新的人心肌特异的蛋白激酶及其编码序列的制作方法
专利名称：新的人心肌特异的蛋白激酶及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明为一个与心肌细胞收缩、能量代谢、二恶英(dioxin)受体信号传导通路有关的基因/蛋白p93，涉及生物医学高技术中心血管病相关新基因的克隆及其蛋白的开发与应用领域。
心肌病是由心脏疾病导致死亡的一个重要死因。心肌病是指仅累及心肌细胞本身的一类心脏疾病，从功能上可分三类①扩张性②肥厚性③限制性。近年来研究发现，家族性心肌病的疾病基因有以下两类①与心肌能量代谢有关的基因，包括参与脂肪酸氧化和线粒体氧化磷酸化的酶。②与心肌肌小节收缩蛋白和细胞骨架蛋白有关的基因。而且，肥厚性心肌病主要与肌小节组分突变有关，扩张性心肌病主要与肌小节和细胞骨架组分有关。
大部分心肌病是继发性的，在对由心肌肥大引起的继发性心肌病的研究中，发现了包括β-肾上腺素受体、MAPK级联等在内的一系列可引发心肌肥大的信号传导通路。然而阐明由肌小节收缩蛋白和/或细胞骨架缺陷引起的心肌病对进一步阐明继发性心肌肥大非常关键，因为这些机制才是导致典型的心肌肥大最重要的机制，所以研究肌小节、细胞骨架、心肌能量代谢信号传导通路缺陷引发心肌肥大成为当前心血管病分子生物学研究的热点、难点。
先天性心脏病是另外一类与心脏发育有关的先天性畸形。研究发现90％的先心病属多因素遗传(即遗传和环境因素相互作用)，除遗传因素外，诸如风疹、饮酒、反应停、三甲双酮等许多环境因素(即所谓致畸因子)可导致胎儿心血管发育畸形。心脏的正常发育受一系列信号传导通路的精确调控，其通路中任何一个环节—包括通路本身基因突变和外界致畸因子影响，都有可能导致先天性心脏病的发生。
芳香烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor，AhR)，又称二恶英(dioxin)受体，是一类在进化上高度保守的、结构上与果蝇的发育调节因子Sim及Per有共同特征的转录因子，可诱导一系列包括细胞色素P450、已醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)、苯醌还原酶(quinone reductase)在内的各种药物代谢酶基因的表达，并主要参与对外界致畸因子反应的信号传导通路。对先心病的遗传学研究发现，作为环境致畸因子的受体，二恶英受体参与了心脏发育和心肌病的发生。对鸡胚胎心脏发生的研究表明，作为AhR外源配基，环境致畸因子2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)可诱导心肌肥大和心脏间隔缺损的发生；敲除AhR基因的小鼠，全部出现伴有心肌肥大和局部纤维化的心肌疾病。然而作为孤儿受体，由AhR介导的这些信号传导通路尚未阐明。
发明目的克隆鉴定上述信号传导通路中的关键激酶p93，阐明其在心脏发育、心肌病等心脏疾病中的重要作用，从而为心血管病的诊断和治疗提供新的思路。内容与要求应用生物信息学、cDNA文库构建、DNA序列测定、分子克隆、Northern Blot、Dot Blot、基因免疫、原核和真核蛋白表达与纯化、激酶活性体外分析、酵母双杂交技术等，克隆编码p93蛋白的新基因全长cDNA，获知其在核酸水平的表达谱，获得该基因的兔源多克隆抗体和有活性的目标蛋白，通过酵母双杂交寻找与其相互作用的蛋白，以阐明目标蛋白的信号传导通路和功能。该基因/蛋白达到的技术指标为1.p93的cDNA全长约3400bp，相应编码的蛋白质有845aa。2.p93的编码蛋白含3个蛋白结构域，N端为锚蛋白重复(ankyrin repeats)结构域，靠近C端有一激酶结构域，C末端为富含丝氨酸结构域(ser-rich)。3.该基因在心肌细胞特异表达。4.该基因编码蛋白的激酶结构域具有激酶的自我磷酸化活性。5.该基因编码蛋白的富含丝氨酸结构域能与下列三类蛋白发生相互作用①肌小节蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin；②转录因子芳香烃受体(ArylHydrocarbon Receptor，AhR)复合物组分芳香烃受体相互作用蛋白(aryl hydrocarbonreceptor-interacting protein，ALP)；③心肌脂肪酸结合蛋白3(H-FABP3)和心肌线粒体参与脂肪酸β-氧化的羟脂酰CoA脱氢酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亚单位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzyme Athiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase，beta subunit)。6.由酵母双杂交结果提示，该基因及其编码的蛋白与心肌细胞收缩、能量代谢和二恶英受体信号传导通路有关，该基因及其编码蛋白与心脏发育、心肌病和心力衰竭等心脏疾病密切相关，可用于心脏疾病的基因诊断和基因治疗，还可用于新药的设计与开发。
