用抗IgE抗体治疗和预防接受替代治疗的患者体内的超敏反应和/或过敏症的制作方法
专利名称：用抗IgE抗体治疗和预防接受替代治疗的患者体内的超敏反应和/或过敏症的制作方法
用抗IgE抗体治疗和预防接受替代治疗的患者体内的 超敏反应和/或过敏症
背景技术：
随着药物的更广泛的使用，药物诱导的过敏症频繁增加。抗菌 药是最为常见的始作俑者，而青霉素是被最广为研究的药物。其他 常引起这些反应的化合物包括非甾体类抗炎药、麻醉剂、肌肉松驰 药、胶乳和放射造影剂。最近，己经在被施用替代治疗分子的患者
中观察到了这些反应，所述分子如凝血剂，包括在血友病A或B患 者中的因子VIII和因子IX (Shopnick, et al., Transfusion (1996) 36: 358-61; Dioun， et al. B. J. Allergy Clin Immunol (1998) 102: 113-7); 粘多糖增多症患者使用的人a-L-艾度糖苷酸酶(Wraith, et al.， J Pediatr (2004) 144: 581-588);高歇氏病患者中的人P-葡糖脑苷脂酶 (Aviner, et al.， Blood Cells Mol Dis (1999) 25: 92-94)和法布里病患 者使用的人J3-半乳糖苷酶(Wilcox, et al.， Am J Hum Genet (2004) 75: 65-74)。
过敏症是免疫球蛋白(Ig) E介导的从肥大细胞和嗜碱性粒细胞 中免疫释放介质所引起的全身性严重性速发反应。
这种速发的超敏应答基于B细胞生成的免疫球蛋白E型抗体 (IgE抗体)，所述B细胞在暴露于作为过敏原的物质(即本文中 替代治疗分子)之后分化成了分泌抗体的浆细胞。IgE首先致敏局部 的肥大细胞；IgE抗体通过其恒定区与肥大细胞表面上的Fcs受体结 合，然后浆B细胞生成的IgE进入循环并与循环的嗜碱性粒细胞以 及全身组织中的肥大细胞上的Fce受体结合。随后，所结合的IgE 与过敏原相接触，通过与过敏原的结合交联高亲和力的IgE受体(FcsRI)，造成细胞脱粒并释放出大量的过敏介质，如组胺、前列
腺素、白三烯、蛋白酶等。这些物质的释放造成了速发型超敏反应 的临床症状，即呼吸道平滑肌的收縮、小血管的扩张以及血管对水 和血浆蛋白的通透性的增加、粘液的分泌、以及对皮肤的神经末梢 的刺激所造成的皮肤瘙痒和疼痛。另外，强化了第二次接触过敏原
后的反应，因为一些B细胞在第一次与过敏原接触后通过在细胞表 面表达IgE形成了表面IgE阳性的B细胞(sIgE+ B细胞)的"记忆 池(memorypool)"。第二次暴露可以导致一些患者的过敏症。
用抗IgE抗体治疗哮喘已经显示出其通过去除循环IgE以及下 调IgE免疫应答抑制过敏反应是有益的，IgE免疫应答是诱导哮喘的 最早期事件。因为其他抗体类型的应答未受到影响，因此实现了对 过敏症状的速发和长效的作用。对人嗜碱性粒细胞密度的早期研究 显示出了患者血浆IgE水平和每个嗜碱性粒细胞的FcsRI受体数目 之间的相关性(Malveaux " a/,, / C7/"./廳"，1978， 62:176)。他们 发现过敏个体和非过敏个体中的FcsRI密度范围从每个嗜碱性粒细 胞104到106个受体。后来发现通过抗IgE治疗过敏性疾病将循环 IgE的量降低到了治疗前水平的1 % ( MacGlashan " ， J! /mm朋o/., 1997， 158:1438-1445) 。 MacGlashan分析了从经完整抗IgE抗体治 疗过的患者中获得的血清，所述抗IgE抗体与循环于患者血清中的 游离IgE结合。他们报道降低患者体内的循环IgE水平造成了在嗜 碱性粒细胞表面上存在更低数目的受体。因此，他们假设嗜碱性粒 细胞和肥大细胞表面上的FcsRI密度是受循环IgE抗体水平直接或 间接调节的。
利用人源化的抗IgE抗体XOLAIR ，这种治疗方法已经被用于 治疗过敏性疾病，如过敏性鼻炎和哮喘(Corne， J. W C/k /匿仏1997, 99:879-887; Racine-Poon, A. " a/., C//w.尸/za環co/. T7zer. 1997， 62:675-6卯；Fahy， J.V. ef 爿m. J! C〃Y. O^e Met/. 1997,155: 1824-1834; Boulet, L. P. " a/" j附. / 7 esp. CWf. Oare Med., 1997, 155: 1835-1840; Milgrom， E. d a/" TV. J! Med， 1999， 341: 1966-1973)。这些临床数据证实抑制IgE与其受体的结合是治疗IgE介 导的疾病的有效方法。
接受替代治疗分子且表现出对所述分子的过敏性应答的患者必 须进行多次小剂量输注，以便诱导免疫耐受或使得患者脱敏。这对 于表现出严重过敏反应的患者是非常危险的，并且可以造成过敏性 休克。 一些患者不能进行这种类型的治疗，他们只能依赖于其他较 少有效的药物。具有完全基因缺失所造成的遗传缺陷的患者容易发 生这种类型过敏症的危险，因为他们对药物不具有耐受性。如果药 物不能被施用，这些常常都是致命的疾病，然而治疗同样也可能是 致命的。因此，非常需要容许施用替代治疗分子且没有超敏反应或 过敏症危险的治疗方法。
发明简述
本发明一般涉及通过施用抗IgE抗体或其结合片段治疗和/或预 防被施用一或多种引起IgE介导性应答的替代治疗分子的哺乳动物 体内的超敏反应和/或过敏症的方法。抗IgE抗体抑制哺乳动物体内 的IgE介导的过敏反应，因此降低了对替代治疗分子的过敏反应的 危险。随着时间施用抗IgE抗体下调了高亲和力的IgE受体
(FcsRI)，还降低了过敏应答的危险。
在本方法中，抗IgE抗体与循环或血清IgE和/或结合于B细胞 的IgE结合，但是优选地不与结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE 结合，因为这可能会造成交联。另外，抗IgE抗体也阻止了 IgE与 B细胞和抗原呈递细胞例如树突状细胞上的低亲和力的IgE受体
(FcsRII)的结合，因此进一步减少了 B细胞生成的过敏原特异性 IgE。本发明也涉及一种用于减轻或消除被施用一或多种替代治疗分 子的哺乳动物体内的IgE介导的应答的方法，包括给哺乳动物施用
抗IgE抗体。
本发明也涉及包括替代治疗分子和抗IgE抗体或其结合片段、 类似物或衍生物的药物组合物。
另外，哺乳动物应答于治疗所生成的一些IgE抗体是中和性 的，因此替代治疗(RT)的疗效随着时间而降低。因此，为了获得 最佳的临床受益，需要更高剂量的RT分子。通过施用与RT分子特 异性IgE结合的抗IgE抗体，减少了治疗患者所需的RT分子的量， 因此减少了药物施用的频率并潜在减少了患者的治疗费用。
