4－(4－甲基哌嗪－1－基甲基)－N－[4－甲基－3－(4－(吡啶－3－基)嘧啶－2－基...的制作方法
专利名称：4－( 4－甲基哌嗪－1－基甲基)－N－[4－甲基－3－(4－(吡啶－3－基 )嘧啶－2－基 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(化合物I)或其可药用盐用于制造治疗c-fms相关疾病的药物的用途。
起初作为单核吞噬细胞谱系生长因子描述的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)还参与免疫和炎症反应、骨代谢和妊娠。M-CSF的生物学活性通过酪氨酸激酶受体c-fms介导。c-fms是配体诱导的蛋白质酪氨酸激酶并且属于受体亚家族III。c-fms原癌基因编码巨噬细胞集落刺激因子-1(CSF-1)的唯一已知的受体。其由将细胞外部分(即包含5个免疫球蛋白重复的配体结合结构域)与细胞内的酪氨酸激酶结构域(由两个部分构成，该两个部分的两侧为非催化插入序列(激酶插入序列))分开的单一跨膜结构域组成。M-CSF或CSF-1/酪氨酸激酶受体c-fms对在单核细胞与巨噬细胞分化、胚胎发生植入、胎盘发育以及人乳房的催乳分化中具有基本生理功能。人c-fms原癌基因的mRNA为可从ENTREZwww.ncbi.nlm.nih.gov.获得的X03663并参见Coussens L等人，Nature 1986，320(6059)277-280。
在上皮来源的原发肿瘤中检测到了M-CSF和c-fms的mRNA和蛋白质的异常过表达。酪氨酸激酶受体c-fms的异常高表达与包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌在内的多种恶性肿瘤的侵袭行为相关。
4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(在下文称作化合物I)是在治疗慢性粒细胞白血病(缩写为CML)和胃肠道间质瘤(缩写为GIST)具有较高功效的蛋白质激酶抑制剂。化合物I靶向CML特异性酪氨酸激酶bcr-abl，但是它还是血小板来源生长因子受体(PDGF-R)、干细胞因子(c-kit)、c-abl和abl相关基因(ARG)的有效抑制剂。据报道，与酪氨酸激酶受体c-kit和PDGFRβ相比，M-CSF受体c-fms的磷酸化不受化合物I的影响。至今从未描述过化合物I可以用于抑制c-fms或者用于制造治疗c-fms相关疾病的药物。
化合物I是具有下式的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺 4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺的制备描述于EP-A-0 564 409中。
化合物I的可药用盐是可药用酸加成盐，例如与无机酸如盐酸、硫酸或磷酸形成的盐，或者与适宜有机羧酸或磺酸，例如脂肪族单羧酸或脂肪族二羧酸如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、反丁烯二酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸，或者氨基酸如精氨酸或赖氨酸，芳香羧酸如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸，芳香-脂肪族羧酸如扁桃酸或肉桂酸，芳杂环羧酸如烟酸或异烟酸，脂肪族磺酸如甲磺酸、乙磺酸或2-羟基乙磺酸，或者芳香磺酸如苯磺酸、对甲苯磺酸或萘-2-磺酸形成的盐。
化合物I的单甲磺酸加成盐(在下文称作“盐I”)和其晶体形式例如α晶体形式和β晶体形式描述于例如在1999年1月28日公布的PCT专利申请WO99/03854以及欧洲专利号998 473中。
所有的WO(数字)文献意思是指相应的PCT专利申请的WIPO公布。
现在令人惊奇地发现，化合物I或其可药用盐如盐I能够抑制属于受体亚家族III且参与M-CSF依赖性细胞系增殖的酪氨酸激酶受体c-fms。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关疾病(如c-fms相关的肿瘤性疾病和c-fms相关的非肿瘤性疾病)的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关性癌症，例如c-fms相关性卵巢癌如c-fms相关性卵巢浆液性癌或c-fms相关性晚期卵巢上皮癌的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关性乳腺癌的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关性骨代谢疾病的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备预防和/或治疗c-fms相关性转移癌，例如c-fms相关性骨转移癌如c-fms相关性乳腺癌骨转移癌的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关性炎症疾病如c-fms相关性类风湿性关节炎的药物的用途。
c-fms相关性疾病意思是指其中有c-fms参与的疾病，特别是与未患c-fms相关性疾病的患者相比c-fms蛋白质或mRNA或两者过表达的疾病。本定义还包括这些情况，即c-fms受体的配体水平过表达的情况和c-fms受体组成型活性的情况。
c-fms相关性肿瘤疾病意思是指c-fms所参与的下列疾病绒毛膜癌、肝细胞癌、乳腺癌、恶性组织细胞病、急性粒细胞白血病、胚胎性癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、胃癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、黑素瘤和转移癌。
c-fms相关性非肿瘤性疾病意思是指类风湿性关节炎、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克-雅病、多发性硬化、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和动脉粥样硬化。
本发明的一个实施方案涉及化合物I或其可药用盐用于制造治疗c-fms相关性疾病的药物的用途，所述疾病选自绒毛膜癌、恶性组织细胞病、胚胎性癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克-雅病或肌萎缩性侧索硬化。