提取纯化正常成人心脏mRNA，构建高质量的cDNA文库。cDNA文库铺盘(200-500个克隆/150mm盘)，挑取单个噬菌斑转入含有500μl SM缓冲液和20μl氯仿的灭菌离心管中。室温置2h后震摇，短暂离心后，取5μl上清，应用插入片段两端的载体引物进行PCR扩增。反应总体积为50μl，扩增参数为94℃，3min，再94℃5min，57℃30sec，72℃3min，共进行30个循环后，再72℃3min。每个PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定质量后，取2μl的PCR产物，用荧光素标记的cDNA 5’端载体引物进行测序PCR扩增反应。反应总体积为8μl，扩增参数为94℃，2min后，94℃30sec，50℃15sec，72℃1min，进行20个循环，再94℃，30sec，72℃1min，15个循环，最后72℃5min。PCR反应结束，取6μl用自动测序仪(PharmaciaALFDNA Sequencer)进行ESTs序列测定。ESTs测序结果用美国国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)软件，将每个cDNA克隆的EST与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较分析。根据分析结果，将相应的ZAP噬菌体克隆环化为pBK-CMV质粒，扩增后应用QIAGEN公司的″QIAprep Spin Miniprep Kit″提取质粒DNA，在ABI377自动测序仪上进行序列测定。2.分离编码p93的全长克隆在EST大规模测序中，发现来自克隆H498的EST序列含有与ILK相似的锚蛋白重复及激酶结构域，随后将含H498 cDNA的pBK-CMV噬菌体通过ExAssist/XLOLR辅助噬菌体系统(Stratagene)从ZAP表达载体中切出。具体步骤取250μl ZAP噬菌体，1μl辅助噬菌体(ExAssist helper phage)共感染感受态的XL1-Blue MRF宿主菌，37℃培养15min.后，加3ml NZY液体培养基，37℃再培养2.5-3hr，65℃-70℃加热20min.，于4℃离心(1000×g，15min.)。取含pBluescript phagemid的上清100μl转化200μl感受态的XLOLR。37℃温育15min.后，加300μl NZY液体培养基，再37℃培养45min.，涂布卡那抗性LB培养盘，37℃过夜。挑取单克隆，碱裂解法提取质粒，H498克隆序列全长经ABI377自动测序仪测定。3.新全长cDNAs的生物信息学分析ESTs测序结果的同源性比较采用NCBI的BLAST软件，核酸数据库为GenBank(Release124.0)/EMBL(Release 67)/DDBJ(Release 45)。在得到H498克隆全长cDNA后作进一步分析时，通过SRS(Version 6.0.7.3)查询SWISS-PROT(Release 39.22)、TrEMBL(Release 17.0)。氨基酸序列多重排列采用Clustal X软件。结构域分析采用瑞士专家蛋白分析系统(ExPASy)的PROSITE数据库(Release 17.0)和EMBL的SMART软件(version 3.3)。PCR引物设计采用Informax，Inc的Vector NTITMSuite软件包。4.胎儿、成人Northern blot和76种组织的多组织点阵分布分析提取环化质粒pBK-CMV-p93，经NotI、EcoRI双酶切，以获得的p93全长cDNA作为模板，应用“Prime-a-Gene Labeling System”(Promega)随机引物试剂盒进行探针标记。胎儿多组织杂交膜的制备提取8个月流产胎儿骨骼肌、脑、心脏、肝脏、肺和肾脏等6种组织的总RNA，经紫外分光光度计定量后，每个泳道上样量为30μg，甲醛变性胶电泳、转移并固定至尼龙膜，同常规。成人多组织杂交膜(MTNTM)(Clontech)及其含76种组织MTETM(Clontech)进行了多组织点阵分布分析，操作按说明书进行。5.多克隆抗体的制备及鉴定为原核表达p93，设计5’引物CTGGATCCAAATGGGAAATTATAAATCTAGACC，3’引物CGTCGACTGTCGTAAGCCCGCCGGCGAT，其中5’和3’引物分别含BamH I和EcoR I酶切位点。以含p93的pBK-CMV质粒为模板，用pfuTurboTM DNA聚合酶(Stratagene)将p93全编码框克隆入原核表达载体pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia)。经测序验证所有构建子读码框正确无误，PCR也未引入新的突变后，将pGEX-p93导入大肠杆菌BL21中进行原核表达，其表达蛋白用于检测核酸免疫法制备的多克隆抗体的效价及特异性。