所治疗的表现出IgE介导性应答的疾病包括但不限于遗传缺陷 病，例如血友病A和B、高歇氏病、法布里病、粘多糖增多症、涉 及先天性代谢错误的疾病、和肝酶疾病，例如酸性-a-糖苷酶。
抗IgE抗体包括但不限于天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗 体、单价抗体、双特异抗体、异缀合(heteroconjugate)抗体、多特 异抗体、人抗体、人源化抗体、去免疫抗体、或嵌合抗体、单链抗 体、Fv片段、Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库生成的片段、抗 独特型(抗Id)抗体(包括抗本发明的抗体的抗Id抗体)、以及上 面任何一种的表位结合片段。抗体可以是片段，例如Fab、 Fab'、 F(ab'》、Fv、和单个结合结构域片段。抗体也可以是单链抗体，例 如scFv。
本发明也涉及包括上述抗IgE抗体以及与一或多种药学可接受 的载体、稀释剂、赋形剂、或稳定剂组合的组合物的用途。可以通 过一或多种途径，包括静脉内、腹膜内、吸入、肌内、皮下和口服 途径施用本发明所用的抗体或组合物。利用给患者输送治疗有效量 的本发明请求保护的抗体的吸入设备可以施用本发明所用的抗体或 组合物。通过详细描述的说明书和权利要求书，本发明的其他部分将是 显而易见的。
发明详述
本申请中所用的术语被解释为本领域普通技术人员所知的一般 和典型含义。但是，如下面的说明书所说明的那样，对下面的术语 给出了最广义的合理解释。
本文所用术语"抗体"在此以其最广泛的含义使用，其包括免 疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有免疫特 异性结合抗原的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任一
类型的(例如，IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA或IgY)、任一类别的 (例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl或IgA2)或亚类的免疫球 蛋白分子。抗体包括但不限于天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗 体、单价抗体、双特异抗体、异缀合抗体、多特异抗体、人抗体、 人源化抗体、去免疫抗体、或嵌合抗体。天然抗体和免疫球蛋白通 常是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，它由两条相同的轻链 (L)和两条相同的重链(H)组成。每条重链在其一个末端都有一 个可变结构域(Vh)，紧接着的是多个恒定结构域。每条轻链在其 一个末端都有一个可变结构域(Vl)，以及在另一个末端具有一个 恒定结构域。但是，本文所用"抗体"包括仅具有一条链(对靶具 有特异性的重链或轻链)的单结构域抗体以及单链抗体、Fv片段、 Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库生成的片段、抗独特型(抗 Id)抗体(包括本发明抗体的抗Id抗体)、以及上面任何一种的表 位结合片段。
如本文所用，"人"抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列 的抗体，以及包括从人免疫球蛋白文库或从不表达内源性免疫球蛋白的、 一或多种人免疫球蛋白的转基因动物中分离的抗体，如下文
以及例如在Kucherlapati等的美国专利No. 5,939，598中所述。
本文所用术语"抗体片段"包括全长抗体的一部分，通常是靶 结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片 段。术语抗体的"结合片段"表示具有与全长抗体相同的定量的生 物活性或可检测到的免疫学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的结 合片段是与IgE免疫球蛋白结合和/或防止或显著地降低这个分子与 高亲和力受体FcsRI和/或低亲和力IgE受体FcsRII结合的能力的片 段。
本文所用术语"单克隆抗体"包括从基本上同质的抗体群中获 得的抗体。构成该群的单个抗体都是相同的，除了可能存在少量的 天然发生的突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对于单个靶位 点。此外，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传 统(多克隆)抗体制备不同的是，每个单克隆都针对于靶上的单个 决定簇。除它们的特异性以外，单克隆抗体的优点是可以通过杂交 瘤培养物合成，并且没有其他免疫球蛋白的污染。修饰词"单克 隆"表示从基本上同质的抗体群中获得的抗体的特征，并不能被解 释为需要用任何特殊的方法生成抗体。例如，本发明所用的单克隆 抗体可以通过熟知方法从噬菌体抗体文库中分离得到。可以用 Kohler and Milstein, Nature 256， 495 (1975)首先描述的杂交瘤方法制 备或者可以用重组方法制备本发明所用的亲代单克隆抗体。
"人源化"形式的非人(例如鼠)抗体包括嵌合的免疫球蛋 白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab')2或抗体的 其它耙结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。一 般而言，人源化抗体包括基本上所有的至少一个、典型地两个可变 结构域，其中所有或基本上所有的CDR区都对应于非人免疫球蛋白 的CDR区，以及所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体也可以包括至少一部分免疫球蛋白恒定区 (Fc)，典型地是所选的人免疫球蛋白模板的恒定区。
本文所用术语"抗IgE抗体"包括与一种或多种IgE分子结合 并抑制或显著降低IgE分子与高亲和力受体FcsRI和/或低亲和力受 体FcsRII的结合的抗体。抗IgE抗体可以与IgE分子的任何部分结 合，例如IgE分子的恒定区或可变区。抗IgE抗体可以与多种种类 的IgE分子结合或者可以与特殊的IgE种类结合，例如与IgE抗体的 结合位点结合。
本文所用术语"IgE介导的"包括以过度生成免疫球蛋白IgE和 /或IgE依赖性免疫学反应和炎症反应为特征的病变或疾病。它包括 但不限于与过敏性超敏反应相关的病变。
可以用RAST试验确定哺乳动物是否需要这种治疗。RAST试 验(放射变应原吸附试验的縮写)是用于确定患者是否对给定化合 物过敏的血液试验。RAST试验检测患者血液中的与给定过敏原特 异性反应的IgE的量。本发明打算利用替代治疗分子作为过敏原进 行RAST试验。