根据本发明的一个实施方案，向患者施用化合物I或其可药用盐如盐I。剂量表示为所施用的化合物I游离碱的剂量，例如对于100mg的剂量而言，施用119.5mg的盐I相当于100mg的化合物I游离碱。例如，400mg剂量的化合物I应理解为施用了相当于400mg化合物I游离碱的478mg的盐I。
取决于物种、年龄、个体状况、施用方式以及临床表现，向大约70kg体重的温血动物施用有效量的化合物I，例如大约100-1000mg，如200-800mg，如200-600mg，如400mg日剂量的化合物I。对于患有c-fms介导或c-fms相关性疾病的成年患者，推荐起始日剂量为200-400mg的化合物I。对于在用日剂量为400mg化合物I治疗后对治疗没有足够反应的患者，可以考虑安全地增加剂量，并且对患者进行治疗直到患者从治疗中受益并且没有出现限制性毒性。例如，以这种方式本领域的技术人员可以确定待施用于患者的化合物I或其可药用盐的有效量。
根据本发明，将化合物I甲磺酸盐(盐I)例如α晶体形式、β晶体形式或其混合物形式的化合物I甲磺酸盐向需要治疗c-fms相关性疾病的患者施用。
实施例1化合物I或其可药用盐在临床相关浓度抑制巨噬细胞集落刺激因子受体c-fms的酪氨酸激酶材料和方法骨髓单核细胞(BMMNC)的分离在知情同意后，从健康志愿者的后路髂棘处抽取正常骨髓(BM)。通过在Ficoll-Hypaque(Lymphoprep，1.077g/dL；Nycomed Pharma)上于400g离心30分钟收集低密度骨髓单核细胞。
CD34+细胞的分离使用MACSCD34+祖细胞选择性分离试剂盒(Miltenyi Biotech)并按照产品说明书从BMMNC分离CD34+祖细胞(纯度＞90％)。
造血集落分析使用Johnson G.R.1980.J Cell Physiol 103371-383的修改方法在半固体琼脂上分析BMMNC或CD34+细胞的集落形成。简言之，在每个35mm细胞培养皿(Falcon)中接种5.0×104个BMMNC细胞或7.5×103个CD34+细胞，细胞在补充有0.33％琼脂(BactoTMAgar，Difco)、25％FCS和2mM L-谷氨酰胺的1.0mL IMDM(JRH Biosciences)中培养。通过加入4种生长因子((4HGF)，IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF，每一种终浓度为10ng/mL)(Peprotech)、5种生长因子((5HGF)，IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF、干细胞因子(SCF)，每一种终浓度为10ng/mL)(Peprotech)、M-CSF(25ng/mL)或GM-CSF(10ng/mL)(Peprotech)刺激集落生长。向集落培养物中还加入化合物I(0.3μM至30μM)、抗c-fms抗体(2-4A5，Santa CruzBiotechnology Inc)(1μg/mL)或者抗c-kit抗体(Sigma)(1μg/mL)。将培养物在潮湿的箱中于37℃+5％ CO2条件下培养2周，之后用3％戊二醛固定。将固定的培养物依次对醋酸萘酚酯酶(如Lojda，Z.等人，1979.Enzymehistochemistrya laboratory manual，Springer-Verlag，Berlin所述)和氯醋酸酯酶(见例如Kubota K.等人，1980，Exp.Hematol.8339-44)染色，然后用劳克坚牢蓝(BDH)染色以分别鉴定单核细胞/巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞集落。按照标准对集落记分(＞50个细胞)。
M-CSF ELISA如先前所述，例如在Dewar A等人，2003，Leukemia 171713-21中所述，从正常供体的血沉棕黄层分离单核细胞。在24孔板中于无血清培养基(SDM；补充有2mM L-谷氨酰胺、200μg/mL转铁蛋白、10μg/mL胰岛素(Actrapid，Novo Nordisk)、10-4M β-巯基乙醇、50μg/mL低密度脂蛋白(Sigma)的IMDM/1％BSA)培养获得单核细胞培养物(1×105/mL)，并用20ng/mL GM-CSF刺激。以24小时的间隔收获一次上清液，收集5天，使用R&D Systems的DuoSetELISA发育系统并按照产品说明书分析M-CSF。
c-Fms向FDC-P1细胞内的转导用MSW/IRES/GFP/cfms(St Jude Children’s Research Hospital的M.Roussel惠赠)通过Fugene(Roche)转染产生稳定产生Psi-2病毒的细胞系并且在FACStarPLUS流式细胞仪(Becton Dickinson)上分选，收集表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞。这些细胞用于通过共培养来感染FDC-P1细胞，并且将表达c-fms蛋白质(FDC-cfms)的FDC-P1细胞选出培养于补充有10％FCS、200mM L-谷氨酰胺和60ng/mL rhM-CSF的DMEM中。
增殖分析将FDC-cfms细胞以5.0×104/mL的密度重悬于包含10％FCS的DMEM中，并用鼠IL-3(1∶2000)(S.Read博士提供，IMVS)或者rhM-CSF(60ng/mL)(Peprotech)刺激。加入终浓度为0.5μM-5.0μM的化合物I，一式三份，在12、24和48小时时收获细胞。将细胞在已知体积内固定，并且加入固定体积的已知密度的Flow-CheckTMFluorospheres(BeckmanCoulter)。使用Coulter XL-MCS分析型流式细胞仪并基于FS对SS(对应于beads/细胞)图的门的分析确定细胞数量。
细胞裂解将FDC-c-fms于37℃、存在或不存在化合物I的条件在无血清培养基(DMEM，JRH Biosciences)中培养1小时。在饥饿之后，将细胞以1.5×107/mL的密度重悬于含有或不含有化合物I的DMEM中，用60ng/mL rhM-CSF于37℃刺激2分钟，然后在补充有0.5M NaF、0.1MNaPPi、0.5M NaVO4、0.1M PMSF和完全的蛋白酶抑制剂(Roche)的TSE(50mM tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0)中的1％NP40中裂解。