用BamH I和EcoR I将p93编码框从载体pGEX-5X-1中切出，直接亚克隆至pSecTag(Invitrogen)，构建成真核表达载体pSecTag-p93。碱裂解法大量提取质粒约3mg，经PEG纯化后，分三次用电针介导免疫家兔，每次间隔约两周，第三次免疫后8天取抗血清，用Western blot方法和原核表达的细菌总蛋白(含p93蛋白)检测免疫前后的家兔血清。6.免疫组化取8个月流产胎儿心脏组织及猝死的正常成人心脏组织进行石蜡切片。置切片于3％H2O2中10min，灭活内源性过氧化物酶。抗原修复采用双暴露法，先用拘橼酸修复液(pH8.0)于微波炉煮30min，降至室温后，再用0.1％Trypsin消化30min.10％血清封闭。以二步法行抗体标记，用抗体稀释液(美国Zymed)以1∶20稀释的p93抗血清覆盖切片，4℃过夜，直接加二抗、三抗混合的PictureTM工作液，室温1hr，行DAB染色8-10min。Hrarris苏木素浅染细胞核，脱水，封片。7.p93在COS-7真核细胞中的表达及其活性分析用BamH I和EcoR I将p93全编码框从载体pGEX-5X-p93中切出，直接亚克隆至真核表达载体pcDNA4/HisMax(A)(Invitrogen)构建成真核表达载体pcDNA4-p93。pcDNA4含有6×His以备纯化和XpressTMEpitope以备用抗体检测。用于真核细胞转染的质粒经CsCl超速离心纯化，并用脂质体Lipofectamine(Gibco BRL)或DOSPER(Roche)介导转染COS-7细胞。为了检测蛋白表达，细胞溶于含1％SDS和10mM EDTA的10mM Tris缓冲液(pH7.4)中。抗体为Anti-XpressTM单抗(Stratagene)。用ECL法(enhanced chemiluminescence)检测Westernblot结果，Luminol试剂购自Santa Cruz。
瞬时转染后2-3天，COS-7细胞用胰酶消化，离心(1000×g，1min)收集细胞。每106-107个细胞用1ml冰预冷的1×结合缓冲液洗两次。结合缓冲液的制备如下0.5M NaCl，20mMTrisHCl pH7.9，5mM咪唑。细胞沉淀存于-70℃备用或准备裂解。将1×107个COS-7细胞溶于1ml裂解液中。裂解缓冲液的制备如下0.5M NaCl，20mM Tris HCl pH7.9，5mM咪唑，10％甘油，1％Triton X-100，不含EDTA的完全性蛋白酶抑制剂混合物一片(Roche)(complete，mini，EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets)，1mM PMSF，5mMβ-巯基乙醇；将溶液存于-70℃ 1min或于4℃放30min。随后于4℃离心(10,000×g，30min)，移去细胞破碎物，上清用于纯化蛋白。取50μl含20％乙醇的50％ProBondTMResin(Invitrogen)悬液，先用60μl的裂解液预湿，后将上清加至Resin，于4℃振荡1-3hr。为分析激酶活性，在30μl体系中将纯化蛋白与激酶缓冲液进行反应。激酶缓冲液配制如下20mM Tris HCl，pH7.0，10mM MnCl2，10mM MgCl2，2mM NaF，1mM Na3VO4，1-2mM DTT，10μCi[γ-32P]ATP，反应在30℃进行，30min。将反应样品加Laemmli’s上样缓冲液煮沸，6％SDS-PAGE电泳。蛋白转移至NC膜并经放射自显影。8.酵母双杂交筛选构建pGBKT7-Ser-rich诱饵载体，首先确证其对酵母无毒性作用，随后分析转化子在His、Ade中的背景生长和对MEL1的激活，确证该构建子不会激活报告基因。于30℃倒置培养3-5天以使二倍体细胞形成可见克隆，计数培养板上的克隆，计算交配效率。
筛库过程准备浓缩的AH109[pGBKT7-Ser-rich]过夜培养物，将其与1ml预转化心脏cDNA文库于2-L灭菌flask中，于30℃ 30-50rpm轻轻振荡20-24hr。次日将交配混合物移至一灭菌的100ml离心管，1000×g离心10min沉淀细胞，随后用2×YPDA/kan冲洗交配用flask二次，每次50ml。用两次冲洗液悬浮最初得到的细胞团块，再次1000×g离心10min沉淀细胞。于10ml 0.5×YPDA/kan中悬浮细胞团块，测量细胞+培养基的总体积。取5μl文库交配混合物，用0.5×YPDA/kan稀释后于SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp培养板分别铺100μl的1∶104、1∶102稀释的交配混合物以测知交配效率。将剩余的交配混合物铺于50个大的(150mm)SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)培养板，每盘200μl。于30℃倒置培养8-21天直至克隆出现。在8-21天酵母生长过程中，逐步将阳性克隆挑至QDO网格盘，30℃生长1-2天后，依据克隆数多少，设立时间点进行印膜β-gal检测初筛，将阳性克隆于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp盘上再次划线2次后，将阳性克隆挑至QDO网格盘，30℃生长2天，依据克隆数多少，设立时间点进行印膜β-gal检测进行再次筛选。
文库滴定将5μl文库稀释104后涂布于SD/-Leu板，倒置平板于30℃孵育3-5天计算所含的克隆数及其文库滴度。
