括6A、6B多糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1) 方法制备3组不同血清型多糖的4价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和1组不同血清型多糖 的2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型多糖的4价肺炎球菌多糖-DT 结合体原液和2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进 行检定。 (19)肺炎球菌14价寡糖结合疫苗的制备(4价寡糖-蛋白结合体+4价寡糖-蛋 白结合体+4价寡糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡糖 分为4组；第1组包括1、3、5、9V寡糖，第2组包括2、7F、18C、23F寡糖，第3组包括4、6A、 6B、 14寡糖，第4组包括19A、 19F寡糖。分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1) 方法制备3组不同血清型寡糖的4价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液和1组不同血清型寡糖 的2价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型寡糖的4价肺炎球菌寡糖-DT 结合体原液和2价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进 行检定。 (20)肺炎球菌14价荚膜糖结合疫苗的制备(4价多糖-蛋白结合体+4价寡糖-蛋 白结合体+4价多糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜糖分 为4组；第1组包括2、5、7F、23F多糖，第2组包括4、6A、6B、18C寡糖，第3组包括1、3、9V、 14多糖，第4组包括19A、19F寡糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例 (1)方法制备2组不同血清型多糖的4价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、1组不同血清型寡 糖的4价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液和1组不同血清型寡糖的2价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液，再将此4组不同血清型多糖的4价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、4价肺炎球菌 寡糖-DT结合体原液和2价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗 成品并进行检定。 (21)肺炎球菌14价多糖结合疫苗的制备(2价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋 白结合体+2价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋白结合体+2价多 糖_蛋白结合体+2价多糖_蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜多糖 分为7组；第1组包括1、9V多糖，第2组包括7F、 18C多糖，第3组包括14、23F多糖，第4 组包括19A、19F多糖，第5组包括2、3多糖，第6组包括4、5多糖，第7组包括6A、6B多糖。 分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备7组不同血清型多糖的2价 肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此7组不同血清型多糖的2价肺炎球菌多糖-DT结合 体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (22)肺炎球菌14价寡糖结合疫苗的制备(2价寡糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋 白结合体+2价寡糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体+2价寡 糖_蛋白结合体+2价寡糖_蛋白结合体)将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡糖分为7组；第1组包括1、3寡糖，第2组包括5、9V寡糖，第3组包括2、23F寡糖，第4组包 括7F、 18C寡糖，第5组包括6A、6B寡糖，第6组包括4、 14寡糖，第7组包括19A、 19F寡糖。 分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备7组不同血清型寡糖的2价 肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此7组不同血清型寡糖的2价肺炎球菌寡糖-DT结合 体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (23)肺炎球菌14价荚膜糖结合疫苗的制备(2价多糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋 白结合体+2价多糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体2价多糖-蛋白结合体+2价寡 糖_蛋白结合体+2价多糖_蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜糖分 为7组；第1组包括2、23F多糖，第2组包括6A、6B寡糖，第3组包括5、7F多糖，第4组包 括4、 18C寡糖，第5组包括9V、 14多糖，第6组包括19A、 19F寡糖，第7组包括1、3多糖。分 别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1)方法制备4组不同血清型多糖的 2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和3组不同血清型寡糖的2价肺炎球菌寡糖-DT结合体 原液，再将此7组不同血清型多糖的2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和2价肺炎球菌寡 糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(24)肺炎脑膜炎联合疫苗的制备(15价多糖蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、4、5、6A、6B、9V、 14、 18C、 19A、 19F、23F纯化荚膜多糖和脑膜 炎球菌A群、C群、W135群、Y群纯化荚膜多糖用注射用水稀释合并，按本实施例(1)方法制 备15价多糖-DT结合体原液，再将此15价多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成 疫苗成品。按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)和脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO BS 06.2041， 2006 ;WH0 TechnicalR印ort Series, No. 924， 2004)规定方法和标准进行检定。
(25)肺炎脑膜炎Hib联合疫苗的制备(17价寡糖蛋白结合体)
将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡 糖、脑膜炎球菌A群纯化荚膜寡糖、脑膜炎球菌C群纯化荚膜寡糖、b型流感嗜血杆菌纯化 荚膜寡糖用注射用水稀释合并，按本实施例(1)方法制备17价寡糖-DT结合体原液，再将 此17价寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品。按世界卫生组织正式 颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005) 和脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO BS 06. 2041,2006 ;WHO Technical R印ort Series, No. 924,2004)及b型流感嗜血杆菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 897,2000)规定方法和标准进行检定。 (26)肺炎脑膜炎Hib联合疫苗的制备(7价寡糖-蛋白结合体+7价寡糖-蛋白结 合体+5价寡糖-蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡 糖、脑膜炎球菌A群纯化荚膜寡糖、脑膜炎球菌C群纯化荚膜寡糖、脑膜炎球菌W135群纯化 荚膜寡糖、脑膜炎球菌Y群纯化荚膜寡糖、b型流感嗜血杆菌纯化荚膜寡糖分为3组；第1 组包括4、5、7F、9V、14、19A、19F寡糖，第2组包括1、2、3、6A、6B、 18C、23F寡糖，第3组包括 脑膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群寡糖和b型流感嗜血杆菌寡糖。分别用注射用水稀释 合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型寡糖的7价肺炎球菌寡糖-DT结
26合体原液和1组不同血型(群)的5价脑膜炎Hib寡糖-DT结合体原液，再将此3组不同 血清型寡糖的7价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液和5价脑膜炎Hib寡糖-DT结合体原液按 本实施例(1)方法配制成疫苗成品。按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及 检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)和脑膜炎球菌结合疫苗制造及检 定规程(WHO BS 06.2041,2006 ;WHO TechnicalR印ort Series, No. 924， 2004)及b型流感 嗜血杆菌结合疫苗制造及检定规程(WHOTechnical R印ort Series, No. 897,2000)规定方 法和标准进行检定。 实施例6结合疫苗特异性毒性检查 对实施例5所制备的26种疫苗取样分别等量合并成26份样品，每份样品选用体 重250 350g豚鼠4只，每只腹侧皮下注射样品2. 5ml，观察30天，记录体重变化。结果显 示所有样品注射局部无坏死、无脱皮、无脱毛，无晚期麻痹症状，每只豚鼠体重比注射前均 有增加。说明本发明制备的26种结合疫苗所使用的白喉类毒素载体经过结合工艺处理后 没有发生白喉毒素特异性毒性反应，也没有出现毒性逆转现象。
实施例7结合疫苗安全性检查 对实施例5所制备的26种疫苗取样，每份样品分别选用体重18 22g小鼠5只 和体重250 350g豚鼠2只，每只小鼠腹腔注射样品0. 5ml，每只豚鼠腹腔注射5. 0ml，观 察7天，记录体重变化。结果显示观察期内所有小鼠、豚鼠均键存，且无异常反应，到期时每 只小鼠、豚鼠体重比注射前均有增加。说明本发明制备的26种疫苗中没有污染外源性毒性 物质，也没有存在意外的不安全因子。
实施例8结合疫苗免疫原性测定 取实施例5制备的26种疫苗、肺炎球菌24个血清型多糖、脑膜炎球菌各血清群多 糖、Hib多糖和生理氯化钠溶液腹腔免疫体重12 14g的NIH小鼠，每一样品按照0、14、 28天程序免疫10只小鼠3针。结合疫苗组免疫剂量为所含各血清型(群)荚膜糖2 10 ii g/0. 5ml/次，多糖组免疫剂量与疫苗组所含各血清型(群)荚膜糖等量。初免后第35 天采血，分离血清。用ELISA方法测定抗体GMT值。将各血清型(群)多糖包被于96孔酶 标板，置2 『C过夜。封闭后，加入系列稀释的待测血清样品，37t:反应45分钟。再加入 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG于37t:反应45分钟，最后加入底物四甲基联苯胺，于暗 处显色15分钟，用终止液终止反应。在酶标仪上测定，计算血清抗体GMT。结果显示疫苗 所含各血清型(群)荚膜糖较单独多糖GMT有显著性增长。其中，肺炎球菌各血清型多糖 GMT为23 75，肺炎球菌结合疫苗中所含各血清型荚膜糖GMT为1864 8053。表1、表2 列举了其中几个疫苗免疫原性GMT测定数据。 综上所述，说明本发明制备的由2价荚膜糖_蛋白结合体和/或多价荚膜糖_蛋
白结合体组成的肺炎球菌荚膜糖结合疫苗及其与脑膜炎球菌、Hib组成的细菌联合结合疫
苗具有良好的安全性和免疫原性。
表l.肺炎球菌结合疫苗免疫原性测定结果
疫苗 代码
小鼠血清抗肺炎球菌各型荚膜糖抗体滴度(lgG GM'1')
4
6A 6B 7F
8
9N 9V 1 OA11A 12F 14 15B 17F 18C 19A 19F 20 22F 23F 3 3 F
(3) 3446 3046 5246 2735 4843 2054 2213 6845 2532 3786 4218 7263 3944 5446 5760 2256 5064 2484 4432 3049 6325 3354 2413 3286 (11) 2324 2430 6672 2014 5772 2588 簡 5327 3249 4012 3506 6337 4387 5962 7081 3562 3855 2916 3687 351S 5623 2996 2016 2424 (18) 4076 2683 4322 3247 4262 2857 2443 5126 3264 5735 2785 3775 3258 2576
(22) 3182 3514 5074 2695 4608 2283 2739 5724
肺炎 多糖
35
314533 57
27 72
44
郁
52 48
65
6057 2017 4273 3942 2947
5462552446263859663429 32
表2.细菌荚膜糖蛋白结合疫苗免疫原性测定结果
疫苗 代码
小鼠血淸抗细菌荚膜糖抗体滴度(lgGGMT)
6A
6B
7F
9V
14
18C
19A
19F
23F
A
C
Hib
(25)
细菌 多糖
2071 1946 3854 3538 3157 2173 2086 2642 2904 4536 3187 3521 4017 2653 1742 2037 1264
35 31 45 33 57 36 27 -72 48 55 26 38 59 29 25 21 1权利要求
一种肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原包括2价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体，所述2价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体是指两个不同的血清型荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，蛋白载体通过化学键将此两个不同血清型荚膜糖链接在一起，两个不同的血清型荚膜糖依据与蛋白载体的化学键结合在结构上形成链接；所述多价血清型荚膜糖-蛋白结合体是指多个不同的血清型荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，蛋白载体通过化学键将此多个不同的血清型荚膜糖链接在一起，多个不同血清型荚膜糖依据与蛋白载体的化学键结合在结构上形成链接。
2. 根据权利要求1所述的肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原包括一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体。
3. 根据权利要求2所述的肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体是指两个或两个以上的荚膜糖_蛋白结合体分别含有相等价数的血清型荚膜糖，并且其价数均介于2 45之间。
4. 根据权利要求2所述的肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体是指两个或两个以上的荚膜糖_蛋白结合体分别含有不相等价数的血清型荚膜糖，并且其价数均介于2 45之间。
5. 根据权利要求2所述的肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体是指两个以上的荚膜糖_蛋白结合体分别含有相等和不相等价数的血清型荚膜糖，并且其价数均介于2 45之间。
6. —种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些不同细菌血清型(群)的荚膜糖与蛋白载体进行化学结合，以2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。
7. —种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌A群、C群荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些不同细菌血清型(群)的荚膜糖与蛋白载体进行化学结合，以2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。