免疫沉淀使用2.5μg/mL的抗c-fms抗体(2-4A5，Santa Cruz Biotechnology Inc)和G蛋白琼脂糖(Amersham)从FDC-c-fms细胞提取物中免疫沉淀c-Fms。在4℃免疫沉淀2小时，然后将样品充分洗涤并重悬于30μL还原上样缓冲液(抗磷酸酪氨酸印迹)或非还原上样缓冲液(抗c-fms印迹)中。在每一IP中使用等量的蛋白质，如使用Micro BCATM蛋白质分析试剂(Pierce)所确定。
Western印迹分析免疫沉淀物在8％SDS-PAGE中电泳并电转移印迹至PVDF膜(Amersham)。膜用抗磷酸化酪氨酸抗体(1/1000 PY20(Santa CruzBiotechnology Inc)和1/2000 4G10(Cell Signalling Technology)的混合物)或者抗c-fms抗体(R&D Systems)探测。使用缀合有碱性磷酸酶的抗小鼠Ig的抗体检测并使用ECF底物(Amersham)呈色。使用Typhoon9410(Amersham)在488nm激发光下获得膜的图像，并使用ImageQuantTM软件定量。
c-Fms表达的流式细胞术分析在化合物I存在下，在无血清的IMDM中培养FDC-c-fms细胞(5×105)1小时，然后用0.5μg抗c-fms抗体染色。通过用缀合有R-藻红蛋白的抗小鼠抗体(SouthernBiotech)染色来检测结合的抗体，并使用CoulterXL-MCS分析型流式细胞仪分析细胞。
统计学分析和药物动力学数据分析使用ANOVA分析数据，当概率值＜0.05时认为差异具有显著性。使用Hill方程y＝100/(1+10(logIC50-x)×Hill斜率))(其中y为抑制水平，x为药物浓度的对数)计算IC50值。
结果抗c-Fms抑制用M-CSF或GM-CSF刺激的单核细胞/巨噬细胞集落的生长化合物I抑制用M-CSF或GM-CSF所刺激的单核细胞/巨噬细胞谱系细胞(从正常供体分离的)的生长，见例如Dewar，A.L等人，2003Leukemia171713-21。与相关的III类受体酪氨酸激酶c-kit和PDGFR相反，高达10μM的化合物I不影响c-fms的磷酸化，见例如Buchdunger，E.等人，2000.J Pharmacol Exp Ther 295139-145。
用4HGF或5HGF刺激使用来自正常供体的骨髓单核细胞建立起来的集落培养物，并且检测抗c-kit抗体与化合物I的组合对单核细胞/巨噬细胞生长的影响，见下表1A。在缺乏化合物I的情况下，向用4HGF刺激的培养物中加入抗c-kit抗体不影响集落数量。在这些实验中使用的抗c-kit抗体的剂量(1μg/mL)足以完全抑制SCF受体，因为将其加入到用4HGF和SCF(5HGF)刺激的培养物中与加入到4HGF单独刺激的培养物中相比，使集落生长降低至同一水平。见下表1A。在不加入SCF和化合物I的情况下，抗c-kit抗体不影响单核细胞/巨噬细胞生长，这表明在自分泌的SCF产生后靶向c-kit信号转导途径不会产生抑制。在下表中，缩写“SEM”代表平均值的标准误差，“cc”代表浓度。
表1A化合物I通过抑制c-fms而抑制单核细胞/巨噬细胞的集落形成。用4HGF(IL-3，IL-6，G-CSF，GM-CSF)、4HGF+抗c-kit抗体(+KIT)、5HGF(IL-3，IL-6，G-CSF，GM-CSF，CSF)、5HGF+抗c-kit抗体(+KIT)刺激来自正常BM的MNC，并检查对单核细胞/巨噬细胞集落形成的影响。
为检查c-fms在集落生长中的作用，向用M-CSF或GM-CSF刺激之后的培养物中加入抗c-fms抗体。在M-CSF刺激的培养物中，仅观察到单核细胞/巨噬细胞集落，在1.0μM化合物I存在下，集落被抑制高达80％，见下表1B。
表1B通过加入抗c-fms抗体抑制了用M-CSF刺激的源自CD34+祖细胞的单核细胞/巨噬细胞的生长
抗c-fms抗体足以完全抑制单核细胞/巨噬细胞集落，这证明生长依赖于M-CSF，见上面表1B。
向GM-CSF刺激的培养物中加入1.0μM化合物I使单核细胞/巨噬细胞集落生长降低大约80％。相反，低于10.0μM浓度的化合物I不影响嗜酸性粒细胞的生长，见下表1C。
表1C用GM-CSF刺激的源自CD34+祖细胞的单核细胞/巨噬细胞集落的生长
化合物I和抗c-fms抗体均不影响GM-CSF刺激后的嗜酸性粒细胞集落生长。
向GM-CSF刺激的培养物中加入抗c-fms抗体完全消除了单核细胞/巨噬细胞集落的生长而没有影响嗜酸性粒细胞的生长，这表明GM-CSF直接刺激嗜酸性粒细胞生长而间接刺激单核细胞/巨噬细胞集落的生长。
用GM-CSF对单核细胞进行刺激诱导M-CSF蛋白质的分泌并且因为GM-CSF间接刺激抗c-fms可抑制性的单核细胞/巨噬细胞集落生长，因此检查了在培养系统中GM-CSF是否诱导M-CSF自分泌产生。在培养物建立后24小时检测到低水平(20pg/mL)的M-CSF(数据未显示)，在5天中M-CSF水平逐渐增加至大约70pg/mL。加入1.0μM化合物I不影响培养的单核细胞产生M-CSF，而5.0μM化合物I使第5天的M-CSF产生降低30％。据估计，所产生的M-CSF的最大水平为70pg/mL，而这比在本研究中所加入的M-CSF浓度低300-500倍。亚最佳浓度的M-CSF可以足以诱导单核细胞生长和分化，GM-CSF能够单独支持单核细胞/巨噬细胞生长，但是协同作用以增强M-CSF的作用。
化合物I抑制M-CSF依赖性细胞系的增殖由于化合物I似乎通过c-fms来介导其对单核细胞/巨噬细胞发育的抑制作用，所以研究了化合物I对依赖于鼠IL-3或人M-CSF的细胞系的影响。用鼠IL-3刺激的对照培养物显示，在所检查的化合物I剂量范围内，在12或24h对细胞生长不具有化合物I-特异性的影响，见表2A。在48h时，在IL-3存在下FDC-c-fms的增殖被2.5μM化合物I降低15％并且被5.0μM化合物I降低40％，这表明化合物I对这些细胞具有适中的毒性作用。
表2A
表2B
表2A和2B治疗浓度的化合物I抑制M-CSF刺激的表达c-fms的细胞系的生长但不抑制IL-3刺激的表达c-fms的细胞系的生长。在12、24和48小时计数细胞(细胞数/mL)。用鼠IL-3刺激的对照培养物显示，在48小时时2.5μM或更高浓度的化合物I对生长的抑制较小(2A)。在12和24小时未见影响。使用S型模型预测的IC50值为5.9μM，这表明较高浓度的化合物I具有轻微的药物毒性(未显示)。用M-CSF对细胞的刺激表明，在12小时时5.0μM化合物I抑制生长并且在24和48h小时2.5μM化合物I抑制生长(2B)，化合物I的IC50值为1.1μM。