耙制备
可溶性的耙或其片段可以被用作生成抗体的免疫原，例如IgE 或其片段。可以重组生成或者用合成方法制备靶。也可以从天然来 源中分离出靶。
抗IgE抗体的生成
用本领域已知的任何合适的方法都可以生成本发明所用的抗 体。本发明所用的抗体可以包括单克隆抗体。制备抗体的方法对于 本令页域技术人员是已知的(Harlow, et al.， Antibodies: a LaboratoryManual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988),)，在
此以其全文并入参考)。
例如，如上所述的免疫原可以被施用给多种宿主动物，包括但 不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导生成含有特异于所述抗原的多克 隆抗体的血清。免疫原的施用可以包括一次或多次注射免疫剂，如 果需要还可以包括佐剂。根据宿主种类，可以用多种佐剂增加免疫 学应答，佐剂包括但不定于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物质胶 例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、 和可能有用的人佐剂例如BCG (卡介苗)以及短小棒状杆菌
(Co^y e^cter/mw / wvmw )。其他可以采用的佐剂的例子包括 MPL-TDM佐齐U (单磷酰月旨质 A 、 合成的 trehalose dicorynomycolate)。本领域技术人员不需要过多的实验就可以选择 出免疫接种方案。这些佐剂在本领域也是公知的。
典型地，通过多次皮下或腹膜内注射可以给哺乳动物注射免疫 原和/或佐剂，尽管也可以通过肌肉内和/或静脉内给于。免疫原可以 包括人IgE多肽或其融合蛋白或变体。根据多肽的性质(即疏水性 百分比、亲水性百分比、稳定性、净电荷、等电点等)，将免疫原 缀合于已知在被免疫的哺乳动物中已知具有免疫原性的蛋白可能是 有用的。这种缀合包括通过给本发明所用的抗体和免疫原性蛋白衍 生出活性化学功能基团以便形成共价键的化学缀合、或通过基于融 合蛋白的方法、或本领域技术人员已知的其他方法。这种免疫原性 蛋白的例子包括但不限于匙孔血蓝蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、 牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、以及泛主T辅助肽
(promiscuous T helper peptide)。如上所述，可以用多禾中佐剂增加 免疫学应答。利用杂交瘤方法可以制备单克隆抗体，例如Kohler和 Milstein， Nature, 256:495 (1975)和美国专利No. 4,376,110、 Harlow 等，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2,sup.nd ed. (1988)、 Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-Cdl Hybridomas (Elsevier, N.Y., (1981))所述的那些方法，或 者本领域技术人员已知的其他方法。可以被用于生成单克隆抗体的 方法的其他例子包括但不限于人B细胞杂交瘤技术(Kosbor etal., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al,, 1983, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 )和EBV杂交瘤技术(Cole et al" 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss， Inc., pp, 77-96)。这些抗体可以是任一免疫球蛋白类别，包括IgG、 IgM、 IgE、 IgA、 IgD及其任一亚类。可以在体外或体内培育生产本发明 的mAb的杂交瘤。
在杂交瘤方法中，典型地用免疫原免疫接种小鼠、人源化小 鼠、具有人免疫系统的小鼠、仓鼠、或其他合适的宿主动物，以引 发生成或能够生成与IgE特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可 以用抗原体外免疫淋巴细胞。
通常，在制备产生抗体的杂交瘤中，如果需要人类来源的细 胞，可以使用外周血淋巴细胞("PBL")，如果需要非人哺乳动 物来源的细胞，可以使用脾细胞或淋巴结细胞。然后利用适当的融 合剂例如聚乙二醇融合淋巴细胞和永生化细胞系，以形成杂交瘤细 胞(Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), pp. 59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细 胞，特别是啮齿类动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。常常采用大鼠 或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以培养于合适的培养基中，所 述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或存 活的物质。例如，如果亲代细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地包括次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸苷("HAT培养基")，所述物质阻止了 HGPRT缺 陷细胞的生长。
优选的永生细胞系是那些能有效融合的、支持所选的产抗体细 胞稳定地高水平表达抗体的那些细胞系，并且是对培养基例如HAT 培养基是敏感的。例如，永生细胞系包括鼠骨髓瘤细胞系，例如可 以从Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.禾卩the American Type Culture Collection, Manassas, Va.获得。如在说明书中 所指出的那样，也描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨骨遣瘤细胞系(heteromyeloma cell lines ) ( Kozbor， J. Immunol" 133:3001 (1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker， Inc., New York, (1987) pp. 51-63)。