8. —种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些肺炎球菌不同血清型的荚膜糖以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中；这些脑膜炎球菌不同血清群的荚膜糖以4价血清群荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中；所述b型流感嗜血杆菌的荚膜糖以单价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。
9. 一种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌A群、C群荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖；这些肺炎球菌不同血清型的荚膜糖以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中；这些脑膜炎球菌不同血清群的荚膜糖以2价血清群荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中；所述b型流感嗜血杆菌的荚膜糖以单价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。
10. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型荚膜糖选自肺炎球菌全部血清型菌株制备的荚膜糖。
11. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型荚膜糖选自肺炎球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株制备的荚膜糖。
12. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型荚膜糖选自肺炎球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型菌株制备的荚膜糖。
13. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型荚膜糖选自流行病学流行优势血清型菌株制备的荚膜糖。
14. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述蛋白载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素无毒变异体、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌表面粘附素A、肺炎球菌溶血素、流感嗜血杆菌D蛋白、百日咳毒素、霍乱毒素、结核菌素纯蛋白衍生物、铜绿假单胞菌外毒素A、匙孔血蓝蛋白。
15. 根据权利要求1-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述蛋白载体为来源于肺炎球菌的蛋白PspA、 PsaA、 Ply合并而成的肺炎球菌蛋白复合物。
16. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，成品疫苗每一血清型(群)荚膜糖剂量为0.1 50iig。
17. 根据权利要求1-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，成品疫苗包含佐剂。
18. 根据权利要求17所述的结合疫苗，其特征在于，所述佐剂选自铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素B亚单位、皁角素Q21、类脂体、单磷酸类脂A、MF59、大肠杆菌不耐热毒素。
19. 根据权利要求18所述的结合疫苗，其特征在于，所述的铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。
20. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，成品疫苗不含任何防腐剂。
21. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，成品疫苗包含选自硫柳汞、2-苯氧乙醇、苯甲醇的防腐剂。
22. 根据权利要求1-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体中的荚膜糖是荚膜多糖和/或荚膜寡糖；所述的多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体中的荚膜糖是荚膜多糖和/或荚膜寡糖。
23. —种制备含有2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤a) 从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型(群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖；b) 将步骤a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群)的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖；c) 将步骤b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合并纯化，制成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原；d)将步骤c)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。
24. —种制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤a) 从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型(群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖；b) 将步骤a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群)的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖，其中，所述荚膜糖合并后进一步经匀化处理；c) 将步骤b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，制成2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原；d) 将步骤c)的产物脱毒处理并纯化制成2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原；e) 将步骤d)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。
25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中，所述细菌选自肺炎球菌、脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌、葡萄球菌、B群链球菌。
26. 根据权利要求23或24所述方法，不同血清型(群)荚膜糖相互间合并重量比为1 : 0. 05 20 (w/w)。
27. 根据权利要求23或24所述的方法，其中所述的2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体中的荚膜糖是荚膜多糖和/或荚膜寡糖；所述的多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体中的荚膜糖是荚膜多糖和/或荚膜寡糖。
全文摘要
本发明涉及一种含有2价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体的新型肺炎球菌结合疫苗及其制备方法。所述2价血清型荚膜糖-蛋白结合体是指两个不同血清型荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，这两个不同血清型荚膜糖依据与蛋白载体的化学键结合在结构上形成链接。所述多价血清型荚膜糖-蛋白结合体是指多个不同血清型荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，这些多个不同血清型荚膜糖依据与蛋白载体的化学键结合在结构上形成链接。另外，本发明还提供了制备细菌荚膜糖-蛋白结合疫苗的方法。
文档编号A61K39/112GK101785857SQ20101012940
公开日2010年7月28日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者郑玉清 申请人:郑玉清
技术领域：
本发明涉及一种新的肺炎球菌结合疫苗。具体而言，本发明涉及一种肺炎球菌多
个血清型荚膜糖与蛋白载体结合的新的肺炎球菌结合疫苗，来源于不同血清型的荚膜糖通
过与蛋白载体的化学结合后，以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。本发明还涉及所述的新的肺炎球菌结合疫苗的制备方法，以及新的细菌荚膜糖蛋白结合疫苗的制备方法。
背景技术：
肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)引发的疾病是全球儿童尤其是发展中国家儿童发病率和死亡率的最主要病因，肺炎球菌的疾病负担主要来自于2岁以下儿童和老年人，肺炎球菌疾病已成为全球一个严重的公共健康问题。全球每年约1，060万5岁以下儿童罹患肺炎球菌疾病，WH0估计每年有160万人死于肺炎球菌疾病，包括70 100万5岁以下的儿童，其中大多数是生活在发展中国家的儿童(http:〃www.who. int/biologicals/areas/vaccines/pneumo/en/)。 全球通过接禾中疫苗可予页防的小于5岁儿童死亡疾病中，肺炎球菌疾病为第l位，占28% (杨永弘，中国疫苗和免疫，2008 ;14:4:376-377)。肺炎球菌疾病死亡人数已超过艾滋病、疟疾和麻疹死亡人数的总和(Obaro，Expert Rev Vaccines. 2009 ;8 (8) :1051-1061)。季节性流感病毒、H1N1流感病毒、HIV病毒感染和其他与免疫缺陷相关的病症使罹患肺炎球菌病的几率大增。美国CDC公布上世纪每次流感大流行，继发的肺炎球菌疾病是发病和死亡的最主要病因，在季节性流感流行期间也观察至Ll同样的情况(http://www. cdc. gov/hlnlflu/vaccination/provider/provider_pneumococcal, htm)。 肺炎球菌诱发的严重疾病包括肺炎、脑膜炎和败血症，中耳炎、鼻窦炎和气管炎也为常见，但感染的临床症状略轻。暴露于肺炎球菌后，常出现暂时性鼻咽部细菌定植但并不发病，当机体抵抗力下降，肺炎球菌可造成呼吸系统的局部感染，如急性中耳炎、鼻窦炎等；肺炎球菌进入下呼吸道导致肺炎；进一步，肺炎球菌侵入血液、脑脊液或其他原本无菌的部位时所形成的感染性疾病，称为侵袭性肺炎球菌疾病(Invasive Pneumococcal Disease,IPD)，菌血症性肺炎、菌血症发热、败血症和脑膜炎是IPD的主要临床表现。
肺炎球菌感染的高发人群是< 5岁儿童和^ 65岁的老人，其中< 2岁儿童发病率最高。美国在大规模使用肺炎球菌结合疫苗前，IPD在《12月龄幼儿中的年发病率为167/10万，在6 11月龄幼儿中的发病率达到235/10万的高峰，在12 23月龄幼儿中的发病率为203/10万，而整体人群的发病率只有24/10万。在欧洲和美国，IPD的年发病率为10 100例/10万。发展中国家中5岁以下儿童中IPD的发病率要比工业化国家高好几倍。我国1996 2000年< 5岁儿童死亡监测结果分析中，肺炎是首位原因(773/10万)，占全部死亡的19% (杨永弘，中国疫苗和免疫，2008 ;14 :4 :376-377)。
肺炎球菌是革兰阳性、具有荚膜的双球菌。荚膜多糖(Polysaccharides, PS)为其主要致病毒力因子。根据荚膜多糖的成份差异，将肺炎球菌区分46个血清群91个血清型。不同年龄、时间和地理区域的优势流行血清型分布谱也有所不同，但常见的血清型在全球各地都有所发现，且全球常见的致病血清型是一致的。从全球范围来看，约20余种血清型与超过80%发生在各年龄段的IPD有关。全球最常见的血清群是6、14、19，然而在发展中国家幼儿IPD中主要是1、5、8血清群。 肺炎球菌对抗生素(如青霉素、头孢菌素、复方新诺明、大环内酯类和氟喹诺酮类)的耐药性在全世界已经成了一个相当严峻的、急剧发展的现象。随着肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性日益增加，当前亟需有效的疫苗来控制肺炎球菌疾病(WHO. WeeklyEpidemiological Record. No. 12， 2007 ;93-104)。目前，有2个预防肺炎球菌疾病疫苗已上市，分别是含有23个血清型荚膜多糖抗原的疫苗(Pneumococcal PolysaccharideVaccine, PPV23)和含有7个血清型荚膜糖与蛋白载体结合的结合疫苗(PneumococcalConjugate Vaccine, PCV7)。 荚膜糖(包括荚膜多糖和荚膜寡糖)抗原是非T细胞依赖型抗原，不能产生免疫记忆反应，在2岁以下儿童中免疫原性弱。因此PPV23主要用于预防成人和^ 2岁儿童肺炎球菌性疾病。PPV23每剂0. 5毫升，含有23个血清型(1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)的纯化荚膜多糖，每个血清型荚膜多糖为25 ii g。这23个血清型在美国和其他一些工业化国家覆盖大多数的成人IPD约90%， PPV23也包括最常见的耐药血清型。30多年来，尽管进行了多个研究，PPV23在儿童和成人的效力和效果仍然难以定论，存在诸多争议。对PPV23疫苗的效力和效果进行综合性的meta分析(包括2007年WHO委托开展的meta分析和一个对RCTs的综合分析)发现，在健康年轻人中PPV23对IPD和全因肺炎具有保护作用，在老年人中对IPD至少也有一定程度的保护。但这些试验并未证实PPV23在高风险人群(如患有可增加感染风险的基础疾病的成人和儿童、所有年龄段的严重免疫抑制者)对IPD和全因肺炎具有保护作用(Moberley S et al. Cochrane Database ofSystematic Reviews,2008 :1 ;CD000422，HussA et al. Canadian Medical Associationjournal, 2008.)。许多工业化国家推荐老人和其他高风险人群接种PPV23, WHO建议在资源有限的国家，现有证据不支持老人和高风险人群常规接种PPV23 (WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 42， 2008 ;373-584)。