当M-CSF是唯一的刺激源时，可见在起始培养后的12小时，5.0μM化合物I使细胞生长抑制50％。在24小时时，用2.5μM化合物I刺激的培养物的细胞计数比未用化合物I刺激的培养物的细胞计数低45％，并且5.0μM化合物I刺激的培养物的细胞计数低于接种时的细胞计数。化合物I对M-CSF刺激的FDC-c-fms培养物的影响在48小时时最深远，2.5μM化合物I使细胞计数相对于对照而言降低80％，并且5.0μM化合物I使细胞的浓度低于接种时的水平。
化合物I抑制c-Fms的磷酸化为了确定化合物I是否直接介导对M-CSF受体的抑制作用，检查了化合物I对FDC-c-fms细胞系的c-fms磷酸化的影响。未用M-CSF刺激的饥饿的FDC-c-fms细胞显示c-fms没有磷酸化。用M-CSF刺激的饥饿的FDC-c-fms细胞显示出受体磷酸化，并且1.0μM化合物I使这种磷酸化降低大约30％。当化合物I为2.5μM时，c-fms磷酸化降低75％，当化合物为5.0μM时未观察到明显的磷酸化。经数据分析，得知化合物I抑制c-fms磷酸化的IC50值为1.42μM，这与增殖实验中得到的数值相似。
化合物I不影响c-Fms蛋白质的表达在单核细胞上c-Fms低水平表达，并且在向巨噬细胞分化过程中其显著表达。在M-CSF缺乏情况下，c-fms的成熟细胞表面形式相对稳定，然而配体的结合通过内化和溶酶体内的降解下调了受体表达。由于M-CSF受体的磷酸化被化合物I抑制，所以探测了Western印迹膜的c-fms蛋白质以证实这不是由于c-fms表达的降低造成的。在这些印迹膜中检测到了两条c-fms带，170kDa的带代表完全糖基化的c-fms蛋白，130kDa的带代表不成熟形式的非糖基化形式。对170kDa和130kDa带的强度进行了定量，并且一致检测到170kDa蛋白质更高。两种形式的c-fms的表达不受化合物I处理的影响，见下表4A。使用流式细胞术证实了化合物I不影响c-fms表达，其中在用0.5μM-2.5μM化合物I处理的FDC-c-fms细胞中c-fms的表面表达没有差别，并且略低于5.0μM化合物I处理细胞中的表达，见表4B。
表4A对c-fms种类的Western印迹定量
IC＝同种型对照表4B通过流式细胞术检测的表面c-fms
据证明，蛋白质酪氨酸激酶抑制剂化合物I的体外特性可以扩展到包括c-fms。抑制能力低于对Abl(IC50＝0.025μM)、c-kit(IC50＝0.1μM)或PDGF受体酪氨酸激酶(IC50＝0.25μM)的抑制能力。Western印迹表明，使c-fms酪氨酸磷酸化抑制50％所需化合物I的浓度为1.4μM。在该研究中，在用饱和剂量M-CSF进行特异受体刺激后的c-fms免疫沉淀物中检查了化合物I对c-fms磷酸化的影响。
化合物I可用于治疗涉及异常c-fms激活的疾病，包括普通的癌症如乳腺癌和上皮性卵巢癌以及炎性疾病如类风湿性关节炎。已经在包括乳腺癌和卵巢癌在内的广泛的人类癌症中证明了c-fms的异常表达，并且已经证明c-fms的激活通过尿激酶依赖性机制刺激肿瘤侵袭，见Kacinski B.M.1997，Mol Reprod Dev 4671-4，Sapi E和B.M.Kacinski，1999，Proc SocExp Biol Med 2201-8。乳腺肿瘤和晚期卵巢上皮癌中c-fms异常表达与肿瘤细胞的侵袭性和不利的临床预后相关，并且乳腺肿瘤产生M-CSF暗示着促进乳腺癌的骨转移，见Toy E.P.等人，2001，Gynecol.Oncol.80194-200，Sapi E.2004 Exp Biol Med 2291-11。化合物I对c-fms磷酸化的潜在抑制作用在潜在的药物毒性方面具有重要的暗示。在造血系统之外，c-fms信号在妊娠中起着重要的作用，其影响植入前胚胎发育和哺乳动物乳腺发育，见Pollard J.W.1997，Mol Reprod Dev 4654-60。通过M-CSF刺激，c-fms还在骨代谢和炎症过程中起着重要作用，见Fixe P.和V.Praloran，1998，Cytokine 1032-37。目前，虽然明确证明患者充分耐受化合物I，但是必须考虑到长期使用化合物I治疗的后果是化合物I潜在影响这些过程。
实施例2含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺单甲磺酸盐晶体形式的胶囊以下列组成制备含有119.5mg标题化合物(＝盐I)(对应于100mg化合物I(游离碱))作为活性物质的胶囊组成盐I 119.5mg微晶纤维素200mgPVPPXL15mg微粉硅胶(Aerosil) 2mg硬脂酸镁 1.5mg338.0mg胶囊通过将组分混合并且将混合物填充至1号明胶胶囊中制备。
权利要求
1.4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(化合物I)的用途，其用于制造治疗c-fms相关疾病的药物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中c-fms相关性疾病选自绒毛膜癌、恶性组织细胞病、胚胎性癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克-雅病或肌萎缩性侧索硬化。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中化合物I是单甲磺酸盐形式。
4.商业包装，包含化合物I或其可药用盐以及根据权利要求1或2的使用说明书。
5.治疗患有或可能患有选自绒毛膜癌、恶性组织细胞病、胚胎性癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克-雅病或肌萎缩性侧索硬化的c-fms相关性疾病的温血动物、优选人患者的方法，其包括向所述动物施用有效量的式I化合物。
全文摘要
本发明涉及4－(4－甲基哌嗪－1－基甲基)－N－[4－甲基－3－(4－(吡啶－3－基)嘧啶－2－基氨基)苯基]－苯甲酰胺(也称作伊马替尼(imatinib)、格利维克(gleevec)、格列卫(glivec)、cgp57148b或8TI571)或其可药用盐用于制造治疗c－fms相关疾病的药物中的用途，所述的c－fms相关疾病包括绒毛膜癌、恶性组织细胞病、胚胎性癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克－雅病或肌萎缩性侧索硬化。
文档编号A61P25/00GK101035535SQ200580033834
公开日2007年9月12日 申请日期2005年10月17日 优先权日2004年10月18日