然后可以分析培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对IgE的 单克隆抗体。用免疫沉淀法或体外结合检测法例如放射免疫检测法 (RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)可以测定出杂交瘤所生成的单 克隆抗体的结合特异性。这些技术在本领域是已知的，并且是在本 领域技术人员的知识范围之内。例如，用Scatchard分析可以测定出 单克隆抗体与IgE的结合亲和力(Munson et al., Anal. Biochem, 107:220(1980))。
在鉴定出所需的杂交瘤细胞之后，通过限制稀释方法可以亚克 隆所述克隆，并用标准方法进行生长(Goding，如前)。用于此目 的的合适的培养基包括例如Dulbecco，s Modified Eagle's培养基和 RPMI-翻。
用传统的免疫球蛋白纯化方法例如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层 析、凝胶排阻层析、凝胶电泳法、透析或亲和层析都可以从培养基 中分离或纯化出亚克隆所分泌的单克隆抗体。本领域具有多种用于生产单克隆抗体的方法，因此本发明并没
有局限于仅在杂交瘤中生产。例如，用在美国专利No. 4,816,567中 所述的那些重组DNA方法可以制备单克隆抗体。在上下文中，术语
"单克隆抗体"指衍生自单个真核、噬菌体、或原核克隆的抗体。 利用传统方法可以容易地克隆并测序编码本发明的单克隆抗体的 DNA (例如，通过使用能与编码鼠抗体的重链和轻链、或来自人、 人源化的或其他来源的这些链的基因特异性结合的寡核苷酸探 针)。本发明的杂交瘤细胞作为这些DNA的优选来源。 一旦分离， DNA可以被置于表达载体内，然后将表达载体转化到不能生成免疫 球蛋白的宿主细胞例如NSO细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢
(CHO)细胞或骨髓瘤细胞内，以实现在重组宿主细胞内合成单克 隆抗体。例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同 源的鼠序列(美国专利No. 4,816,567; Morrison et al,如前)，或者 通过将免疫球蛋白的编码序列共价地连接于非免疫球蛋白多肽的编 码序列的全部或部分，也可以修饰DNA。这种非免疫球蛋白多肽可 以被取代为本发明抗体的恒定结构域，或者可以被取代为本发明抗 体的一个抗原组合位点(antigen-combining site)的可变结构域，生 成能够与超过一种类型的抗原结合的二价抗体。
抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法在本领域是熟 知的。例如， 一种方法包括重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重 链。通常在Fc区的任一位点截短重链，以阻止重链交联。或者，相 关的半胱氨酸残基可以用另一种氨基酸残基取代或者被缺失，以阻 止交联。
用已知的技术可以生成能识别特异表位的抗体片段。例如，通 过用酶例如木瓜蛋白酶(生成Fab片段)或胃蛋白酶(生成F(ab')2 片段)蛋白酶剪切免疫球蛋白分子可以生成本发明所用的Fab和F(ab')2片段。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结 构域。
对于一些用途，包括抗体在人体的体内用途以及体外检测法中 的用途，优选地使用嵌合的、人源化的、或人抗体。嵌合抗体是其 中抗体的不同部分衍生自不同的动物物种的分子，例如具有衍生自 鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生成嵌 合抗体的方法在本领域是己知的。见例如Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202;美国专利5，807，715、 4,816,567和 4,816397，在此以其全文并入参考。人源化抗体是来自非人物种抗 体的与所需抗原结合的抗体分子，所述分子具有一种或多种来自非 人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区 (FR)。用来自CDR供体抗体的相应残基取代人构架区中的构架 残基，以变更、优选提高抗原结合。用本领域公知的方法鉴定出这 些构架取代，例如通过CDR和构架残基的相互作用的建模来鉴定对 抗原结合重要的构架残基，以及通过序列比较鉴定特殊位点上的独 特构架残基(见例如Queen et al.,美国专利5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)，在此以其全文并入参考)。
用本领域已知的多种技术可以将抗体人源化，所述技术包括例 如CDR移植(EP 239,400、 PCT申请WO 91/09967、美国专利 5,225,539、 5,530,101禾n 5,585,089 )、镶饰(veneering)或重塑 (resurfacing) ( EP 592,106 、 EP 519,596 、 Padlan， Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991) ; Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994))和链改组(chain shuffling)(美国专利5,565,332)。人源 化抗体通常具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这 些非人氨基酸残基常常被称作"输入(import)"残基，其典型地来自于"输入"可变结构域。遵照Winter及其同事(Jones etal., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)的方法，人源化可以 基本上通过用啮齿类动物的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序 列来进行。因此，这些"人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利No. 4,816,567)，其中非常少的完整的人可变结构域被来自非人物种的 相应序列所取代。实践中，人源化抗体典型地是人抗体，其中一些 CDR残基以及可能的一些FR残基被啮齿类动物抗体的类似位点所 取代。