荚膜糖抗原和蛋白载体经化学键结合后，转变为T细胞依赖型抗原，可诱导T细胞介导的免疫应答，其特征是促进保护性免疫力的形成，尤其是在婴儿中产生保护，以及诱导免疫记忆。每0. 5ml剂量的PCV7含2 ii g血清型4、9V、 14、 19F和23F的荚膜多糖；2 y g血清型18C的寡糖；4 g血清型6B的多糖。每一血清型荚膜糖都与无毒性的白喉CRM. 197蛋白结合，并由磷酸铝佐剂吸附。在美国，在引进该疫苗开展大规模免疫接种之前，该疫苗中包含的血清型约占儿童侵袭性肺炎链球菌株的86%。美国的大规模现场研究表明，由PCV7疫苗血清型诱导的针对IPD的保护性免疫力在接种了至少3针次的儿童中可达97. 4%，在至少接种1针次的儿童中可达93. 9%。在将PCV7引进国家免疫接种规划1年后，由该疫苗中含有的肺炎球菌血清型所致的IPD在所有1岁以下接种者中的发病率降低了 100%。在引进该疫苗3年后，1岁以下儿童中所有IPD的发病率降低了 84. 1%;在20 39岁成人中降低了52%，在60岁以上个体中降低了27%。后续监测表明，在引进该疫苗2年后，IPD在5岁以下儿童中的发病率降低了 75% 。在5岁以上、未接种疫苗的人群中IPD发病率的下降可能是因为来自5岁以下、已接种疫苗的婴幼儿的细菌传播减少了 ，即所谓"群体免疫"现象。在美国，在所有被防止的IPD中约有68X可归功于这种间接效应。PCV7已通过在全球 不同地区开展的试验中接受了检验，并已被证实是有效的、安全的、耐受性好，即便是在HIV 患儿中也是如此。WHO全球疫苗安全咨询委员会在2006年11月对PCV7的安全性进行了 评估，结论认为，有关PCV7和其他肺炎球菌结合疫苗的安全性的证据是令人信服的(WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 12，2007 ;93—104)。 然而，PCV7大规模接种后，肺炎球菌血清型流行病确出现了变化，PCV7于2000 年在美国大规模接种后，在小于1岁儿童中观察到非疫苗血清型IPD成为最大增长，达到 10. 8/10万。在小于5岁儿童中19A血清型引发的IPD发病率从1998 1999年的2. 6/10 万增长至2005年的9. 3/10万。2005年，在小于5岁儿童中的IPD的40%是非疫苗血清型 19A引起的，19A成为发病率增长最高的血清型。2005年在小于5岁儿童中尽管PCV7疫苗 血清型疾病继续下降，但是2002 2005年IPD总体发病率却呈现平稳状态(Reingold et al.Morbidity & Mortality WeeklyR印ort. 2008 ;57 :6 :144-148.)。另一研究者也指出， 2002 2005年小于5岁儿童中每年IPD的72 91 %是非疫苗血清型菌株引发的(Pelton et al.Pediatr Infect DisJ. 2007 ;26 (6) :468-472.)。 有鉴于成功的疫苗对肺炎球菌疾病所带来的巨大的公共卫生影B向，WHO认为应优 先开发安全、有效、价格适中，并能为肺炎球菌疾病提供更广谱保护的肺炎球菌疫苗。需要 有更有效的结合疫苗或其他类型的疫苗，这些疫苗可涵盖导致全球大龄儿童和成人严重疾 病的大多数肺炎球菌血清型(往往也是对常用抗菌药物耐药的血清型)。WH0支持当前正 在开展的这类疫苗产品的研发工作(WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 42， 2008 ; 373-584)。因此，扩大PCV7疫苗血清型就凸显为急迫的任务。 近年来，鉴于1 、3、5、6A、7F和19A血清型侵入性肺炎疾病的严重性和危害，在PCV7 疫苗基础上增加血清型1和5的PCV9、继续增加血清型7F的PCV10、再增加血清型3的 PCV11、进一步增加血清型6A和19A的PCV13相继在开发中。PCV7在美国、欧洲、亚洲和拉 丁美洲的覆盖率分别为80 90%、 60 80%、 40 80%。在PCV7中增加6个型别荚膜糖 蛋白结合物，成为13价结合疫苗。13价结合疫苗对美国和欧洲的覆盖率均提升至90%以 上，对亚洲和拉丁美洲的覆盖率也提升至70 80%。然而，相比较PPV23疫苗在全球的覆 盖率和考虑到大规模接种疫苗后将出现非疫苗血清型流行增加的趋势，PCV13覆盖率仍需 要继续扩大。 现有肺炎球菌结合疫苗在技术上均是将每一个血清型的荚膜糖独立与蛋白载体 经化学键结合后，形成单价血清型荚膜糖_蛋白结合体，再将各个单价血清型荚膜糖_蛋白 结合体合并，进而配制成为含多个血清型荚膜糖的肺炎球菌结合疫苗。肺炎球菌结合疫苗 中各个荚膜糖抗原以单价荚膜糖-蛋白结合体独立存在，彼此并无结构上的链接。例如， PCV7是将来源于7个血清型的不同荚膜糖分别与蛋白载体CRM197经化学键结合形成7个 单价荚膜糖_蛋白结合体，即4PS-CRM197、9VPS-CRM197、14PS-CRM197、19F PS-CRM197、23F PS-CRM197、6B PS-CRM197禾P 18C 0S-CRM197，再将上述7个单价荚膜糖-蛋白结合体按比 例合并配制成多价成品疫苗。因此，利用现有技术将超过13个血清型的更多血清型荚膜糖 与蛋白载体分别结合，形成多个单价的血清型荚膜糖-蛋白结合体，再将多个单价血清型 荚膜糖-蛋白结合体合并，并制成单一疫苗制剂，在技术上仍存在困难(中国专利申请号 200680053139. 6)。同时，现有的PCV7和即将上市的PCV13与Hib结合疫苗相比较，在生产
7过程和生产成本方面分别相当于7个和13个Hib结合疫苗。这些因素限制了肺炎球菌结合疫苗的进一步发展。 本发明提供的新型肺炎球菌结合疫苗，系将来源于2个不同血清型荚膜糖抗原或多个不同血清型荚膜糖抗原，与载体蛋白进行化学结合，形成2价血清型荚膜糖_蛋白结合体或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体；再将一个或两个或两个以上这样的结合体配制成肺炎球菌结合疫苗。因此，本发明的肺炎球菌结合疫苗继承了现有肺炎球菌结合疫苗的安全性、良好的免疫原性、诱导免疫记忆的优势；又成功地解决了将更多的血清型荚膜糖抗原纳入其中的技术困难，使疫苗覆盖范围更广；进一步，显著性地縮短了疫苗生产过程和降低了生产成本。
发明内容
本发明一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合与其它型荚膜糖相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。换言之，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键相互间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。本发明提供的肺炎球菌结合疫苗用于婴幼儿、儿童及成人预防肺炎球菌感染引发的疾病。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜多糖，这些来源于不同血清型的荚膜多糖与蛋白载体进行化学键结合，荚膜多糖通过与蛋白载体的化学键结合与其它型荚膜多糖相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜多糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜多糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜多糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键相互间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜寡糖，这些来源于不同血清型的荚膜寡糖与蛋白载体进行化学键结合，荚膜寡糖通过与蛋白载体的化学键结合与其它型荚膜寡糖相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜寡糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜寡糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键相互间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜多糖和寡糖，这些来源于不同血清型的荚膜多糖和寡糖与蛋白载体进行化学键结合，荚膜多糖和寡糖通过与蛋白载体的化学键结合与其它型荚膜多糖和寡糖相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜多糖和寡糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜多糖和寡糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖和寡糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜多糖和寡糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键相互间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。
本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜多糖和寡糖，这些来源于一组不同血清型的荚膜多糖与蛋白载体进行化学键结合，这组荚膜多糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜多糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜多糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。这些来源于另外一组的不同血清型的荚膜寡糖与蛋白载体进行化学键结合，这组荚膜寡糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以2价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于一组不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖和来源于另外一组不同血清型的荚膜寡糖抗原分别与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述各型荚膜多糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述各型荚膜寡糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。2价或多价血清型荚膜多糖_蛋白结合体和2价或多价血清型荚膜寡糖_蛋白结合体分别独立存在疫苗中，相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，此2 45个血清型荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。来源于不同血清型的荚膜糖以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体独立存在疫苗中，换言之，本发明疫苗中包含的每个2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体与其他2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，此2 45个血清型荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，其中，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体分别含有相等价数的血清型荚膜糖，并且该价数均介于2 45之间。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。来源于不同血清型的荚膜糖以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体独立存在疫苗中，其中，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式独立存在于疫苗中，并且该相等价数均介于2 45之间。换言之，本发明疫苗中包含相等价数的血清型荚膜糖-蛋白结合体的组合，例如，包含两个以上2价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含两个或两个以上3价血清型荚膜糖-蛋白结合体；或包含两个或两个以上4价血清型荚膜糖-蛋白结合体；或包含两个或两个以上5价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上6价血清型荚膜
9糖-蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上7价血清型荚膜糖-蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上8价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上9价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上10价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上11价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上12价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上13价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上14价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上15价血清型荚膜糖-蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上16价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上17价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上18价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上19价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上20价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上21价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上22价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上23价血清型荚膜糖_蛋白结合体；或包含一个或两个或两个以上24价血清型荚膜糖_蛋白结合体；以此类推，直至包含一个或两个45价血清型荚膜糖_蛋白结合体；并且，每个2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体与其他2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，此2 45个血清型荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，其中，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以不相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，且该不相等价数介于2 45之间。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫苗，所述荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。来源于不同血清型的荚膜糖以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体独立存在疫苗中，其中，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以不相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式独立存在于疫苗中，且该不相等价数介于2 45之间。换言之，本发明疫苗中同时包含不相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合，既可包含2价血清型荚膜糖_蛋白结合体，也包含3价血清型荚膜糖_蛋白结合体、4价血清型荚膜糖_蛋白结合体、5价血清型荚膜糖_蛋白结合体、直至45价血清型荚膜糖_蛋白结合体的任选组合。并且，每个2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体与其他2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体相互间没有结构上的链接。
本发明又一方面提供一种肺炎球菌结合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖，这些来源于不同血清型的荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，此2 45个血清型荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，其中，所述两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以部分相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中，且该相等价数介于2 45之间。因此，本发明包括来源于不同肺炎球菌血清型的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的肺炎球菌结合疫