发明者A·L·迪尤尔, T·P·休斯, A·B·里昂 申请人:梅特维特科学私人有限公司
技术领域：
本发明涉及4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(化合物I)或其可药用盐用于制造治疗c-fms相关疾病的药物的用途。
起初作为单核吞噬细胞谱系生长因子描述的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)还参与免疫和炎症反应、骨代谢和妊娠。M-CSF的生物学活性通过酪氨酸激酶受体c-fms介导。c-fms是配体诱导的蛋白质酪氨酸激酶并且属于受体亚家族III。c-fms原癌基因编码巨噬细胞集落刺激因子-1(CSF-1)的唯一已知的受体。其由将细胞外部分(即包含5个免疫球蛋白重复的配体结合结构域)与细胞内的酪氨酸激酶结构域(由两个部分构成，该两个部分的两侧为非催化插入序列(激酶插入序列))分开的单一跨膜结构域组成。M-CSF或CSF-1/酪氨酸激酶受体c-fms对在单核细胞与巨噬细胞分化、胚胎发生植入、胎盘发育以及人乳房的催乳分化中具有基本生理功能。人c-fms原癌基因的mRNA为可从ENTREZwww.ncbi.nlm.nih.gov.获得的X03663并参见Coussens L等人，Nature 1986，320(6059)277-280。
在上皮来源的原发肿瘤中检测到了M-CSF和c-fms的mRNA和蛋白质的异常过表达。酪氨酸激酶受体c-fms的异常高表达与包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌在内的多种恶性肿瘤的侵袭行为相关。
4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(在下文称作化合物I)是在治疗慢性粒细胞白血病(缩写为CML)和胃肠道间质瘤(缩写为GIST)具有较高功效的蛋白质激酶抑制剂。化合物I靶向CML特异性酪氨酸激酶bcr-abl，但是它还是血小板来源生长因子受体(PDGF-R)、干细胞因子(c-kit)、c-abl和abl相关基因(ARG)的有效抑制剂。据报道，与酪氨酸激酶受体c-kit和PDGFRβ相比，M-CSF受体c-fms的磷酸化不受化合物I的影响。至今从未描述过化合物I可以用于抑制c-fms或者用于制造治疗c-fms相关疾病的药物。
化合物I是具有下式的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺 4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺的制备描述于EP-A-0 564 409中。
化合物I的可药用盐是可药用酸加成盐，例如与无机酸如盐酸、硫酸或磷酸形成的盐，或者与适宜有机羧酸或磺酸，例如脂肪族单羧酸或脂肪族二羧酸如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、反丁烯二酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸，或者氨基酸如精氨酸或赖氨酸，芳香羧酸如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸，芳香-脂肪族羧酸如扁桃酸或肉桂酸，芳杂环羧酸如烟酸或异烟酸，脂肪族磺酸如甲磺酸、乙磺酸或2-羟基乙磺酸，或者芳香磺酸如苯磺酸、对甲苯磺酸或萘-2-磺酸形成的盐。
化合物I的单甲磺酸加成盐(在下文称作“盐I”)和其晶体形式例如α晶体形式和β晶体形式描述于例如在1999年1月28日公布的PCT专利申请WO99/03854以及欧洲专利号998 473中。
所有的WO(数字)文献意思是指相应的PCT专利申请的WIPO公布。
现在令人惊奇地发现，化合物I或其可药用盐如盐I能够抑制属于受体亚家族III且参与M-CSF依赖性细胞系增殖的酪氨酸激酶受体c-fms。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关疾病(如c-fms相关的肿瘤性疾病和c-fms相关的非肿瘤性疾病)的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关性癌症，例如c-fms相关性卵巢癌如c-fms相关性卵巢浆液性癌或c-fms相关性晚期卵巢上皮癌的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关性乳腺癌的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关性骨代谢疾病的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备预防和/或治疗c-fms相关性转移癌，例如c-fms相关性骨转移癌如c-fms相关性乳腺癌骨转移癌的药物的用途。
本发明涉及化合物I或其可药用盐如盐I用于制备治疗c-fms相关性炎症疾病如c-fms相关性类风湿性关节炎的药物的用途。
c-fms相关性疾病意思是指其中有c-fms参与的疾病，特别是与未患c-fms相关性疾病的患者相比c-fms蛋白质或mRNA或两者过表达的疾病。本定义还包括这些情况，即c-fms受体的配体水平过表达的情况和c-fms受体组成型活性的情况。
c-fms相关性肿瘤疾病意思是指c-fms所参与的下列疾病绒毛膜癌、肝细胞癌、乳腺癌、恶性组织细胞病、急性粒细胞白血病、胚胎性癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、胃癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、黑素瘤和转移癌。
c-fms相关性非肿瘤性疾病意思是指类风湿性关节炎、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克-雅病、多发性硬化、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和动脉粥样硬化。
本发明的一个实施方案涉及化合物I或其可药用盐用于制造治疗c-fms相关性疾病的药物的用途，所述疾病选自绒毛膜癌、恶性组织细胞病、胚胎性癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克-雅病或肌萎缩性侧索硬化。
根据本发明的一个实施方案，向患者施用化合物I或其可药用盐如盐I。剂量表示为所施用的化合物I游离碱的剂量，例如对于100mg的剂量而言，施用119.5mg的盐I相当于100mg的化合物I游离碱。例如，400mg剂量的化合物I应理解为施用了相当于400mg化合物I游离碱的478mg的盐I。