人源化抗体通常包括基本上所有的至少一个、典型2个可变结 构域，其中所有或基本上所有的CDR区都对应于非人免疫球蛋白的 CDR区，以及所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白共有序 列的FR区。人源化抗体最佳地也包括至少一部分免疫球蛋白恒定区 (Fc)，典型地是人免疫球蛋白的Fc (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)1和Presta， Curr. Op. Struct. Biol" 2:593-596 (1992))。
完全的人抗体特别适合于人类患者的治疗性治疗。用本领域已 知的多种方法可以制备人抗体，所述方法包括上述利用衍生自人免 疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示法。也见于美国专利No. 4,444,887和4,716,111;和PCT公开WO 98/46645、 WO 98/50433、 WO 98/24893、 WO 98/16654、 WO 96/34096、 WO 96/33735和WO 91/10741，在此以其全文并入参考。Coleetal.,和Boerder et al.的技 术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss， (1985);禾卩 Boerner et al.， J. Immunol" 147(l):86-95, (1991))。
利用不能表达功能性内源免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基 因的转基因小鼠也可以生成人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机地或经同源重组导入小鼠胚胎干细胞内。 或者，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人可变区、恒定区和 多变区导入小鼠胚胎干细胞内。通过经同源重组导入人免疫球蛋白 基因座可以分别或同时使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因成为无 功能的。具体地，JH区的纯合缺失阻止了内源抗体的生成。扩增修 饰的胚胎干细胞，并将其微注射到胚泡内生成嵌合小鼠。然后喂养 嵌合小鼠以生成表达人抗体的纯合后代。
用所选的抗原按正常的方式免疫接种转基因小鼠。利用传统的 杂交瘤技术可以从免疫接种的转基因小鼠中获得针对所述抗原的单 克隆抗体。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化 期间进行重排，并随后进行类别转换和体细胞突变。因此，利用这
种技术，可以生产治疗用的IgG、 IgA、 IgM和IgE抗体。关于生产 人抗体的技术的综述，见Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)。关于对用于生产人抗体和人单克隆抗体的技术以及生 产这些抗体的方案的详细讨论，见例如PCT公开WO 98/24893、 WO 92/01047、 WO 96/34096、 WO 96/33735、欧洲专利No. 0598 877、美国专利No. 5,413,923、 5,625,126、 5,633,425、 5,569,825、 5，661，016 、 5,545,806 、 5,814,318 、 5，885，793 、 5,916,771和 5,939,598，在此以其文并入参考。另外，公司如Abgenix, Inc. (Freemont, CA)、 Genpharm (San Jose, CA.)禾口 Medarex， Inc. (Princeton, NJ)都能利用与上述相似的技术提供针对所选抗原的人抗体。
相似地，通过往转基因动物例如其中内源免疫球蛋白基因已经 被部分或完全失活的小鼠中导入人免疫球蛋白基因座可以制备人抗 体。攻击后，观察到人抗体生成，其在所有方面都与在人中所看到 的极为相似，包括基因重排、装配以及抗体池(antibody repertoire) 的形成。例如，在美国专利No. 5,545,807、 5,545,806、 5,569,825、 5,625,126、 5，633，425、 5,661,106以及下面的科学文献Marks et al.，Biotechnol., 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994) ; Fishwild et al., Nature Biotechnol., 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.， 14:826 (1996); Lonberg and Huszer, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)中都描述了这种方法。
通过免疫移植了人外周血白细胞、脾细胞或骨髓(例如XTL的 Trioma技术)的小鼠也能制备人单克隆抗体。利用称作"导向选择 (guided selection)"的技术可以生成识别所选表位的完全的人抗 体。在这个方法中，用所选的非人单克隆抗体例如小鼠抗体指导选 择识别相同表位的完全的人抗体(Jespers et al., Bio/technology 12: 899-卯3 (1988))。
异缀合抗体也可以用于本发明。异缀合抗体是由两种共价连接 的抗体组成。这些抗体例如已经被提议用于将免疫系统细胞耙向于 非所需细胞(美国专利No. 4,676,980)。打算利用合成蛋白质化学 中已知方法在体外制备抗体，所述方法包括涉及交联剂的那些方 法。例如，利用二硫化物交换反应或者通过形成硫酯键可以构建免 疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括iminothiolate和methyl-4-mercaptobutyrimidate以及那些例如在美国专利No. 4,676,980中所 述的试剂。
抗IgE抗体的鉴定
测试候选的抗IgE抗体，用酶联免疫吸附检测法(ELISA)、 Western免疫印迹法或其他免疫化学技术可以进行鉴定。进行检测以 表征单个抗体，包括(1)抑制IgE与带FcsRI的肥大细胞和嗜碱 性粒细胞的结合；(2)抑制IgE与带FcsRII的树突状细胞和B细 胞的结合；(3)与带膜IgE的B细胞结合；及(4)抑制IgE与固 相上的重组可溶性FcsRI蛋白的结合。用一种或多种检测法选择出 作为抗IgE抗体的单个抗体。本发明所用的抗体包括但不限于天然抗体、多克隆抗体、单克 隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异缀合抗体、多特异性抗体、 人抗体、人源化抗体、去免疫抗体、或嵌合抗体、单链抗体、Fv片