10苗，所述荚膜糖任选地以每2 45个血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。来源于不同血清型的荚膜糖以一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体独立存在疫苗中，其中，所述两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体以部分相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体形式独立存在于疫苗中，且该相等价数介于2 45之间。换言之，本发明疫苗中同时包含相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体和不相等价数的血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合，并且，每个2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体与其他2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些来源于不同细菌血清型(群)的荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，各型(群)荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于肺炎球菌多个血清型、脑膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的联合疫苗，所述各型(群)荚膜糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌2群(A、 C)荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些来源于不同细菌血清型(群)的荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，各型(群)荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合相互间建立结构上的链接，以2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于肺炎球菌多个血清型、脑膜炎球菌2群(A、 C)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的联合疫苗，所述各型(群)荚膜糖以2价和/或多价被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中。 本发明又一方面提供一种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些来源于肺炎球菌不同血清型的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合形成彼此间结构上的链接，以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。这些来源于脑膜炎球菌不同血清群的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合形成各群荚膜糖彼此间结构上的链接，以4价血清群荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。来源于b型流感嗜血杆菌的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合，以单价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于肺炎球菌多个血清型、脑膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的联合疫苗，所述肺炎球菌以每2价和/或多价血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述脑膜炎球菌各群荚膜糖以被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述b型流感嗜血杆菌荚膜糖以被蛋白载体结合的形式存在于疫苗中。肺炎球菌荚膜糖、脑膜炎球菌荚膜糖、b型流感嗜血杆菌荚膜糖相互间没有结构上的链接。
本发明又一方面提供一种肺炎球菌_脑膜炎球菌_b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌2群(A、 C)荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些来源于肺炎球菌不同血清型的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合形成彼此间结构上的链接，以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。这些来源于脑膜炎球菌不同血清群的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合形成各群荚膜糖彼此间结构上的链接，以2价血清群荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。来源于b型流感嗜血杆菌的荚膜糖通过与蛋白载体的化学键结合，以单价血清型荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。因此，本发明包括来源于肺炎球菌多个血清型、脑膜炎球菌2群(A、 C)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的荚膜糖抗原与蛋白载体结合所组成的联合疫苗，所述肺炎球菌以每2价和/或多价血清型荚膜糖被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述脑膜炎球菌各群荚膜糖以被蛋白载体通过化学键彼此间在结构上建立链接的形式存在于疫苗中，所述b型流感嗜血杆菌荚膜糖以被蛋白载体结合的形式存在于疫苗中。肺炎球菌荚膜糖、脑膜炎球菌荚膜糖、b型流感嗜血杆菌荚膜糖相互间没有结构上的链接。 本发明又一方面提供一种制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体的多价细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤 (a)从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型(群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖； (b)将步骤(a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群)的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖； (c)将步骤(b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合并纯化，制成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原； (d)将步骤(c)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。 在本发明术语中，荚膜糖包括荚膜多糖和荚膜寡糖；所述荚膜寡糖是荚膜多糖经水解法(包括酸、碱、酶水解)、氧化法和消除法(包括碱或裂解酶介导的P消除法)等化学方法降解后的荚膜寡糖；进一步，所述荚膜寡糖还包括荚膜多糖经超声波降解法和机械剪切等物理方法降解后的荚膜寡糖。 在本发明术语中，单价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体是指一个单一血清型
(群)荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，该荚膜糖与其它型(群)荚膜糖没有结构上的链接。2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体是指2个不同血清型(群)荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成结合物，此2个型(群)荚膜糖经与蛋白载体生成化学键彼此间建立结构上的链接。换言之，蛋白载体经化学键将2个不同型(群)荚膜糖链接在一起。多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体是指3个或3个以上的不同血清型(群)荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成结合物，此3个或3个以上的型(群)荚膜糖经与蛋白载体生成化学键相互间建立结构上的链接。换言之，蛋白载体经化学键将3个或3个以上的不同型(群)荚膜糖链接在一起。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，制备荚膜糖的肺炎球菌血清型选自于 肺炎球菌全部血清型菌株，优选45个型菌株，更优选1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株，最优选1、2、3、4、5、6A、6B、 7F、9V、 14、 18C、 19A、 19F、23F型菌株。进一步，制备荚膜糖的肺炎球菌血清型菌株是依据流 行病学流行优势血清型菌株而确定的。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，来源于多个血清型菌株的荚膜糖抗原 任选地以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在 于疫苗中。优选45价血清型荚膜糖_蛋白结合体；更优选24价血清型荚膜糖_蛋白结合 体；最优选14价血清型荚膜糖_蛋白结合体；进一步，优选12价血清型荚膜糖_蛋白结合 体；优选11价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选10价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选9 价血清型荚膜糖-蛋白结合体；优选8价血清型荚膜糖-蛋白结合体；优选7价血清型荚膜 糖_蛋白结合体；优选6价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选5价血清型荚膜糖_蛋白结 合体；优选4价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选3价血清型荚膜糖_蛋白结合体；优选2 价血清型荚膜糖-蛋白结合体。换言之，例如，来源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株的荚膜糖优选地以24价血清 型荚膜糖_蛋白结合体形式存在；更优选以12价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在；最 优选以8价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在；进一步，优选以6价血清型荚膜糖_蛋 白结合体形式存在；优选以4价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在；优选以3价血清型 荚膜糖_蛋白结合体形式存在；优选以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在。所述来 源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、 33F型菌株的荚膜糖是以任选方式划分为24价(l组)；12价(2组)；8价(3组)；6价(4 组)；4价(6组)；3价(8组)；2价(12组)。每组荚膜糖与蛋白载体结合后再混合组成本 发明疫苗。因此，24价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由1个24价血清型荚膜糖_蛋 白结合体所组成；12价血清型荚膜糖-蛋白结合体疫苗是由2个不同的12价血清型荚膜 糖_蛋白结合体所组成；8价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由3个不同的8价血清型荚 膜糖_蛋白结合体所组成；6价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由4个不同的6价血清 型荚膜糖_蛋白结合体所组成；4价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由6个不同的4价 血清型荚膜糖_蛋白结合体所组成；3价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由8个不同的3 价血清型荚膜糖_蛋白结合体所组成；2价血清型荚膜糖_蛋白结合体疫苗是由12个不同 的2价血清型荚膜糖_蛋白结合体所组成。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，来源于多个血清型菌株的荚膜糖抗原 任选地以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式并以 组合方式存在于疫苗中。在本发明疫苗中，抗原优选2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体 进行组合；更优选2 24价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；最优选2 14价血清型 荚膜糖_蛋白结合体进行组合；进一步，优选2 12价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 11价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 10价血清型荚膜糖_蛋 白结合体进行组合；优选2 9价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 8价血清 型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 7价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优 选2 6价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 5价血清型荚膜糖_蛋白结合 体进行组合；优选2 4价血清型荚膜糖_蛋白结合体进行组合；优选2 3价血清型荚膜 糖-蛋白结合体进行组合。换言之，例如，来源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株的荚膜糖优选地以2 24价血清 型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；更优选以2 14价血清型荚膜糖_蛋白结合体的 组合形式存在；最优选以2 12价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；进一步， 优选以2 11价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 10价血清型荚 膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 9价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形 式存在；优选以2 8价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 7价血 清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 6价血清型荚膜糖_蛋白结合体的 组合形式存在；优选以2 5价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 4 价血清型荚膜糖_蛋白结合体的组合形式存在；优选以2 3价血清型荚膜糖_蛋白结合 体的组合形式存在。2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和多价血清型荚膜糖_蛋白结合体混 合后组成本发明疫苗。因此，本发明疫苗可同时包含2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和多 价血清型荚膜糖_蛋白结合体。 本发明提供由2价血清型肺炎球菌荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型肺炎球 菌荚膜糖-蛋白结合体的组成的肺炎球菌结合疫苗，在本发明优选的实施方案中，预先将 肺炎球菌荚膜糖划分为2个和/或多个组，每个组包含2个血清型荚膜糖或多个血清型荚 膜糖。每个组所含的血清型荚膜糖经合并后再与蛋白载体进行化学键结合，形成2价血清 型荚膜糖_蛋白结合体或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，进而配制成疫苗成品。因此，将 血清型荚膜糖划分成组的数量并且确定每组包含2个血清型荚膜糖或多个血清型荚膜糖 是依据荚膜糖分子量大小、总氮、磷、糖醛酸、己糖胺、甲基戊糖、0-乙酰基含量划分。进一 步，随机地任选血清型荚膜糖进行组合。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗，荚膜糖抗原任选地以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血 清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。其中，所述的2价血清型荚膜糖_蛋白结合 体的制备是预先将2个来源于不同血清型荚膜糖合并，然后再与蛋白载体进行化学结合， 形成2价血清型荚膜糖_蛋白结合体。2个血清型荚膜糖均与载体蛋白产生化学键链接， 载体蛋白又依据化学键将2个荚膜糖在结构上形成链接。所述的多价血清型荚膜糖_蛋白 结合体的制备是预先将多个来源于不同血清型荚膜糖合并，然后再与蛋白载体进行化学结 合，形成多价血清型荚膜糖-蛋白结合体。多个血清型荚膜糖均与载体蛋白产生化学键链 接，载体蛋白又依据化学键将多个荚膜糖在结构上形成链接。因此，来源于不同血清型荚膜 糖预先合并的相互间比例是确定本发明结合疫苗成品中各型抗原含量的主要条件之一，荚 膜糖合并比例根据荚膜糖种类(多糖或寡糖)、荚膜糖结构特征、荚膜糖_蛋白结合体价数、 结合方法及工艺条件等因素而变化。在本发明优选的实施方案中，荚膜糖相互间合并重量 比优选为l : 0.05 20(w/w)(本发明所述w/w系指重量比，例如iig/iig)的比例合并，更
14优选的合并重量比为i : o. i 10(w/V)，最优选的合并重量比为i : o. 2 5(w/w)。荚 膜糖合并有多种其它的重量比，在此所述重量比仅仅是用于说明本发明。所以，可以采用各