取决于物种、年龄、个体状况、施用方式以及临床表现，向大约70kg体重的温血动物施用有效量的化合物I，例如大约100-1000mg，如200-800mg，如200-600mg，如400mg日剂量的化合物I。对于患有c-fms介导或c-fms相关性疾病的成年患者，推荐起始日剂量为200-400mg的化合物I。对于在用日剂量为400mg化合物I治疗后对治疗没有足够反应的患者，可以考虑安全地增加剂量，并且对患者进行治疗直到患者从治疗中受益并且没有出现限制性毒性。例如，以这种方式本领域的技术人员可以确定待施用于患者的化合物I或其可药用盐的有效量。
根据本发明，将化合物I甲磺酸盐(盐I)例如α晶体形式、β晶体形式或其混合物形式的化合物I甲磺酸盐向需要治疗c-fms相关性疾病的患者施用。
实施例1化合物I或其可药用盐在临床相关浓度抑制巨噬细胞集落刺激因子受体c-fms的酪氨酸激酶材料和方法骨髓单核细胞(BMMNC)的分离在知情同意后，从健康志愿者的后路髂棘处抽取正常骨髓(BM)。通过在Ficoll-Hypaque(Lymphoprep，1.077g/dL；Nycomed Pharma)上于400g离心30分钟收集低密度骨髓单核细胞。
CD34+细胞的分离使用MACSCD34+祖细胞选择性分离试剂盒(Miltenyi Biotech)并按照产品说明书从BMMNC分离CD34+祖细胞(纯度＞90％)。
造血集落分析使用Johnson G.R.1980.J Cell Physiol 103371-383的修改方法在半固体琼脂上分析BMMNC或CD34+细胞的集落形成。简言之，在每个35mm细胞培养皿(Falcon)中接种5.0×104个BMMNC细胞或7.5×103个CD34+细胞，细胞在补充有0.33％琼脂(BactoTMAgar，Difco)、25％FCS和2mM L-谷氨酰胺的1.0mL IMDM(JRH Biosciences)中培养。通过加入4种生长因子((4HGF)，IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF，每一种终浓度为10ng/mL)(Peprotech)、5种生长因子((5HGF)，IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF、干细胞因子(SCF)，每一种终浓度为10ng/mL)(Peprotech)、M-CSF(25ng/mL)或GM-CSF(10ng/mL)(Peprotech)刺激集落生长。向集落培养物中还加入化合物I(0.3μM至30μM)、抗c-fms抗体(2-4A5，Santa CruzBiotechnology Inc)(1μg/mL)或者抗c-kit抗体(Sigma)(1μg/mL)。将培养物在潮湿的箱中于37℃+5％ CO2条件下培养2周，之后用3％戊二醛固定。将固定的培养物依次对醋酸萘酚酯酶(如Lojda，Z.等人，1979.Enzymehistochemistrya laboratory manual，Springer-Verlag，Berlin所述)和氯醋酸酯酶(见例如Kubota K.等人，1980，Exp.Hematol.8339-44)染色，然后用劳克坚牢蓝(BDH)染色以分别鉴定单核细胞/巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞集落。按照标准对集落记分(＞50个细胞)。
M-CSF ELISA如先前所述，例如在Dewar A等人，2003，Leukemia 171713-21中所述，从正常供体的血沉棕黄层分离单核细胞。在24孔板中于无血清培养基(SDM；补充有2mM L-谷氨酰胺、200μg/mL转铁蛋白、10μg/mL胰岛素(Actrapid，Novo Nordisk)、10-4M β-巯基乙醇、50μg/mL低密度脂蛋白(Sigma)的IMDM/1％BSA)培养获得单核细胞培养物(1×105/mL)，并用20ng/mL GM-CSF刺激。以24小时的间隔收获一次上清液，收集5天，使用R&D Systems的DuoSetELISA发育系统并按照产品说明书分析M-CSF。
c-Fms向FDC-P1细胞内的转导用MSW/IRES/GFP/cfms(St Jude Children’s Research Hospital的M.Roussel惠赠)通过Fugene(Roche)转染产生稳定产生Psi-2病毒的细胞系并且在FACStarPLUS流式细胞仪(Becton Dickinson)上分选，收集表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞。这些细胞用于通过共培养来感染FDC-P1细胞，并且将表达c-fms蛋白质(FDC-cfms)的FDC-P1细胞选出培养于补充有10％FCS、200mM L-谷氨酰胺和60ng/mL rhM-CSF的DMEM中。
增殖分析将FDC-cfms细胞以5.0×104/mL的密度重悬于包含10％FCS的DMEM中，并用鼠IL-3(1∶2000)(S.Read博士提供，IMVS)或者rhM-CSF(60ng/mL)(Peprotech)刺激。加入终浓度为0.5μM-5.0μM的化合物I，一式三份，在12、24和48小时时收获细胞。将细胞在已知体积内固定，并且加入固定体积的已知密度的Flow-CheckTMFluorospheres(BeckmanCoulter)。使用Coulter XL-MCS分析型流式细胞仪并基于FS对SS(对应于beads/细胞)图的门的分析确定细胞数量。
细胞裂解将FDC-c-fms于37℃、存在或不存在化合物I的条件在无血清培养基(DMEM，JRH Biosciences)中培养1小时。在饥饿之后，将细胞以1.5×107/mL的密度重悬于含有或不含有化合物I的DMEM中，用60ng/mL rhM-CSF于37℃刺激2分钟，然后在补充有0.5M NaF、0.1MNaPPi、0.5M NaVO4、0.1M PMSF和完全的蛋白酶抑制剂(Roche)的TSE(50mM tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0)中的1％NP40中裂解。