计算酵母交配的效率和筛选的克隆数依据生长于SD/-Leu，SD/-Leu/-Trp培养皿中的克隆数计算交配效率，结合文库滴度计算所筛选的克隆数。
阳性克隆归类从酵母中分离质粒DNA，通过转化电感受态DH5α以获得阳性克隆质粒，PCR扩增AD/library插入子，并分别用Alu I和Hae III单酶切，电泳分析PCR及其酶切产物大小。
酵母体内再验证将所有欲检测的AD/library和AD质粒转化AH109，铺于SD/-Leu培养基，阴性对照质粒pGBKT7-Lam转化Y187，铺于SD/-Trp培养基，待上述克隆生长后，分别挑至SD网格盘进行划线交配。将阴性克隆挑至SD/-Leu/-Trp培养盘，实验组及其阳性对照克隆挑至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养盘，30℃生长4-5天，进行印膜β-gal检测。
权利要求
1.本发明涉及一个心肌特异表达的蛋白激酶p93，包括该基因的cDNA序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。其特征在于p93的cDNA全长约3400bp，相应编码蛋白质有845aa。
2.根据权利要求1所述之p93基因/蛋白，其特征在于该蛋白含3个蛋白结构域，N端为锚蛋白重复(ankyrin repeats)结构域，靠近C端有一激酶结构域，C末端为富含丝氨酸结构域(ser-rich)。
3.根据权利要求1、2所述之p93蛋白/基因，其特征在于其激酶结构域具有激酶活性。
4.根据权利要求1、2所述之p93蛋白/基因，其特征在于富含丝氨酸的C-末端可以与肌小节蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin、转录因子芳香烃受体(ArylHydrocarbon Receptor，AhR)复合物组分芳香烃受体相互作用蛋白(aryl hydrocarbonreceptor-interacting protein，AIP)、心肌脂肪酸结合蛋白3(H-FABP3)和心肌线粒体参与脂肪酸β-氧化的羟脂酰CoA脱氢酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亚单位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzyme A thiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase，βsubunit)发生特异而直接的相互作用。
5.根据权利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通过与肌小节蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin发生相互作用而调节心肌细胞收缩。
6.根据权利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通过与芳香烃受体复合物组分相互作用而参与对心肌细胞异源生物素代谢(xenobiotic metabolism)酶基因转录的调控。
7.根据权利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通过与心肌脂肪酸结合蛋白3和心肌线粒体参与脂肪酸β-氧化的羟脂酰CoA脱氢酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亚单位相互作用而参与调节心肌细胞的能量代谢。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7所述之p93基因/蛋白，其特征在于该基因及其编码蛋白与心脏发育、心肌病和心力衰竭等许多心脏疾病密切相关，可用于心脏疾病的基因诊断和基因治疗，还可用于新药的设计与开发。
全文摘要
本发明涉及一个在心肌特异表达的、与肌小节蛋白cTnI、MyBP－C、心肌α－actin、成人骨骼肌α－actin、转录因子芳香烃受体复合物组分AIP、心肌脂肪酸结合蛋白3和心肌线粒体参与脂肪酸β－氧化的羟脂酰CoA脱氢酶/3－酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亚单位相互作用的新蛋白激酶基因/蛋白p93，包括其cDNA序列、编码蛋白质的氨基酸序列及组织、细胞定位和激酶活性测定。p93蛋白能通过和上述肌小节蛋白的相互作用调节心肌细胞收缩；通过与心肌脂肪酸结合蛋白和线粒体参与脂肪酸β－氧化的酶相互作用以调控心肌细胞的能量代谢；通过与AIP参与二恶英受体信号传导通路，并调控心肌细胞色素氧化酶P450IA1、450IA2、己醛脱氢酶、苯醌还原酶等各种药物代谢的酶基因转录。通过以上作用从而参与了心脏发育、心肌病、心衰等心脏疾病的发生。
文档编号A61K38/43GK1445366SQ0210373
公开日2003年10月1日 申请日期2002年3月15日 优先权日2002年3月15日
发明者丁金凤, 赵勇, 孟宪敏, 赵秀文, 刘冬青, 曹慧青 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院