种等同的荚膜糖合并重量比实现本发明所述的2价血清型荚膜糖-蛋白结合体或多价血清
型荚膜糖-蛋白结合体。 本发明提供来源于肺炎球菌多个血清型并被蛋白载体链接的荚膜糖抗原所组成 的肺炎球菌结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，所述蛋白载体选自破伤风类毒素(TT)、 白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒变异体(CRM197) 、 B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球 菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血杆菌 D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、铜绿假单胞菌 外毒素A(PEA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)。更优选TT、DT、CRM197和0MP。最优选DT和CRM197。 总之，选用上述蛋白作为最常见的载体和细菌类荚膜糖结合制备结合疫苗是本领域技术人 员公知的方案，例如选用这些蛋白载体制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗、制备肺炎球菌结 合疫苗、制备脑膜炎球菌结合疫苗(Lee， Chi-Jen等人Infect Medl9(3) : 127-133， 2002)。 在本发明优选的实施方案中，结合肺炎球菌多糖的蛋白载体最优选为DT。如果满足需要，也 可采用其它蛋白载体，此处给出的蛋白载体仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明的肺炎球菌结合疫苗的又一方案，将来源于肺炎球菌的蛋白PspA、 PsaA、
Ply等合并成为肺炎球菌蛋白复合物，再将此蛋白复合物作为蛋白载体与荚膜糖进行结合。
一方面，肺炎球菌蛋白复合物发挥蛋白载体的功效，将荚膜糖由T细胞非依赖型抗原转变 成T细胞依赖型抗原，产生免疫记忆反应。另一方面，肺炎球菌蛋白复合物又作为蛋白抗原 参与免疫应答反应，并且扩大了结合疫苗交叉免疫保护范围，增强疫苗的免疫效力。
在本发明中，肺炎球菌荚膜糖的制备和质量控制的方法及标准是本领域技术人员 所公知的。在本发明优选的实施方案中，技术人员可依据世界卫生组织正式颁布的肺炎球 菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)和中华人民共 和国药典三部(2005年版)等技术文件制备荚膜糖并进行质量检定。 在本发明中，单价荚膜糖和蛋白载体结合的方法以及对单价荚膜糖-蛋白结合 体进行质量控制的方法及标准是本领域技术人员所公知的(Pawlowski et al. Vaccine 2000 ;18 :1873-1885 ;Wessels et al. J. Clin. Invest. 1990 ;86 :1428-1433 ;WHOTechnical Report Series.No. 897. 2000 ;WHO Technical Report Series. No. 924. 2004 ;WHO Technical R印ort Series. No. 927. 2005 ;罗宾逊等，疫苗关键技术详解。化学工业出版社， 2006年，165-178页；张延龄等，疫苗学。科学出版社，2004年，506_517、652-653、679_681、 699-700、896-902、918-925、943-945、961-964、968-978页；)。在本发明优选的实施方案 中，2价或多价荚膜糖和蛋白载体结合方法可选用任何已知的单价荚膜糖和蛋白载体结合 的方法进行制备，优选自还原胺法、酰胺縮合法、硫醚縮合法、二硫化反应法、硫代氨甲酰反 应法、0-烷基异脲化反应法、重氮结合反应法，更优选还原胺法和酰胺縮合法，最优选2种 法或多种方法的联合应用。技术人员可参照世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制 造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)制备2价或多价荚膜糖-蛋 白结合体并进行质量检定。在本发明优选的一个实施方案中，先用溴化氰(CNBr)或氰化剂 (1-氰基_4- 二甲基氨基-吡啶四氟硼酸，CDAP)对2价荚膜糖或多价荚膜糖进行活化处 理，再以己二酰肼(ADH)为双功能亲核间隔基加入已活化的荚膜糖中，形成荚膜糖-ADH衍生物，再经过碳二亚胺(EDAC)介导的縮合作用与蛋白载体共价结合，形成2价荚膜糖-蛋 白结合体或多价荚膜糖_蛋白结合体，再经纯化获得用于配制肺炎球菌结合疫苗的抗原组 分。荚膜糖与蛋白的结合有多种已知的方法，在此所述的结合方法仅仅是用于说明本发明。 所以，可以采用各种等同的方法实现本发明所述的结合，因此任何用于荚膜糖与蛋白载体 结合的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。 本发明提供制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型 (群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法。其中，所述细菌包括但不限于肺 炎球菌、脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌、葡萄球菌、B群链球菌等具有荚膜 糖的细菌。在本发明优选的实施方案中，细菌优选肺炎球菌、脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆 菌。在本发明中，制备荚膜糖的细菌菌种购自中国药品生物制品检定所医学细菌保藏管理 中心(CMCC)或美国标准生物收藏中心(ATCC)。 本发明提供制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型 (群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法。在本发明优选的一个实施方案 中，两个或两个以上血清型(群)荚膜糖依据重量比合并后，对其进行匀化处理，益于不同 血清型(群)荚膜糖与蛋白载体的结合较为均衡。优选的匀化处理方法是超声处理；优选 的参数是25 75Hz 2 10分钟。 本发明提供制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型 (群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法。在本发明优选的一个实施方案 中，对2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合 体抗原进行脱毒处理，益于降低多价细菌荚膜糖结合疫苗在大量增加荚膜糖抗原价数后的 副反应。脱毒剂优选自甲醛、戊二醛、过氧化氢，更优选戊二醛。 因此，本发明提供制备含有2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血 清型(群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法。所述方法进一步包括以下 步骤 (a)从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型 (群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖。其中，所述细菌包括但不限于肺炎球菌、脑膜炎 球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌、葡萄球菌、B群链球菌等具有荚膜糖的细菌；
(b)将步骤(a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群) 的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖。其中，所述荚膜糖合并后进 一步经匀化处理； (c)将步骤(b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学结合，制 成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗 原； (d)将步骤(c)的产物脱毒处理并纯化制成2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合 体抗原或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原； (e)将步骤(d)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型 (群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。 在本发明提供的肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗中，疫苗剂量按照药学 领域一般技术人员所公知的技术标准来确定。例如，在确定剂量时应考虑到抗原特性、佐剂
16性质、接种者的年龄、疫苗接种途径等诸因素。在本发明优选的实施方案中，成品疫苗优选 的每一血清型(群)荚膜糖剂量为0. 1 50 g，更优选的每一血清型(群)荚膜糖剂量为 1 25 i！ g，最优选的每一血清型(群)荚膜糖剂量为2 10 i！ g。 在本发明优选的实施方案中，肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗还可包含 本领域常用的佐剂。优选的佐剂有铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素B亚单位(CTB)、皁角素 Q21、类脂体、单磷酸类脂A(MPL)、 MF59、大肠杆菌不耐热毒素(LT)，更优选的佐剂是铝佐 剂，如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。 在本发明提供的肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗中，疫苗的剂型和配伍 按照药学领域一般技术人员所公知的技术标准来确定。在本发明优选的实施方案中，疫苗 剂型优选是液体剂型、冻干剂型、丸剂、片剂、胶囊剂型，更优选是液体剂型或冻干剂型，最 优选是液体剂型。 在本发明优选的实施方案中，肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗可以是无 防腐剂疫苗。在本发明优选的另一实施方案中，联合疫苗包含防腐剂，优选的防腐剂是硫柳 汞、2_苯氧乙醇、苯甲醇。 本发明提供的肺炎球菌结合疫苗和细菌荚膜糖结合疫苗，接种途径包括皮内注 射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，还包括经鼻腔、口腔、肛门、阴道、黏膜途径给药。
本发明的肺炎球菌结合疫苗及细菌荚膜糖结合疫苗制备方法与现有肺炎球菌结 合疫苗及其制备方法相比较，包括与当前已上市的肺炎球菌结合疫苗例如PCV7和即将上 市的PCV13及其制备方法的比较，进一步与已公开的专利文本所述的肺炎球菌结合疫苗及 制备方法例如中国专利200680017776. 8、00807773. 8、92100700. 0、00807759. 2、02827993. X、01815748. 3、200680052954. 0、200680053139. 6、200610054832. 7的比较，更进一步与中 国专利03141407. 9的比较，其区别及有益效果在于 (1)本发明疫苗所含抗原结构不同。现有肺炎球菌结合疫苗在技术上均是将来源 于每一个血清型的荚膜糖独立与蛋白载体经化学结合后，形成单价的血清型荚膜糖-蛋白 结合体，再将各个单价血清型荚膜糖-蛋白结合体混合，进而配制成为含多血清型荚膜糖 的肺炎球菌结合疫苗。因此，现有肺炎球菌结合疫苗中所含各个血清型荚膜糖抗原以单价 荚膜糖-蛋白结合体独立存在，各个血清型荚膜糖彼此并无结构上的链接。本发明疫苗是 将不同血清型的荚膜糖按两个或两个以上的血清型荚膜糖预先合并后再与蛋白载体经化 学键结合后，形成2价血清型荚膜糖_蛋白结合体或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，再将 各个2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体混合，进而配 制成为含多血清型荚膜糖的肺炎球菌结合疫苗。因此，本发明疫苗中所含各个血清型荚膜 糖抗原以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体存在，并 且，2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和多价血清型荚膜糖_蛋白结合体中各个血清型荚膜糖 彼此有结构上的链接。 (2)本发明疫苗所含抗原分子量更大。本发明疫苗所含的2价血清型荚膜糖_蛋 白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，由于依据与蛋白载体的化学键结合2价 或多价荚膜糖在结构上相互间形成链接，荚膜糖抗原分子量间接被增大。因此，本发明疫苗 较单价血清型荚膜糖-蛋白结合体有更好的免疫原性。 (3)本发明疫苗减少蛋白载体免疫竞争。本发明疫苗所含抗原是2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，不同血清型荚膜糖依据与蛋白载 体的化学键结合在结构上相互间形成链接。因此，较单价血清型荚膜糖-蛋白结合体而言， 本发明疫苗所含的2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体 抗原中的蛋白载体总量减少，导致与荚膜糖应答的B细胞较与蛋白载体应答的B细胞占优 势，并竞争更多Th细胞参与到B细胞应答荚膜糖的过程中，从而减少蛋白载体诱导的表位 抑制效应。 (4)本发明疫苗所含抗原更稳定。本发明疫苗所含的2价血清型荚膜糖_蛋白结 合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体，由于依据与蛋白载体的化学键结合2价血清 型荚膜糖或多价血清型荚膜糖在结构上相互间形成链接，因此，本发明疫苗所含荚膜糖抗 原较现有技术的单价荚膜糖更具稳定性。 (5)本发明提供了一种制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多 价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以下步 骤 (a)从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型 (群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖； (b)将步骤(a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群) 的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖； (c)将步骤(b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合并 纯化，制成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白 结合体抗原； (d)将步骤(c)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型 (群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。 (6)本发明进一步提供一种制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/ 或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以 下步骤 (a)从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型 (群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖。其中，所述细菌包括但不限于肺炎球菌、脑膜炎 球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌、葡萄球菌、B群链球菌等具有荚膜糖的细菌；
(b)将步骤(a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群) 的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖。其中，所述荚膜糖合并后进 一步经匀化处理； (c)将步骤(b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，制 成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗 原； (d)将步骤(c)的产物脱毒处理并纯化制成2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合 体抗原或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原； (e)将步骤(d)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型 (群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。 本发明通过如下实施例，但非限制，举例进一步描述本发明的核心内容，所述实施例阐述本发明的概念和几个优选的实施方案。本发明的其它实施例在不背离本发明的核心 的前提下为本领域技术人员所预见。