免疫沉淀使用2.5μg/mL的抗c-fms抗体(2-4A5，Santa Cruz Biotechnology Inc)和G蛋白琼脂糖(Amersham)从FDC-c-fms细胞提取物中免疫沉淀c-Fms。在4℃免疫沉淀2小时，然后将样品充分洗涤并重悬于30μL还原上样缓冲液(抗磷酸酪氨酸印迹)或非还原上样缓冲液(抗c-fms印迹)中。在每一IP中使用等量的蛋白质，如使用Micro BCATM蛋白质分析试剂(Pierce)所确定。
Western印迹分析免疫沉淀物在8％SDS-PAGE中电泳并电转移印迹至PVDF膜(Amersham)。膜用抗磷酸化酪氨酸抗体(1/1000 PY20(Santa CruzBiotechnology Inc)和1/2000 4G10(Cell Signalling Technology)的混合物)或者抗c-fms抗体(R&D Systems)探测。使用缀合有碱性磷酸酶的抗小鼠Ig的抗体检测并使用ECF底物(Amersham)呈色。使用Typhoon9410(Amersham)在488nm激发光下获得膜的图像，并使用ImageQuantTM软件定量。
c-Fms表达的流式细胞术分析在化合物I存在下，在无血清的IMDM中培养FDC-c-fms细胞(5×105)1小时，然后用0.5μg抗c-fms抗体染色。通过用缀合有R-藻红蛋白的抗小鼠抗体(SouthernBiotech)染色来检测结合的抗体，并使用CoulterXL-MCS分析型流式细胞仪分析细胞。
统计学分析和药物动力学数据分析使用ANOVA分析数据，当概率值＜0.05时认为差异具有显著性。使用Hill方程y＝100/(1+10(logIC50-x)×Hill斜率))(其中y为抑制水平，x为药物浓度的对数)计算IC50值。
结果抗c-Fms抑制用M-CSF或GM-CSF刺激的单核细胞/巨噬细胞集落的生长化合物I抑制用M-CSF或GM-CSF所刺激的单核细胞/巨噬细胞谱系细胞(从正常供体分离的)的生长，见例如Dewar，A.L等人，2003Leukemia171713-21。与相关的III类受体酪氨酸激酶c-kit和PDGFR相反，高达10μM的化合物I不影响c-fms的磷酸化，见例如Buchdunger，E.等人，2000.J Pharmacol Exp Ther 295139-145。
用4HGF或5HGF刺激使用来自正常供体的骨髓单核细胞建立起来的集落培养物，并且检测抗c-kit抗体与化合物I的组合对单核细胞/巨噬细胞生长的影响，见下表1A。在缺乏化合物I的情况下，向用4HGF刺激的培养物中加入抗c-kit抗体不影响集落数量。在这些实验中使用的抗c-kit抗体的剂量(1μg/mL)足以完全抑制SCF受体，因为将其加入到用4HGF和SCF(5HGF)刺激的培养物中与加入到4HGF单独刺激的培养物中相比，使集落生长降低至同一水平。见下表1A。在不加入SCF和化合物I的情况下，抗c-kit抗体不影响单核细胞/巨噬细胞生长，这表明在自分泌的SCF产生后靶向c-kit信号转导途径不会产生抑制。在下表中，缩写“SEM”代表平均值的标准误差，“cc”代表浓度。
表1A化合物I通过抑制c-fms而抑制单核细胞/巨噬细胞的集落形成。用4HGF(IL-3，IL-6，G-CSF，GM-CSF)、4HGF+抗c-kit抗体(+KIT)、5HGF(IL-3，IL-6，G-CSF，GM-CSF，CSF)、5HGF+抗c-kit抗体(+KIT)刺激来自正常BM的MNC，并检查对单核细胞/巨噬细胞集落形成的影响。
为检查c-fms在集落生长中的作用，向用M-CSF或GM-CSF刺激之后的培养物中加入抗c-fms抗体。在M-CSF刺激的培养物中，仅观察到单核细胞/巨噬细胞集落，在1.0μM化合物I存在下，集落被抑制高达80％，见下表1B。
表1B通过加入抗c-fms抗体抑制了用M-CSF刺激的源自CD34+祖细胞的单核细胞/巨噬细胞的生长
抗c-fms抗体足以完全抑制单核细胞/巨噬细胞集落，这证明生长依赖于M-CSF，见上面表1B。
向GM-CSF刺激的培养物中加入1.0μM化合物I使单核细胞/巨噬细胞集落生长降低大约80％。相反，低于10.0μM浓度的化合物I不影响嗜酸性粒细胞的生长，见下表1C。
表1C用GM-CSF刺激的源自CD34+祖细胞的单核细胞/巨噬细胞集落的生长
化合物I和抗c-fms抗体均不影响GM-CSF刺激后的嗜酸性粒细胞集落生长。
向GM-CSF刺激的培养物中加入抗c-fms抗体完全消除了单核细胞/巨噬细胞集落的生长而没有影响嗜酸性粒细胞的生长，这表明GM-CSF直接刺激嗜酸性粒细胞生长而间接刺激单核细胞/巨噬细胞集落的生长。
用GM-CSF对单核细胞进行刺激诱导M-CSF蛋白质的分泌并且因为GM-CSF间接刺激抗c-fms可抑制性的单核细胞/巨噬细胞集落生长，因此检查了在培养系统中GM-CSF是否诱导M-CSF自分泌产生。在培养物建立后24小时检测到低水平(20pg/mL)的M-CSF(数据未显示)，在5天中M-CSF水平逐渐增加至大约70pg/mL。加入1.0μM化合物I不影响培养的单核细胞产生M-CSF，而5.0μM化合物I使第5天的M-CSF产生降低30％。据估计，所产生的M-CSF的最大水平为70pg/mL，而这比在本研究中所加入的M-CSF浓度低300-500倍。亚最佳浓度的M-CSF可以足以诱导单核细胞生长和分化，GM-CSF能够单独支持单核细胞/巨噬细胞生长，但是协同作用以增强M-CSF的作用。
化合物I抑制M-CSF依赖性细胞系的增殖由于化合物I似乎通过c-fms来介导其对单核细胞/巨噬细胞发育的抑制作用，所以研究了化合物I对依赖于鼠IL-3或人M-CSF的细胞系的影响。用鼠IL-3刺激的对照培养物显示，在所检查的化合物I剂量范围内，在12或24h对细胞生长不具有化合物I-特异性的影响，见表2A。在48h时，在IL-3存在下FDC-c-fms的增殖被2.5μM化合物I降低15％并且被5.0μM化合物I降低40％，这表明化合物I对这些细胞具有适中的毒性作用。
表2A
表2B
表2A和2B治疗浓度的化合物I抑制M-CSF刺激的表达c-fms的细胞系的生长但不抑制IL-3刺激的表达c-fms的细胞系的生长。在12、24和48小时计数细胞(细胞数/mL)。用鼠IL-3刺激的对照培养物显示，在48小时时2.5μM或更高浓度的化合物I对生长的抑制较小(2A)。在12和24小时未见影响。使用S型模型预测的IC50值为5.9μM，这表明较高浓度的化合物I具有轻微的药物毒性(未显示)。用M-CSF对细胞的刺激表明，在12小时时5.0μM化合物I抑制生长并且在24和48h小时2.5μM化合物I抑制生长(2B)，化合物I的IC50值为1.1μM。