技术领域：
本发明为一个与心肌细胞收缩、能量代谢、二恶英(dioxin)受体信号传导通路有关的基因/蛋白p93，涉及生物医学高技术中心血管病相关新基因的克隆及其蛋白的开发与应用领域。
心肌病是由心脏疾病导致死亡的一个重要死因。心肌病是指仅累及心肌细胞本身的一类心脏疾病，从功能上可分三类①扩张性②肥厚性③限制性。近年来研究发现，家族性心肌病的疾病基因有以下两类①与心肌能量代谢有关的基因，包括参与脂肪酸氧化和线粒体氧化磷酸化的酶。②与心肌肌小节收缩蛋白和细胞骨架蛋白有关的基因。而且，肥厚性心肌病主要与肌小节组分突变有关，扩张性心肌病主要与肌小节和细胞骨架组分有关。
大部分心肌病是继发性的，在对由心肌肥大引起的继发性心肌病的研究中，发现了包括β-肾上腺素受体、MAPK级联等在内的一系列可引发心肌肥大的信号传导通路。然而阐明由肌小节收缩蛋白和/或细胞骨架缺陷引起的心肌病对进一步阐明继发性心肌肥大非常关键，因为这些机制才是导致典型的心肌肥大最重要的机制，所以研究肌小节、细胞骨架、心肌能量代谢信号传导通路缺陷引发心肌肥大成为当前心血管病分子生物学研究的热点、难点。
先天性心脏病是另外一类与心脏发育有关的先天性畸形。研究发现90％的先心病属多因素遗传(即遗传和环境因素相互作用)，除遗传因素外，诸如风疹、饮酒、反应停、三甲双酮等许多环境因素(即所谓致畸因子)可导致胎儿心血管发育畸形。心脏的正常发育受一系列信号传导通路的精确调控，其通路中任何一个环节—包括通路本身基因突变和外界致畸因子影响，都有可能导致先天性心脏病的发生。
芳香烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor，AhR)，又称二恶英(dioxin)受体，是一类在进化上高度保守的、结构上与果蝇的发育调节因子Sim及Per有共同特征的转录因子，可诱导一系列包括细胞色素P450、已醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)、苯醌还原酶(quinone reductase)在内的各种药物代谢酶基因的表达，并主要参与对外界致畸因子反应的信号传导通路。对先心病的遗传学研究发现，作为环境致畸因子的受体，二恶英受体参与了心脏发育和心肌病的发生。对鸡胚胎心脏发生的研究表明，作为AhR外源配基，环境致畸因子2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)可诱导心肌肥大和心脏间隔缺损的发生；敲除AhR基因的小鼠，全部出现伴有心肌肥大和局部纤维化的心肌疾病。然而作为孤儿受体，由AhR介导的这些信号传导通路尚未阐明。
发明目的克隆鉴定上述信号传导通路中的关键激酶p93，阐明其在心脏发育、心肌病等心脏疾病中的重要作用，从而为心血管病的诊断和治疗提供新的思路。内容与要求应用生物信息学、cDNA文库构建、DNA序列测定、分子克隆、Northern Blot、Dot Blot、基因免疫、原核和真核蛋白表达与纯化、激酶活性体外分析、酵母双杂交技术等，克隆编码p93蛋白的新基因全长cDNA，获知其在核酸水平的表达谱，获得该基因的兔源多克隆抗体和有活性的目标蛋白，通过酵母双杂交寻找与其相互作用的蛋白，以阐明目标蛋白的信号传导通路和功能。该基因/蛋白达到的技术指标为1.p93的cDNA全长约3400bp，相应编码的蛋白质有845aa。2.p93的编码蛋白含3个蛋白结构域，N端为锚蛋白重复(ankyrin repeats)结构域，靠近C端有一激酶结构域，C末端为富含丝氨酸结构域(ser-rich)。3.该基因在心肌细胞特异表达。4.该基因编码蛋白的激酶结构域具有激酶的自我磷酸化活性。5.该基因编码蛋白的富含丝氨酸结构域能与下列三类蛋白发生相互作用①肌小节蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin；②转录因子芳香烃受体(ArylHydrocarbon Receptor，AhR)复合物组分芳香烃受体相互作用蛋白(aryl hydrocarbonreceptor-interacting protein，ALP)；③心肌脂肪酸结合蛋白3(H-FABP3)和心肌线粒体参与脂肪酸β-氧化的羟脂酰CoA脱氢酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亚单位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzyme Athiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase，beta subunit)。6.由酵母双杂交结果提示，该基因及其编码的蛋白与心肌细胞收缩、能量代谢和二恶英受体信号传导通路有关，该基因及其编码蛋白与心脏发育、心肌病和心力衰竭等心脏疾病密切相关，可用于心脏疾病的基因诊断和基因治疗，还可用于新药的设计与开发。