具体实施例方式
本发明可通过如下实施例进一步了解，所述实施例选择了几个优选实施方案，仅 为了更好展示本发明，而非对发明内容进行限制。
实施例 实施例1肺炎球菌发酵培养及荚膜多糖的制备 将低温保藏的肺炎球菌冻干菌种启开，用生理氯化钠溶液复溶后，接种至5 10%羊血琼脂斜面培养基，置5 8% C02环境中，于35 37t:培养16 24小时。转种至 肺炎球菌液体基础培养基，于35 37t:培养10 18小时。继续转种至肺炎球菌液体基础 培养基进行增菌培养，于35 37t:培养10 18小时。按5 10%接种量将增菌后的肺炎 球菌液体培养物接种至已加入液体基础培养基的发酵罐内，搅拌、通气培养，于35 37°C 培养8 12小时，pH控制在6. 0 7. 4之间。发酵培养期间监测细菌浓度变化，镜检培养 物纯度及菌体形态特征。发酵培养结束时，按发酵罐内培养基的量加入终浓度为0.05 0. 20%去氧胆酸钠裂解菌体细胞，搅拌20 60分钟，终止发酵培养。 用连续流离心机离心去除菌体细胞碎片，收集上清液。对上清液进行超滤浓縮，超 滤膜规格选用50 IOOKD，浓縮倍数至原体积的1/5 1/20。置超滤后的浓縮液于生理氯 化钠溶液中进行透析。向透析后的浓縮液加入乙酸钠至终浓度3 10%，搅拌至充分溶解， pH调至4. 8 6. 4。继续于2 8t:环境中缓慢加入预先冷却的乙醇至终浓度15 60%， 搅拌15 45分钟，经12， 000 16， 000g、2 8"超速离心，收集上清液。于上清液中继续 加入乙酸钠至终浓度5 15X，搅拌至充分溶解，pH维持4. 8 6. 4。继续于2 8"环境 中缓慢加入预先冷却的乙醇至终浓度30 80%，搅拌15 45分钟，经2， 200 2， 800g、 2 『C离心，收集粗多糖沉淀物。抽真空，_201:储存，待进一步纯化。
将粗多糖加入0. 3 0. 6M的乙酸钠溶液中，pH调至6. 5 7. 2，于2 8T环境 中搅拌至完全溶解。再加入冷酚至终浓度65 75%进行抽提，经14， 000 18， 000超速离 心，收集上清液。重复冷酚抽提步骤2 4次。收集的上清液于2 『C经透析，除去残留 酚，透析液为注射用水。于2 『C环境中缓慢加入预先冷却的乙醇至终浓度40 90%， 搅拌15 45分钟，经2， 200 2， 800g、2 8t:离心，收集多糖沉淀物。多糖沉淀物经无水 乙醇和丙酮浸泡、洗涤各2 4次，干燥后用注射用水溶解，再经0. 22 ii m除菌过滤得到纯 化多糖，以液体或冻干形式储存于-2(TC以下。按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫 苗制造及检定规程(WHO TechnicalR印ort Series, No. 927,2005)规定方法和标准对纯化 多糖进行检定。 按照上述方法分别制备肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖。
实施例2肺炎球菌荚膜寡糖的制备 将纯化多糖溶解于0. 2 1. 0M乙酸溶液中至终浓度1 4mg/ml，浸入70 IO(TC 油浴或水浴中水解6 40小时。水解后将pH调至7. 0，于2 8"透析。再经S印harose 4FF层析柱纯化，用15mM NaCl液洗脱，收集寡糖。通过0. 22 y m除菌过滤得到纯化寡糖，以液体或冻干形式储存于-20°C以下。按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及 检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)规定方法和标准对纯化寡糖进行 检定。 按照上述方法分别制备肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、
12F、 14、 15B、 17F、 18C、 19A、 19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖。 实施例3脑膜炎球菌荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖的制备 按照中国专利200710007045. 1方法制备A群、C群、W135群、Y群脑膜炎球菌荚膜
多糖和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖。 再按照本发明实施例2方法制备A群、C群、W135群、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖和 b型流感嗜血杆菌荚膜寡糖。 按世界卫生组织正式颁布的脑膜炎球菌多糖疫苗制造及检定规程(WHOTechnical R印ort Series, No. 658， 1980)和b型流感嗜血杆菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 897， 2000)规定方法和标准对纯化多糖和寡糖进行检定。
实施例4蛋白载体_白喉类毒素(DT)的制备 将低温保存的白喉杆菌冻干菌种启开，用生理氯化钠溶液复苏，接种至血琼脂斜 面培养基，于33 36t:培养16 20小时。转种至改良林氏肉汤培养基，于33 36。C培 养16 20小时。再转种至改良林氏肉汤培养基，于33 36t:培养16 20小时。继续转 种至含改良林氏肉汤培养基的菌种瓶内进行增菌培养，于33 36t:培养36 72小时。将 菌种瓶内培养物转种至含改良林氏肉汤培养基的发酵罐内，在通气、搅拌、PH7. 0 8. 5条 件下，于33 36t:培养40 56小时。发酵完毕，加入终浓度O. 1 0. 5%的甲醛灭菌处 理，经离心收集上清液。上清液经0. 22 ii m滤器除菌过滤，再经30 50KD膜超滤浓縮。分 别加入NaHC03至终浓度0. 45 0. 55%、活性碳至终浓度0. 72 0. 78 % 、 (NH4) 2S04至终浓 度28.0 30.0%，搅拌30分钟，置室温静置12 18小时。离心收集上清液。于收集的上 清液中加入(NH4)2S04至终浓度42. 0 45. 0%，搅拌30分钟，置室温静置4 8小时。离 心收集沉淀并溶于0. 1 % NaHC03溶液中。于2 8°C 、透析60 72小时后，再经0. 22 y m 滤器除菌过滤。除菌过滤后的液体加入赖氨酸至终浓度1. 0 2. 0%，再加入甲醛至终浓度 0. 4 0. 6%， pH调至6. 8 7. 0，置37 40。C脱毒42 48天。脱毒后的DT原液按《中 华人民共和国药典》(2005年版)规定项目和方法检定，检定合格后原液置2 8t:保存备 用。 实施例5荚膜糖-蛋白结合疫苗的制备 (1)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(24价多糖-蛋白结合体)
将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖用注射用水稀释并按各型多糖1 : 1 5 (w/ w)重量比合并，合并后的多糖浓度为2.0 10. Omg/型多糖/ml。超声匀化处理25 75Hz 2 10分钟。加入溴化氰活化多糖至终浓度1. 0 4. Omg/mg总多糖，用NaOH调节pH并维持 pH9. 5 11. 5，于20 26。C搅拌30 60分钟。再加入己二酰肼至终浓度12. 0 18. Omg/ ml，调节并维持pH8. 0 10. O，保持15 30分钟。于20 26。C搅拌30 60分钟，再置 在2 『C搅拌18 24小时，形成多糖_己二酰肼衍生物。将多糖_己二酰肼衍生物于 2 8。C透析72 96小时，再经0. 45 ii m滤器除菌过滤。将DT稀释至1. 0 4. Omg/ml，按
20多糖_己二酰肼衍生物DT为1 : 0. 5 2比例(v/v)将DT加入多糖-己二酰肼衍生物 中，调节并维持pH5. 0 6. 0。加入碳二亚胺至终浓度20 30mg/ml，调节并维持pH5. 0 6. O，维持60 90分钟后，调节并维持p朋.5 7. 5。加入戊二醛至终浓度0. 05 0. 15% 脱毒处理，维持4 6小时。置2 8"透析72 120小时，经100 300KD超滤膜超滤浓 縮。用S印harose 4FF层析柱纯化多糖_DT结合物，收集多糖_DT结合物，再经0. 22 y m滤 器除菌过滤，获得24价肺炎球菌多糖-DT结合体原液。用注射用水稀释24价肺炎球菌多 糖-DT结合体原液、磷酸铝、氯化钠、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量分别为结合DT 的各血清型多糖2 lOii g/ml、磷酸铝1. 0 1. 5mg/ml、氯化钠7. 5 9. 5mg/ml、2_苯氧 乙醇5. 0 6. Omg/ml，pH调至5. 8 7. 2。按吸出量X). 5ml分装西林瓶并封口 。按世界 卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)规定方法和标准进行检定，检定合格后为肺炎球菌多糖结合疫苗。
(2)肺炎球菌24价寡糖结合疫苗的制备(24价寡糖-蛋白结合体)
将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖用注射用水稀释并按各型寡糖1 : 1 5 (w/ w)重量比合并，合并后的寡糖浓度为2. 0 10. Omg/型寡糖/ml。加入溴化氰活化寡糖至 终浓度1. 0 4. Omg/mg总寡糖，用NaOH调节pH并维持pH9. 5 11. 5，于20 26。C搅拌 30 60分钟。再加入己二酰肼至终浓度12. 0 18. Omg/ml，调节并维持pH8. 0 10. 0， 保持15 30分钟。于20 26。C搅拌30 60分钟，再置在2 8。C搅拌18 24小时， 形成寡糖_己二酰肼衍生物。将寡糖_己二酰肼衍生物于2 『C透析72 96小时，再 经0. 45 ii m滤器除菌过滤。将DT稀释至1. 0 4. Omg/ml，按寡糖-己二酰肼衍生物DT 为1 : 0. 5 2比例(v/v)将DT加入寡糖-己二酰肼衍生物中，调节并维持pH5. 0 6. 0。 加入碳二亚胺至终浓度20 30mg/ml，调节并维持pH5. 0 6. 0，维持60 90分钟后，调 节并维持P朋.5 7. 5。置2 8t:透析72 120小时，经100 300KD超滤膜超滤浓 縮。用S印harose 4FF层析柱纯化寡糖-DT结合物，收集多糖-DT结合物，再经0. 22 y m滤 器除菌过滤，获得24价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液。用注射用水稀释24价肺炎球菌寡 糖-DT结合体原液、磷酸铝、氯化钠、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量分别为结合DT 的各血清型寡糖2 10ii g/ml、磷酸铝1. 0 1. 5mg/ml、氯化钠7. 5 9. 5mg/ml、2-苯氧 乙醇5. 0 6. Omg/ml，pH调至5. 8 7. 2。按吸出量X). 5ml分装西林瓶并封口 。按世界 卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)规定方法和标准进行检定，检定合格后为肺炎球菌寡糖结合疫苗。
本实施例(1)方法与本实施例(2)方法不同之处在于，后者没有超声匀化处理和 戊二醛脱毒处理两个步骤。 (3)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(12价多糖-蛋白结合体+12价多糖-蛋 白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖分为2组；第1组包括1、2、3、4、5、6B、7F、9V、 14、 18C、 19F、23F，第2组包括6A、8、9N、IOA、IIA、 12F、 15B、 17F、 19A、20、22F、33F。分别用注 射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型多糖的12价肺炎球菌 多糖-DT结合体原液，再将此2组不同血清型多糖的12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (4)肺炎球菌24价寡糖结合疫苗的制备(12价寡糖-蛋白结合体+12价寡糖-蛋 白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖分为2组；第1组包括1、2、3、4、6A、6B、7F、 10A、14、18C、20、23F，第2组包括5、8、9N、9V、IIA、 12F、 15B、 17F、 19A、 19F、22F、33F。分别用 注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型寡糖的12价肺炎球 菌寡糖-DT结合体原液，再将此2组不同血清型寡糖的12价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液 按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (5)肺炎球菌24价荚膜糖结合疫苗的制备(12价多糖-蛋白结合体+12价寡 糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜糖分为2组；第1组包括1、2、3、4、5、7F、IOA、IIA、 14、15B、20、23F多糖，第2组包括6A、6B、8、9N、9V、12F、17F、18C、19A、19F、22F、33F寡糖。分
别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1)方法制备一组不同血清型多糖的 12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和另一组不同血清型寡糖的12价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液，再将此2组不同血清型多糖和寡糖的12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和12 价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(6)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(8价多糖-蛋白结合体+8价多糖-蛋白 结合体+8价多糖_蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖分为3组；第1组包括1、3、4、7F、9V、 14、 18C、 19F，第2组包括6A、8、9N、12F、15B、17F、19A、22F，第3组包括2、5、6B、IOA、 11A、20、23F、
33F。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备3组不同血清型多糖的 8价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此3组不同血清型多糖的8价肺炎球菌多糖-DT结 合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (7)肺炎球菌24价寡糖结合疫苗的制备(8价寡糖-蛋白结合体+8价寡糖-蛋白 结合体+8价寡糖_蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖分为3组；第1组包括1、3、4、7F、9N、9V、 18C、 20，第2组包括2、6A、6B、12F、14、15B、17F、22F，第3组包括5、8、IOA、IIA、 19A、 19F、23F、
33F。分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备3组不同血清型寡糖的 8价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此3组不同血清型寡糖的8价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (8)肺炎球菌24价荚膜糖结合疫苗的制备(8价多糖-蛋白结合体+8价寡糖-蛋 白结合体+8价多糖_蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜糖分为3组；第1组包括1、3、4、7F、IOA、IIA、 14、20 多糖，第2组包括6A、6B、9N、9V、18C、19A、19F、23F寡糖，第3组包括2、5、8、 12F、 15B、 17F、