当M-CSF是唯一的刺激源时，可见在起始培养后的12小时，5.0μM化合物I使细胞生长抑制50％。在24小时时，用2.5μM化合物I刺激的培养物的细胞计数比未用化合物I刺激的培养物的细胞计数低45％，并且5.0μM化合物I刺激的培养物的细胞计数低于接种时的细胞计数。化合物I对M-CSF刺激的FDC-c-fms培养物的影响在48小时时最深远，2.5μM化合物I使细胞计数相对于对照而言降低80％，并且5.0μM化合物I使细胞的浓度低于接种时的水平。
化合物I抑制c-Fms的磷酸化为了确定化合物I是否直接介导对M-CSF受体的抑制作用，检查了化合物I对FDC-c-fms细胞系的c-fms磷酸化的影响。未用M-CSF刺激的饥饿的FDC-c-fms细胞显示c-fms没有磷酸化。用M-CSF刺激的饥饿的FDC-c-fms细胞显示出受体磷酸化，并且1.0μM化合物I使这种磷酸化降低大约30％。当化合物I为2.5μM时，c-fms磷酸化降低75％，当化合物为5.0μM时未观察到明显的磷酸化。经数据分析，得知化合物I抑制c-fms磷酸化的IC50值为1.42μM，这与增殖实验中得到的数值相似。
化合物I不影响c-Fms蛋白质的表达在单核细胞上c-Fms低水平表达，并且在向巨噬细胞分化过程中其显著表达。在M-CSF缺乏情况下，c-fms的成熟细胞表面形式相对稳定，然而配体的结合通过内化和溶酶体内的降解下调了受体表达。由于M-CSF受体的磷酸化被化合物I抑制，所以探测了Western印迹膜的c-fms蛋白质以证实这不是由于c-fms表达的降低造成的。在这些印迹膜中检测到了两条c-fms带，170kDa的带代表完全糖基化的c-fms蛋白，130kDa的带代表不成熟形式的非糖基化形式。对170kDa和130kDa带的强度进行了定量，并且一致检测到170kDa蛋白质更高。两种形式的c-fms的表达不受化合物I处理的影响，见下表4A。使用流式细胞术证实了化合物I不影响c-fms表达，其中在用0.5μM-2.5μM化合物I处理的FDC-c-fms细胞中c-fms的表面表达没有差别，并且略低于5.0μM化合物I处理细胞中的表达，见表4B。
表4A对c-fms种类的Western印迹定量
IC＝同种型对照表4B通过流式细胞术检测的表面c-fms
据证明，蛋白质酪氨酸激酶抑制剂化合物I的体外特性可以扩展到包括c-fms。抑制能力低于对Abl(IC50＝0.025μM)、c-kit(IC50＝0.1μM)或PDGF受体酪氨酸激酶(IC50＝0.25μM)的抑制能力。Western印迹表明，使c-fms酪氨酸磷酸化抑制50％所需化合物I的浓度为1.4μM。在该研究中，在用饱和剂量M-CSF进行特异受体刺激后的c-fms免疫沉淀物中检查了化合物I对c-fms磷酸化的影响。
化合物I可用于治疗涉及异常c-fms激活的疾病，包括普通的癌症如乳腺癌和上皮性卵巢癌以及炎性疾病如类风湿性关节炎。已经在包括乳腺癌和卵巢癌在内的广泛的人类癌症中证明了c-fms的异常表达，并且已经证明c-fms的激活通过尿激酶依赖性机制刺激肿瘤侵袭，见Kacinski B.M.1997，Mol Reprod Dev 4671-4，Sapi E和B.M.Kacinski，1999，Proc SocExp Biol Med 2201-8。乳腺肿瘤和晚期卵巢上皮癌中c-fms异常表达与肿瘤细胞的侵袭性和不利的临床预后相关，并且乳腺肿瘤产生M-CSF暗示着促进乳腺癌的骨转移，见Toy E.P.等人，2001，Gynecol.Oncol.80194-200，Sapi E.2004 Exp Biol Med 2291-11。化合物I对c-fms磷酸化的潜在抑制作用在潜在的药物毒性方面具有重要的暗示。在造血系统之外，c-fms信号在妊娠中起着重要的作用，其影响植入前胚胎发育和哺乳动物乳腺发育，见Pollard J.W.1997，Mol Reprod Dev 4654-60。通过M-CSF刺激，c-fms还在骨代谢和炎症过程中起着重要作用，见Fixe P.和V.Praloran，1998，Cytokine 1032-37。目前，虽然明确证明患者充分耐受化合物I，但是必须考虑到长期使用化合物I治疗的后果是化合物I潜在影响这些过程。
实施例2含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺单甲磺酸盐晶体形式的胶囊以下列组成制备含有119.5mg标题化合物(＝盐I)(对应于100mg化合物I(游离碱))作为活性物质的胶囊组成盐I 119.5mg微晶纤维素200mgPVPPXL15mg微粉硅胶(Aerosil) 2mg硬脂酸镁 1.5mg338.0mg胶囊通过将组分混合并且将混合物填充至1号明胶胶囊中制备。
权利要求
1.4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(化合物I)的用途，其用于制造治疗c-fms相关疾病的药物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中c-fms相关性疾病选自绒毛膜癌、恶性组织细胞病、胚胎性癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克-雅病或肌萎缩性侧索硬化。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中化合物I是单甲磺酸盐形式。
4.商业包装，包含化合物I或其可药用盐以及根据权利要求1或2的使用说明书。
5.治疗患有或可能患有选自绒毛膜癌、恶性组织细胞病、胚胎性癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克-雅病或肌萎缩性侧索硬化的c-fms相关性疾病的温血动物、优选人患者的方法，其包括向所述动物施用有效量的式I化合物。
全文摘要
本发明涉及4－(4－甲基哌嗪－1－基甲基)－N－[4－甲基－3－(4－(吡啶－3－基)嘧啶－2－基氨基)苯基]－苯甲酰胺(也称作伊马替尼(imatinib)、格利维克(gleevec)、格列卫(glivec)、cgp57148b或8TI571)或其可药用盐用于制造治疗c－fms相关疾病的药物中的用途，所述的c－fms相关疾病包括绒毛膜癌、恶性组织细胞病、胚胎性癌、子宫内膜癌、脑小神经胶质瘤、结节病、累及小神经胶质细胞的标准和变异的克－雅病或肌萎缩性侧索硬化。
文档编号A61P25/00GK101035535SQ200580033834
公开日2007年9月12日 申请日期2005年10月17日 优先权日2004年10月18日
发明者A·L·迪尤尔, T·P·休斯, A·B·里昂 申请人:梅特维特科学私人有限公司
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