提取纯化正常成人心脏mRNA，构建高质量的cDNA文库。cDNA文库铺盘(200-500个克隆/150mm盘)，挑取单个噬菌斑转入含有500μl SM缓冲液和20μl氯仿的灭菌离心管中。室温置2h后震摇，短暂离心后，取5μl上清，应用插入片段两端的载体引物进行PCR扩增。反应总体积为50μl，扩增参数为94℃，3min，再94℃5min，57℃30sec，72℃3min，共进行30个循环后，再72℃3min。每个PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定质量后，取2μl的PCR产物，用荧光素标记的cDNA 5’端载体引物进行测序PCR扩增反应。反应总体积为8μl，扩增参数为94℃，2min后，94℃30sec，50℃15sec，72℃1min，进行20个循环，再94℃，30sec，72℃1min，15个循环，最后72℃5min。PCR反应结束，取6μl用自动测序仪(PharmaciaALFDNA Sequencer)进行ESTs序列测定。ESTs测序结果用美国国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)软件，将每个cDNA克隆的EST与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较分析。根据分析结果，将相应的ZAP噬菌体克隆环化为pBK-CMV质粒，扩增后应用QIAGEN公司的″QIAprep Spin Miniprep Kit″提取质粒DNA，在ABI377自动测序仪上进行序列测定。2.分离编码p93的全长克隆在EST大规模测序中，发现来自克隆H498的EST序列含有与ILK相似的锚蛋白重复及激酶结构域，随后将含H498 cDNA的pBK-CMV噬菌体通过ExAssist/XLOLR辅助噬菌体系统(Stratagene)从ZAP表达载体中切出。具体步骤取250μl ZAP噬菌体，1μl辅助噬菌体(ExAssist helper phage)共感染感受态的XL1-Blue MRF宿主菌，37℃培养15min.后，加3ml NZY液体培养基，37℃再培养2.5-3hr，65℃-70℃加热20min.，于4℃离心(1000×g，15min.)。取含pBluescript phagemid的上清100μl转化200μl感受态的XLOLR。37℃温育15min.后，加300μl NZY液体培养基，再37℃培养45min.，涂布卡那抗性LB培养盘，37℃过夜。挑取单克隆，碱裂解法提取质粒，H498克隆序列全长经ABI377自动测序仪测定。3.新全长cDNAs的生物信息学分析ESTs测序结果的同源性比较采用NCBI的BLAST软件，核酸数据库为GenBank(Release124.0)/EMBL(Release 67)/DDBJ(Release 45)。在得到H498克隆全长cDNA后作进一步分析时，通过SRS(Version 6.0.7.3)查询SWISS-PROT(Release 39.22)、TrEMBL(Release 17.0)。氨基酸序列多重排列采用Clustal X软件。结构域分析采用瑞士专家蛋白分析系统(ExPASy)的PROSITE数据库(Release 17.0)和EMBL的SMART软件(version 3.3)。PCR引物设计采用Informax，Inc的Vector NTITMSuite软件包。4.胎儿、成人Northern blot和76种组织的多组织点阵分布分析提取环化质粒pBK-CMV-p93，经NotI、EcoRI双酶切，以获得的p93全长cDNA作为模板，应用“Prime-a-Gene Labeling System”(Promega)随机引物试剂盒进行探针标记。胎儿多组织杂交膜的制备提取8个月流产胎儿骨骼肌、脑、心脏、肝脏、肺和肾脏等6种组织的总RNA，经紫外分光光度计定量后，每个泳道上样量为30μg，甲醛变性胶电泳、转移并固定至尼龙膜，同常规。成人多组织杂交膜(MTNTM)(Clontech)及其含76种组织MTETM(Clontech)进行了多组织点阵分布分析，操作按说明书进行。5.多克隆抗体的制备及鉴定为原核表达p93，设计5’引物CTGGATCCAAATGGGAAATTATAAATCTAGACC，3’引物CGTCGACTGTCGTAAGCCCGCCGGCGAT，其中5’和3’引物分别含BamH I和EcoR I酶切位点。以含p93的pBK-CMV质粒为模板，用pfuTurboTM DNA聚合酶(Stratagene)将p93全编码框克隆入原核表达载体pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia)。经测序验证所有构建子读码框正确无误，PCR也未引入新的突变后，将pGEX-p93导入大肠杆菌BL21中进行原核表达，其表达蛋白用于检测核酸免疫法制备的多克隆抗体的效价及特异性。