段、Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库生成的片段、抗独特型 (抗Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗独特型抗体)、以及上面 任一的表位结合片段。
抗体可以是人抗原结合抗体片段，并包括但不限于Fab、 Fab'和 F(ab')2、 Fd、单链Fvs (scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs
(sdFv)及包括VL或VH结构域的片段(其是结合片段的例子)。 包括单链抗体的结合抗原抗体片段可以单独包括可变区或者可变区 与下面的全部或部分组分的组合绞链区、CH1、 CH2、和CH3结 构域。本发明也包括抗原结合片段，其包括可变区与绞链区、 CH1、 CH2、禾Q CH3结构域的任一组合。本发明的抗体可以来自任 何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、非人灵长 类动物、啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、 豚鼠、骆驼、马或鸡。
根据抗体所识别的或特异结合的IgE的表位或部分可以描述或 说明本发明所用的抗体。所述表位或多肽部分可以如本文所述说 明，例如通过N末端和C末端的位置、通过连续氨基酸残基的大 小、或者WO05/075504所公开的那些内容，其在此并入参考。
抗体片段
已经开发出了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，这些片 段提供完整抗体的蛋白裂解消化而衍生(见，例如Mori脂toetal., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)和 Brennanetal.， Science 229: 81 (1985))。但是，现在可以用重组宿主 细胞直接生成这些片段。例如，可以从抗体噬菌体文库中分离出抗体片段。或者，可以从大肠杆菌(￡. co//)中直接回收到F(ab')2-SH 片段，并化学偶联形成F(ab')2片段(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中 直接地分离到F(ab')2片段。用于生成抗体片段的其他技术对于本领 域技术人员是显而易见的。在其他的实施方案中，所选的抗体是单 链Fv片段(scFv) (PCT专利申请WO 93/16185)。抗体的结合片 段包括Fv、 F(ab)、和F(ab')2片段。"Fv"片段含有完整的靶识别及 结合位点。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，确 定出VH-VL二聚体表面上的靶结合位点。总而言之，6个CDR赋予 了抗体靶结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或仅仅包括特 异于靶的三个CDR的半个Fv)也具有识别并结合靶的能力，尽管 亲和力比整个结合位点低。单链Fv (ScFv)抗体片段包括抗体的 Vh和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链上。Fv多肽通 常还包括Vh和VL结构域之间的多肽接头，其使得ScFv形成用于靶 结合的所需结构。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域 (CH1)。通过在重链CH1结构域的羧基末端添加一些残基，包括 抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸，Fab'片段与Fab片段有所不 同。通过裂解F(ab')2胃蛋白酶消化产物的绞链半胱氨酸之间的二硫 键生成了 F(ab')片段。抗体片段的其他化学偶联对于本领域技术人员 是已知的。
生成抗IgE抗体的方法
用合成抗体领域已知的任一方法都可以生成本发明所用的抗 体，特别地是通过化学合成，或优选地通过重组表达技术。
抗IgE抗体或其片段(例如抗体的重链或轻链或单链抗体)的 重组表达需要构建含有编码抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。 一旦已经获得编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其 部分的多核苷酸，利用本领域公知的技术通过重组DNA技术可以生 成用于生成抗体分子的载体。因此，在此描述了通过表达含有抗体 编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员 公知的方法可以用于构建含有抗体编码序列以及合适的转录及翻译
控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成 技术以及体内遗传重组。因此，可以用包含与启动子可操纵地连接 的核苷酸序列的可复制载体制备抗IgE抗体，所述核苷酸序列编码 本发明所用的抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变结构 域。这些载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(见例 如PCT公开WO 86/05807、 PCT公开WO 89/01036、和美国专利No. 5,122,464)并且抗体的可变结构域可以被克隆到这种载体内，以便 表达整个重链或轻链。
用传统技术将表达载体转移到宿主细胞内，然后用传统技术培 养转染细胞以生成本发明的抗体。在用于表达双链抗体的优选实施 方案中，可以在宿主细胞内共表达编码重链和轻链的载体以表达整 个免疫球蛋白分子。
可以用多种宿主表达载体系统表达本发明所用的抗体分子。这 些宿主表达载体代表可以通过其生成并随后纯化感兴趣编码序列的 载体，也可以表示当被合适核苷酸编码序列转化或转染时能原位表 达本发明的抗体分子的细胞。这些宿主表达载体包括但不限于微生 物，例如经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘 粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(S. ^Z)"fe));经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母 (例如酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia));经含 有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫 细胞系统；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)感染的或经含有抗体编码序列的重组质粒表 达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有衍生自哺乳动 物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动