2222F、33F多糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1)方法制备2组不 同血清型多糖的8价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和另一组不同血清型寡糖的8价肺炎球 菌寡糖-DT结合体原液，再将此3组不同血清型多糖和寡糖的8价肺炎球菌多糖-DT结合 体原液和8价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检 定。 (9)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(6价多糖-蛋白结合体+6价多糖-蛋白 结合体+6价多糖_蛋白结合体+6价多糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖分为4组；第1组包括1、3、4、7F、 18C、 19F，第 2组包括6A、8、9N、 12F、 17F、 19A，第3组包括2、9V、 IIA、 14、23F、33F，第4组包括5、6B、 IOA、 15B、20、22F。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备4组不同血清 型多糖的6价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型多糖的6价肺炎球菌 多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(10)肺炎球菌24价寡糖结合疫苗的制备(6价寡糖-蛋白结合体+6价寡糖-蛋 白结合体+6价寡糖_蛋白结合体+6价寡糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜寡糖分为4组；第1组包括3、4、7F、9N、 12F、 18C，第 2组包括5、6A、8、17F、19A、19F，第3组包括2、9V、 IOA、 11A、22F、23F，第4组包括1、6B、14、 15B、20、33F。分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备4组不同血清 型多糖的6价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型寡糖的6价肺炎球菌 寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(11)肺炎球菌24价荚膜糖结合疫苗的制备(6价多糖-蛋白结合体+6价寡糖-蛋 白结合体+6价多糖_蛋白结合体+6价寡糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜糖分为4组；第1组包括1、3、4、 11A、20、33F多糖， 第2组包括6A、6B、 18C、 19A、 19F、23F寡糖，第3组包括2、5、8、 15B、 17F、22F多糖，第4组包 括7F、9N、9V、10A、12F、14寡糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1) 方法制备2组不同血清型多糖的6价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和另2组不同血清型寡 糖的6价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型多糖和寡糖的6价肺炎球 菌多糖-DT结合体原液和6价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫 苗成品并进行检定。 (12)肺炎球菌24价多糖结合疫苗的制备(12价多糖-蛋白结合体+6价多糖-蛋 白结合体+4价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋白结合体) 将月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F纯化荚膜多糖分为4组；第1组包括1、2、3、4、6A、6B、7F、 10A、14、18C、20、23F，第2组包括IIA、 12F、 15B、 17F、22F、33F，第3组包括5、8、9N、9V，第4 组包括19A、19F。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备4组不同血 清型多糖的12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、6价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、4价肺 炎球菌多糖-DT结合体原液和2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型
23多糖的12价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、6价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、4价肺炎球 菌多糖-DT结合体原液和2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫 苗成品并进行检定。 (13)肺炎球菌14价多糖结合疫苗的制备(14价多糖-蛋白结合体)将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜多糖
用注射用水稀释合并，按本实施例(1)方法制备14价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将
此14价肺炎球菌多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 本实施例(1)方法与本实施例(12)方法不同之处在于，后者成品疫苗配制时不添
加2-苯氧乙醇。因此本实施例(12)成品疫苗中不含任何防腐剂。 (14)肺炎球菌14价寡糖结合疫苗的制备(14价寡糖-蛋白结合体)将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡糖
用注射用水稀释合并，按本实施例(1)方法制备14价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将
此14价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 本实施例(1)方法与本实施例(13)方法不同之处在于，后者成品疫苗配制时不添
加2-苯氧乙醇。因此本实施例(13)成品疫苗中不含任何防腐剂。 (15)肺炎球菌14价多糖结合疫苗的制备(7价多糖-蛋白结合体+7价多糖-蛋 白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜多糖 分为2组；第1组包括1、2、3、4、5、9V、23F多糖，第2组包括6A、6B、7F、 14、 18C、 19A、 19F多
糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型多糖的7 价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此2组不同血清型多糖的7价肺炎球菌多糖-DT结 合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (16)肺炎球菌14价寡糖结合疫苗的制备(7价寡糖-蛋白结合体+7价寡糖-蛋 白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡糖 分为2组；第1组包括4、5、7F、9V、14、19A、19F寡糖，第2组包括1、2、3、6A、6B、 18C、23F寡 糖。分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型寡糖的7 价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此2组不同血清型寡糖的7价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (17)肺炎球菌14价荚膜糖结合疫苗的制备(7价多糖-蛋白结合体+7价寡糖-蛋 白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜糖分 为2组；第1组包括1、2、3、4、7F、9V、14多糖，第2组包括5、6A、6B、 18C、 19A、 19F、23F寡糖。 分别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1)方法制备一组不同血清型多糖 的7价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和另一组不同血清型寡糖的7价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液，再将此2组不同血清型多糖和寡糖的7价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和7价 肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(18)肺炎球菌14价多糖结合疫苗的制备(4价多糖-蛋白结合体+4价多糖-蛋 白结合体+4价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋白结合体)
将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜多糖 分为4组；第1组包括1、7F、9V、18C多糖，第2组包括14、 19A、 19F、23F多糖，第3组包括2、 3、4、5多糖，第4组包括6A、6B多糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1) 方法制备3组不同血清型多糖的4价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和1组不同血清型多糖 的2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型多糖的4价肺炎球菌多糖-DT 结合体原液和2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进 行检定。 (19)肺炎球菌14价寡糖结合疫苗的制备(4价寡糖-蛋白结合体+4价寡糖-蛋 白结合体+4价寡糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡糖 分为4组；第1组包括1、3、5、9V寡糖，第2组包括2、7F、18C、23F寡糖，第3组包括4、6A、 6B、 14寡糖，第4组包括19A、 19F寡糖。分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1) 方法制备3组不同血清型寡糖的4价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液和1组不同血清型寡糖 的2价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此4组不同血清型寡糖的4价肺炎球菌寡糖-DT 结合体原液和2价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进 行检定。 (20)肺炎球菌14价荚膜糖结合疫苗的制备(4价多糖-蛋白结合体+4价寡糖-蛋 白结合体+4价多糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜糖分 为4组；第1组包括2、5、7F、23F多糖，第2组包括4、6A、6B、18C寡糖，第3组包括1、3、9V、 14多糖，第4组包括19A、19F寡糖。分别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例 (1)方法制备2组不同血清型多糖的4价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、1组不同血清型寡 糖的4价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液和1组不同血清型寡糖的2价肺炎球菌寡糖-DT结 合体原液，再将此4组不同血清型多糖的4价肺炎球菌多糖-DT结合体原液、4价肺炎球菌 寡糖-DT结合体原液和2价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗 成品并进行检定。 (21)肺炎球菌14价多糖结合疫苗的制备(2价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋 白结合体+2价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋白结合体+2价多糖-蛋白结合体+2价多 糖_蛋白结合体+2价多糖_蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜多糖 分为7组；第1组包括1、9V多糖，第2组包括7F、 18C多糖，第3组包括14、23F多糖，第4 组包括19A、19F多糖，第5组包括2、3多糖，第6组包括4、5多糖，第7组包括6A、6B多糖。 分别用注射用水稀释合并各组多糖，按本实施例(1)方法制备7组不同血清型多糖的2价 肺炎球菌多糖-DT结合体原液，再将此7组不同血清型多糖的2价肺炎球菌多糖-DT结合 体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (22)肺炎球菌14价寡糖结合疫苗的制备(2价寡糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋 白结合体+2价寡糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体+2价寡 糖_蛋白结合体+2价寡糖_蛋白结合体)将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡糖分为7组；第1组包括1、3寡糖，第2组包括5、9V寡糖，第3组包括2、23F寡糖，第4组包 括7F、 18C寡糖，第5组包括6A、6B寡糖，第6组包括4、 14寡糖，第7组包括19A、 19F寡糖。 分别用注射用水稀释合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备7组不同血清型寡糖的2价 肺炎球菌寡糖-DT结合体原液，再将此7组不同血清型寡糖的2价肺炎球菌寡糖-DT结合 体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。 (23)肺炎球菌14价荚膜糖结合疫苗的制备(2价多糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋 白结合体+2价多糖-蛋白结合体+2价寡糖-蛋白结合体2价多糖-蛋白结合体+2价寡 糖_蛋白结合体+2价多糖_蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜糖分 为7组；第1组包括2、23F多糖，第2组包括6A、6B寡糖，第3组包括5、7F多糖，第4组包 括4、 18C寡糖，第5组包括9V、 14多糖，第6组包括19A、 19F寡糖，第7组包括1、3多糖。分 别用注射用水稀释合并各组多糖和寡糖，按本实施例(1)方法制备4组不同血清型多糖的 2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和3组不同血清型寡糖的2价肺炎球菌寡糖-DT结合体 原液，再将此7组不同血清型多糖的2价肺炎球菌多糖-DT结合体原液和2价肺炎球菌寡 糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品并进行检定。
(24)肺炎脑膜炎联合疫苗的制备(15价多糖蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、4、5、6A、6B、9V、 14、 18C、 19A、 19F、23F纯化荚膜多糖和脑膜 炎球菌A群、C群、W135群、Y群纯化荚膜多糖用注射用水稀释合并，按本实施例(1)方法制 备15价多糖-DT结合体原液，再将此15价多糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成 疫苗成品。按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)和脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO BS 06.2041， 2006 ;WH0 TechnicalR印ort Series, No. 924， 2004)规定方法和标准进行检定。
(25)肺炎脑膜炎Hib联合疫苗的制备(17价寡糖蛋白结合体)
将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡 糖、脑膜炎球菌A群纯化荚膜寡糖、脑膜炎球菌C群纯化荚膜寡糖、b型流感嗜血杆菌纯化 荚膜寡糖用注射用水稀释合并，按本实施例(1)方法制备17价寡糖-DT结合体原液，再将 此17价寡糖-DT结合体原液按本实施例(1)方法配制成疫苗成品。按世界卫生组织正式 颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005) 和脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHO BS 06. 2041,2006 ;WHO Technical R印ort Series, No. 924,2004)及b型流感嗜血杆菌结合疫苗制造及检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 897,2000)规定方法和标准进行检定。 (26)肺炎脑膜炎Hib联合疫苗的制备(7价寡糖-蛋白结合体+7价寡糖-蛋白结 合体+5价寡糖-蛋白结合体) 将肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化荚膜寡 糖、脑膜炎球菌A群纯化荚膜寡糖、脑膜炎球菌C群纯化荚膜寡糖、脑膜炎球菌W135群纯化 荚膜寡糖、脑膜炎球菌Y群纯化荚膜寡糖、b型流感嗜血杆菌纯化荚膜寡糖分为3组；第1 组包括4、5、7F、9V、14、19A、19F寡糖，第2组包括1、2、3、6A、6B、 18C、23F寡糖，第3组包括 脑膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群寡糖和b型流感嗜血杆菌寡糖。分别用注射用水稀释 合并各组寡糖，按本实施例(1)方法制备2组不同血清型寡糖的7价肺炎球菌寡糖-DT结