用BamH I和EcoR I将p93编码框从载体pGEX-5X-1中切出，直接亚克隆至pSecTag(Invitrogen)，构建成真核表达载体pSecTag-p93。碱裂解法大量提取质粒约3mg，经PEG纯化后，分三次用电针介导免疫家兔，每次间隔约两周，第三次免疫后8天取抗血清，用Western blot方法和原核表达的细菌总蛋白(含p93蛋白)检测免疫前后的家兔血清。6.免疫组化取8个月流产胎儿心脏组织及猝死的正常成人心脏组织进行石蜡切片。置切片于3％H2O2中10min，灭活内源性过氧化物酶。抗原修复采用双暴露法，先用拘橼酸修复液(pH8.0)于微波炉煮30min，降至室温后，再用0.1％Trypsin消化30min.10％血清封闭。以二步法行抗体标记，用抗体稀释液(美国Zymed)以1∶20稀释的p93抗血清覆盖切片，4℃过夜，直接加二抗、三抗混合的PictureTM工作液，室温1hr，行DAB染色8-10min。Hrarris苏木素浅染细胞核，脱水，封片。7.p93在COS-7真核细胞中的表达及其活性分析用BamH I和EcoR I将p93全编码框从载体pGEX-5X-p93中切出，直接亚克隆至真核表达载体pcDNA4/HisMax(A)(Invitrogen)构建成真核表达载体pcDNA4-p93。pcDNA4含有6×His以备纯化和XpressTMEpitope以备用抗体检测。用于真核细胞转染的质粒经CsCl超速离心纯化，并用脂质体Lipofectamine(Gibco BRL)或DOSPER(Roche)介导转染COS-7细胞。为了检测蛋白表达，细胞溶于含1％SDS和10mM EDTA的10mM Tris缓冲液(pH7.4)中。抗体为Anti-XpressTM单抗(Stratagene)。用ECL法(enhanced chemiluminescence)检测Westernblot结果，Luminol试剂购自Santa Cruz。
瞬时转染后2-3天，COS-7细胞用胰酶消化，离心(1000×g，1min)收集细胞。每106-107个细胞用1ml冰预冷的1×结合缓冲液洗两次。结合缓冲液的制备如下0.5M NaCl，20mMTrisHCl pH7.9，5mM咪唑。细胞沉淀存于-70℃备用或准备裂解。将1×107个COS-7细胞溶于1ml裂解液中。裂解缓冲液的制备如下0.5M NaCl，20mM Tris HCl pH7.9，5mM咪唑，10％甘油，1％Triton X-100，不含EDTA的完全性蛋白酶抑制剂混合物一片(Roche)(complete，mini，EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets)，1mM PMSF，5mMβ-巯基乙醇；将溶液存于-70℃ 1min或于4℃放30min。随后于4℃离心(10,000×g，30min)，移去细胞破碎物，上清用于纯化蛋白。取50μl含20％乙醇的50％ProBondTMResin(Invitrogen)悬液，先用60μl的裂解液预湿，后将上清加至Resin，于4℃振荡1-3hr。为分析激酶活性，在30μl体系中将纯化蛋白与激酶缓冲液进行反应。激酶缓冲液配制如下20mM Tris HCl，pH7.0，10mM MnCl2，10mM MgCl2，2mM NaF，1mM Na3VO4，1-2mM DTT，10μCi[γ-32P]ATP，反应在30℃进行，30min。将反应样品加Laemmli’s上样缓冲液煮沸，6％SDS-PAGE电泳。蛋白转移至NC膜并经放射自显影。8.酵母双杂交筛选构建pGBKT7-Ser-rich诱饵载体，首先确证其对酵母无毒性作用，随后分析转化子在His、Ade中的背景生长和对MEL1的激活，确证该构建子不会激活报告基因。于30℃倒置培养3-5天以使二倍体细胞形成可见克隆，计数培养板上的克隆，计算交配效率。
筛库过程准备浓缩的AH109[pGBKT7-Ser-rich]过夜培养物，将其与1ml预转化心脏cDNA文库于2-L灭菌flask中，于30℃ 30-50rpm轻轻振荡20-24hr。次日将交配混合物移至一灭菌的100ml离心管，1000×g离心10min沉淀细胞，随后用2×YPDA/kan冲洗交配用flask二次，每次50ml。用两次冲洗液悬浮最初得到的细胞团块，再次1000×g离心10min沉淀细胞。于10ml 0.5×YPDA/kan中悬浮细胞团块，测量细胞+培养基的总体积。取5μl文库交配混合物，用0.5×YPDA/kan稀释后于SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp培养板分别铺100μl的1∶104、1∶102稀释的交配混合物以测知交配效率。将剩余的交配混合物铺于50个大的(150mm)SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)培养板，每盘200μl。于30℃倒置培养8-21天直至克隆出现。在8-21天酵母生长过程中，逐步将阳性克隆挑至QDO网格盘，30℃生长1-2天后，依据克隆数多少，设立时间点进行印膜β-gal检测初筛，将阳性克隆于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp盘上再次划线2次后，将阳性克隆挑至QDO网格盘，30℃生长2天，依据克隆数多少，设立时间点进行印膜β-gal检测进行再次筛选。
文库滴定将5μl文库稀释104后涂布于SD/-Leu板，倒置平板于30℃孵育3-5天计算所含的克隆数及其文库滴度。
计算酵母交配的效率和筛选的克隆数依据生长于SD/-Leu，SD/-Leu/-Trp培养皿中的克隆数计算交配效率，结合文库滴度计算所筛选的克隆数。
阳性克隆归类从酵母中分离质粒DNA，通过转化电感受态DH5α以获得阳性克隆质粒，PCR扩增AD/library插入子，并分别用Alu I和Hae III单酶切，电泳分析PCR及其酶切产物大小。
酵母体内再验证将所有欲检测的AD/library和AD质粒转化AH109，铺于SD/-Leu培养基，阴性对照质粒pGBKT7-Lam转化Y187，铺于SD/-Trp培养基，待上述克隆生长后，分别挑至SD网格盘进行划线交配。将阴性克隆挑至SD/-Leu/-Trp培养盘，实验组及其阳性对照克隆挑至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养盘，30℃生长4-5天，进行印膜β-gal检测。
权利要求
1.本发明涉及一个心肌特异表达的蛋白激酶p93，包括该基因的cDNA序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。其特征在于p93的cDNA全长约3400bp，相应编码蛋白质有845aa。
2.根据权利要求1所述之p93基因/蛋白，其特征在于该蛋白含3个蛋白结构域，N端为锚蛋白重复(ankyrin repeats)结构域，靠近C端有一激酶结构域，C末端为富含丝氨酸结构域(ser-rich)。
3.根据权利要求1、2所述之p93蛋白/基因，其特征在于其激酶结构域具有激酶活性。
4.根据权利要求1、2所述之p93蛋白/基因，其特征在于富含丝氨酸的C-末端可以与肌小节蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin、转录因子芳香烃受体(ArylHydrocarbon Receptor，AhR)复合物组分芳香烃受体相互作用蛋白(aryl hydrocarbonreceptor-interacting protein，AIP)、心肌脂肪酸结合蛋白3(H-FABP3)和心肌线粒体参与脂肪酸β-氧化的羟脂酰CoA脱氢酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亚单位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzyme A thiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase，βsubunit)发生特异而直接的相互作用。
5.根据权利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通过与肌小节蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin发生相互作用而调节心肌细胞收缩。
6.根据权利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通过与芳香烃受体复合物组分相互作用而参与对心肌细胞异源生物素代谢(xenobiotic metabolism)酶基因转录的调控。
7.根据权利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通过与心肌脂肪酸结合蛋白3和心肌线粒体参与脂肪酸β-氧化的羟脂酰CoA脱氢酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亚单位相互作用而参与调节心肌细胞的能量代谢。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7所述之p93基因/蛋白，其特征在于该基因及其编码蛋白与心脏发育、心肌病和心力衰竭等许多心脏疾病密切相关，可用于心脏疾病的基因诊断和基因治疗，还可用于新药的设计与开发。
全文摘要
本发明涉及一个在心肌特异表达的、与肌小节蛋白cTnI、MyBP－C、心肌α－actin、成人骨骼肌α－actin、转录因子芳香烃受体复合物组分AIP、心肌脂肪酸结合蛋白3和心肌线粒体参与脂肪酸β－氧化的羟脂酰CoA脱氢酶/3－酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亚单位相互作用的新蛋白激酶基因/蛋白p93，包括其cDNA序列、编码蛋白质的氨基酸序列及组织、细胞定位和激酶活性测定。p93蛋白能通过和上述肌小节蛋白的相互作用调节心肌细胞收缩；通过与心肌脂肪酸结合蛋白和线粒体参与脂肪酸β－氧化的酶相互作用以调控心肌细胞的能量代谢；通过与AIP参与二恶英受体信号传导通路，并调控心肌细胞色素氧化酶P450IA1、450IA2、己醛脱氢酶、苯醌还原酶等各种药物代谢的酶基因转录。通过以上作用从而参与了心脏发育、心肌病、心衰等心脏疾病的发生。
文档编号A61K38/43GK1445366SQ0210373
公开日2003年10月1日 申请日期2002年3月15日 优先权日2002年3月15日
发明者丁金凤, 赵勇, 孟宪敏, 赵秀文, 刘冬青, 曹慧青 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院
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