26合体原液和1组不同血型(群)的5价脑膜炎Hib寡糖-DT结合体原液，再将此3组不同 血清型寡糖的7价肺炎球菌寡糖-DT结合体原液和5价脑膜炎Hib寡糖-DT结合体原液按 本实施例(1)方法配制成疫苗成品。按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及 检定规程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)和脑膜炎球菌结合疫苗制造及检 定规程(WHO BS 06.2041,2006 ;WHO TechnicalR印ort Series, No. 924， 2004)及b型流感 嗜血杆菌结合疫苗制造及检定规程(WHOTechnical R印ort Series, No. 897,2000)规定方 法和标准进行检定。 实施例6结合疫苗特异性毒性检查 对实施例5所制备的26种疫苗取样分别等量合并成26份样品，每份样品选用体 重250 350g豚鼠4只，每只腹侧皮下注射样品2. 5ml，观察30天，记录体重变化。结果显 示所有样品注射局部无坏死、无脱皮、无脱毛，无晚期麻痹症状，每只豚鼠体重比注射前均 有增加。说明本发明制备的26种结合疫苗所使用的白喉类毒素载体经过结合工艺处理后 没有发生白喉毒素特异性毒性反应，也没有出现毒性逆转现象。
实施例7结合疫苗安全性检查 对实施例5所制备的26种疫苗取样，每份样品分别选用体重18 22g小鼠5只 和体重250 350g豚鼠2只，每只小鼠腹腔注射样品0. 5ml，每只豚鼠腹腔注射5. 0ml，观 察7天，记录体重变化。结果显示观察期内所有小鼠、豚鼠均键存，且无异常反应，到期时每 只小鼠、豚鼠体重比注射前均有增加。说明本发明制备的26种疫苗中没有污染外源性毒性 物质，也没有存在意外的不安全因子。
实施例8结合疫苗免疫原性测定 取实施例5制备的26种疫苗、肺炎球菌24个血清型多糖、脑膜炎球菌各血清群多 糖、Hib多糖和生理氯化钠溶液腹腔免疫体重12 14g的NIH小鼠，每一样品按照0、14、 28天程序免疫10只小鼠3针。结合疫苗组免疫剂量为所含各血清型(群)荚膜糖2 10 ii g/0. 5ml/次，多糖组免疫剂量与疫苗组所含各血清型(群)荚膜糖等量。初免后第35 天采血，分离血清。用ELISA方法测定抗体GMT值。将各血清型(群)多糖包被于96孔酶 标板，置2 『C过夜。封闭后，加入系列稀释的待测血清样品，37t:反应45分钟。再加入 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG于37t:反应45分钟，最后加入底物四甲基联苯胺，于暗 处显色15分钟，用终止液终止反应。在酶标仪上测定，计算血清抗体GMT。结果显示疫苗 所含各血清型(群)荚膜糖较单独多糖GMT有显著性增长。其中，肺炎球菌各血清型多糖 GMT为23 75，肺炎球菌结合疫苗中所含各血清型荚膜糖GMT为1864 8053。表1、表2 列举了其中几个疫苗免疫原性GMT测定数据。 综上所述，说明本发明制备的由2价荚膜糖_蛋白结合体和/或多价荚膜糖_蛋
白结合体组成的肺炎球菌荚膜糖结合疫苗及其与脑膜炎球菌、Hib组成的细菌联合结合疫
苗具有良好的安全性和免疫原性。
表l.肺炎球菌结合疫苗免疫原性测定结果
疫苗 代码
小鼠血清抗肺炎球菌各型荚膜糖抗体滴度(lgG GM'1')
4
6A 6B 7F
8
9N 9V 1 OA11A 12F 14 15B 17F 18C 19A 19F 20 22F 23F 3 3 F
(3) 3446 3046 5246 2735 4843 2054 2213 6845 2532 3786 4218 7263 3944 5446 5760 2256 5064 2484 4432 3049 6325 3354 2413 3286 (11) 2324 2430 6672 2014 5772 2588 簡 5327 3249 4012 3506 6337 4387 5962 7081 3562 3855 2916 3687 351S 5623 2996 2016 2424 (18) 4076 2683 4322 3247 4262 2857 2443 5126 3264 5735 2785 3775 3258 2576
(22) 3182 3514 5074 2695 4608 2283 2739 5724
肺炎 多糖
35
314533 57
27 72
44
郁
52 48
65
6057 2017 4273 3942 2947
5462552446263859663429 32
表2.细菌荚膜糖蛋白结合疫苗免疫原性测定结果
疫苗 代码
小鼠血淸抗细菌荚膜糖抗体滴度(lgGGMT)
6A
6B
7F
9V
14
18C
19A
19F
23F
A
C
Hib
(25)
细菌 多糖
2071 1946 3854 3538 3157 2173 2086 2642 2904 4536 3187 3521 4017 2653 1742 2037 1264
35 31 45 33 57 36 27 -72 48 55 26 38 59 29 25 21 1权利要求
一种肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原包括2价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体，所述2价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体是指两个不同的血清型荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，蛋白载体通过化学键将此两个不同血清型荚膜糖链接在一起，两个不同的血清型荚膜糖依据与蛋白载体的化学键结合在结构上形成链接；所述多价血清型荚膜糖-蛋白结合体是指多个不同的血清型荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，蛋白载体通过化学键将此多个不同的血清型荚膜糖链接在一起，多个不同血清型荚膜糖依据与蛋白载体的化学键结合在结构上形成链接。
2. 根据权利要求1所述的肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原包括一个或两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体。
3. 根据权利要求2所述的肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体是指两个或两个以上的荚膜糖_蛋白结合体分别含有相等价数的血清型荚膜糖，并且其价数均介于2 45之间。
4. 根据权利要求2所述的肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述两个或两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体是指两个或两个以上的荚膜糖_蛋白结合体分别含有不相等价数的血清型荚膜糖，并且其价数均介于2 45之间。
5. 根据权利要求2所述的肺炎球菌结合疫苗，其特征在于，所述两个以上2 45价血清型荚膜糖_蛋白结合体是指两个以上的荚膜糖_蛋白结合体分别含有相等和不相等价数的血清型荚膜糖，并且其价数均介于2 45之间。
6. —种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些不同细菌血清型(群)的荚膜糖与蛋白载体进行化学结合，以2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。
7. —种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌A群、C群荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些不同细菌血清型(群)的荚膜糖与蛋白载体进行化学结合，以2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中。
8. —种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖，这些肺炎球菌不同血清型的荚膜糖以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中；这些脑膜炎球菌不同血清群的荚膜糖以4价血清群荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中；所述b型流感嗜血杆菌的荚膜糖以单价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。
9. 一种肺炎球菌_脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗抗原包括肺炎球菌多个血清型荚膜糖、脑膜炎球菌A群、C群荚膜糖和b型流感嗜血杆菌荚膜糖；这些肺炎球菌不同血清型的荚膜糖以2价血清型荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中；这些脑膜炎球菌不同血清群的荚膜糖以2价血清群荚膜糖-蛋白结合体形式存在于疫苗中；所述b型流感嗜血杆菌的荚膜糖以单价血清型荚膜糖_蛋白结合体形式存在于疫苗中。
10. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型荚膜糖选自肺炎球菌全部血清型菌株制备的荚膜糖。
11. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型荚膜糖选自肺炎球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株制备的荚膜糖。
12. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型荚膜糖选自肺炎球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型菌株制备的荚膜糖。
13. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型荚膜糖选自流行病学流行优势血清型菌株制备的荚膜糖。
14. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述蛋白载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素无毒变异体、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌表面粘附素A、肺炎球菌溶血素、流感嗜血杆菌D蛋白、百日咳毒素、霍乱毒素、结核菌素纯蛋白衍生物、铜绿假单胞菌外毒素A、匙孔血蓝蛋白。
15. 根据权利要求1-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述蛋白载体为来源于肺炎球菌的蛋白PspA、 PsaA、 Ply合并而成的肺炎球菌蛋白复合物。
16. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，成品疫苗每一血清型(群)荚膜糖剂量为0.1 50iig。
17. 根据权利要求1-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，成品疫苗包含佐剂。
18. 根据权利要求17所述的结合疫苗，其特征在于，所述佐剂选自铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素B亚单位、皁角素Q21、类脂体、单磷酸类脂A、MF59、大肠杆菌不耐热毒素。
19. 根据权利要求18所述的结合疫苗，其特征在于，所述的铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。
20. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，成品疫苗不含任何防腐剂。
21. 根据权利要求l-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，成品疫苗包含选自硫柳汞、2-苯氧乙醇、苯甲醇的防腐剂。
22. 根据权利要求1-9任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体中的荚膜糖是荚膜多糖和/或荚膜寡糖；所述的多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体中的荚膜糖是荚膜多糖和/或荚膜寡糖。
23. —种制备含有2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤a) 从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型(群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖；b) 将步骤a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群)的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖；c) 将步骤b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合并纯化，制成2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体抗原；d)将步骤c)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。
24. —种制备含有2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体的细菌荚膜糖结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤a) 从不同血清型(群)细菌培养物中分别提取、纯化荚膜糖，制成单一血清型(群)荚膜糖，即单价血清型(群)荚膜糖；b) 将步骤a)所得的单价血清型(群)荚膜糖按两个或两个以上血清型(群)的荚膜糖依据比例合并，成为2价或多价血清型(群)荚膜糖，其中，所述荚膜糖合并后进一步经匀化处理；c) 将步骤b)的2价或多价血清型(群)荚膜糖与蛋白载体进行化学键结合，制成2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原；d) 将步骤c)的产物脱毒处理并纯化制成2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原；e) 将步骤d)的2价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原和/或多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体抗原配制成疫苗。
25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中，所述细菌选自肺炎球菌、脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌、葡萄球菌、B群链球菌。
26. 根据权利要求23或24所述方法，不同血清型(群)荚膜糖相互间合并重量比为1 : 0. 05 20 (w/w)。
27. 根据权利要求23或24所述的方法，其中所述的2价血清型(群)荚膜糖-蛋白结合体中的荚膜糖是荚膜多糖和/或荚膜寡糖；所述的多价血清型(群)荚膜糖_蛋白结合体中的荚膜糖是荚膜多糖和/或荚膜寡糖。
全文摘要
本发明涉及一种含有2价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体和/或多价血清型肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合体的新型肺炎球菌结合疫苗及其制备方法。所述2价血清型荚膜糖-蛋白结合体是指两个不同血清型荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，这两个不同血清型荚膜糖依据与蛋白载体的化学键结合在结构上形成链接。所述多价血清型荚膜糖-蛋白结合体是指多个不同血清型荚膜糖与蛋白载体经化学键结合形成的结合物，这些多个不同血清型荚膜糖依据与蛋白载体的化学键结合在结构上形成链接。另外，本发明还提供了制备细菌荚膜糖-蛋白结合疫苗的方法。
文档编号A61K39/112GK101785857SQ20101012940
公开日2010年7月28日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者郑玉清 申请人:郑玉清
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