物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子) 的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、 CHO、 BHK、 293、 3T3细胞)。优选地，用于表达重组抗体分子的是细菌细胞， 例如大肠杆菌，以及更优选地是真核细胞，特别是用于表达整个重 组抗体分子的真核细胞。例如，与载体例如来自人巨细胞病毒的主 要中间早期基因启动子元件相连接的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵 巢细胞(CHO)是抗体的有效表达载体(Foeckingetal.， Gene 45:101 (1986); Cockett et al.， Bio/Technology 8:2 (1990))。
在细菌系统中，根据所表达抗体分子的用途，可以有利地选择 多种表达载体。例如，对于生成抗体分子的药物组合物，当要生成 大量的这种蛋白时，指导高水平地表达能被容易纯化的融合蛋白产 物的载体是所需的。这些载体包括但不限于大肠杆菌表达载体 pUR278 (Rutheretal"EMBOJ. 2:1791 (1983))，其中抗体编码序列 可以被单个地框内连接于具有lac Z编码区的载体，以便生成融合蛋 白；pIN载体(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) 等。也可以用pGEX载体将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶 (GST)的融合蛋白。通常，这些融合蛋白是可溶的，并通过吸附 以及与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠结合以及随后在存在游离谷胱甘肽的 情况下洗脱可以容易地从裂解细胞中被纯化。pGEX载体被设计成 包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，使得可以从GST部分中释 放出克隆的耙基因产物。
在昆虫系统中，可以用苜蓿银纹夜蛾(J^3grap/2" cfl/z/or /co) 核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。病毒生长于草地夜蛾(&o^ptera/rwgi^eW")内。可以将抗体编码序列单独地 克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)内，并将其置于 AcNPV启动子(例如多晶体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用大量的基于病毒的表达系 统。在腺病毒被用作表达载体的情况中，感兴趣的抗体编码序列与 腺病毒转录/翻译控制复合物例如晚期启动子和三联前导序列相连 接。然后，通过体外或体内重组可以将该嵌合基因插入到腺病毒基 因组内。在病毒基因组的非必需区域(例如El或E3区)内的插入 生成了重组病毒，其是活病毒并且能在受感染的宿主内表达抗体分 子(例如见Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984))。对所插入的抗体编码序列的有效翻译可能也需要特异的起 始信号。这些信号包括ATG起始密码子和临近序列。此外，起始密 码子必须与所需编码序列的读框同相(in phase)以保证整个插入物 的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的， 包括天然和合成的。通过引入合适的转录增强子元件、转录终止子
等可以增强表达效率(见Bittner et al.， Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987))。
另外，可以选择出宿主细胞株，其以所需的特殊方式调节所插 入序列的表达，或者修饰并加工基因产物。对蛋白产物的这种修饰 (例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白的功能可能是重要 的。不同的宿主细胞具有用于蛋白和基因产物的翻译后加工及修饰 的特征性和特异的机制。可以选择出合适的细胞系或宿主系统以保 证正确的修饰并加工所表达的外源蛋白。至今为止，可以使用具有 用于合适加工原始转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的 真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、 COS、 293、 3T3、或骨髓瘤细胞。对于重组蛋白的长期高产率的生成，稳定的表达是优选的。例 如，可以工程化稳定表达抗体分子的细胞系。用受合适的表达控制 元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸位点
等)和选择标记物控制的DNA可以转化宿主细胞，而不是用含有病 毒复制起点的表达载体。在导入外源DNA之后，工程化的细胞可以 容许在富集培养基中生长1到2天，然后转移到选择培养基内。重 组质粒内的选择标记物赋予了对选择的抗性，并容许细胞稳定地将 质粒整合到其染色体内并生长形成转化灶(focus)，其依次可以被 克隆并扩增成细胞系。该方法可以被便利地用于工程化表达抗体分 子的细胞系。这些工程化的细胞系可以特别适用于筛选并评价与抗 体分子直接或间接地相互作用的化合物。
可以使用多种选择系统，包括但不限于分别在tk、 hgprt或aprt 细胞中可以使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler et al., Cell 11:223 (1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Szybalska & Szybalski， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992))和腺嘌呤磷酸 核糖转移酶基因(Lowyetal., Cell 22:817 (1980))。抗代谢物抗性也 可以被用作选择下面基因的基础dhfr，其赋予了对氨甲蝶呤的抗性
(Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 77:357 (1980); O'Hare et al.: Proc.Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)) ; gpt，其赋予了对霉酚酸 的抗性(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)) ; neo，其赋予了对氨基糖苷G-418的抗性(Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991));以及hygro，其赋予了对潮霉素的抗性
(Santerreetal.， Gene 30:147 (1984))。重组DNA技术领域普遍知道 的方法可以被常规地应用于选择所需的重组克隆，例如在Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (19卯)；以及在Chapters 12 and 13，Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)
中描述了这些方法，在此以其全文并入参考。
通过载体扩增可以增加抗体分子的表达水平(综述见 Bebbington and Hentschel， "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" (DNA Cloning, Vol.3. Academic Press, New York, 1987))。当表达抗 体的载体系统中的标记物是可扩增的时，增加宿主细胞培养物中的 抑制物的水平可以增加标记物基因的拷贝数。因为扩增区与抗体基 因相关，所以也会增加抗体的产量(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983))。
宿主细胞可以被两种表达载体所共转染，第一种载体编码重链 衍生多肽以及第二种载体编码轻链衍生多肽。两种载体都含有能够 等量表达重链多肽的相同的选择标记物。或者，可以使用编码并能 表达重链和轻链多肽的单个载体。在这种情况中，轻链应该置于重 链之前，以避免生成过量的有毒游离重链(Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler， Pro" Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980))。重链和 轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
一旦通过动物、化学合成或重组表达生成了抗IgE抗体，用本 领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任一方法都可以将其纯化， 例如通过层析法(例如离子交换层析、亲和层析、特别是通过蛋白 A后的特异抗体的亲和层析，以及大小排阻层析)、离心、差异溶 解度、或通过用于纯化蛋白的任何其他标准技术。另外，抗体或其 片段可以与在此所述的或本领域已知的异源多肽序列融合，以促进 纯化。
本发明涵盖抗IgE抗体或其与多肽重组融合的或化学缀合的 (包括共价或非共价缀合的)片段的用途。在使用本领域已知方法的体外免疫检测法和纯化方法中都可以使用本方法所用的融合的或
缀合的抗体。见例如Harbor et al.,如前；和PCT申请WO 93/21232、 EP 439,095 、 Naramura et al" Immunol, Lett. 39:91-99 (1994);美国专利No.5,474,981、 Gillies et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428-1432 (1992); Fell et al.， J. Immunol. 146:2446-2452(1991);在此
以其全文并入参考。
此外，抗体或其片段可以与标记物序列例如肽融合以便促进纯 化。在优选的实施方案中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如 pQE载体所提供的标记等(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif" 91311)，其中多种标记物是可商购获得的。如在 Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)中所述的那 样，例如，六组氨酸提供了对融合蛋白的便利纯化。其他用于纯化 的肽标记包括但不限于"HA"标记，其对应于衍生自流感血凝素蛋 白的表位(Wilson etal., Cell 37:767 (1984))禾Q "flag"标记。
药物制剂
通过混合具有所需纯度的抗体以及任选的本领域典型所用的 "药学可接受的"载体、赋形剂或稳定剂(所有都被称作"赋形 剂")可以将抗IgE抗体或其片段的治疗性制剂制备成冻干制剂或 水溶液的储存物。例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂 (isotonifier)、非离子型去污剂、抗氧化剂和其他各种添加剂(见 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed. (1980))。在所采用的剂量和浓度，这些添加剂对受体必须是无毒 的。治疗性制剂也可以包括抗IgE抗体或片段和替代分子的组合。
缓冲剂有助于将pH值维持于近似生理条件的范围内。它们的浓 度范围优选是从约2mM到约50mM。用于本发明所用的抗体的合适 的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸缓冲剂(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬 酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸一钠 混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、 酒石酸缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合 物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸一钠混合物等)、延胡索酸缓冲液(例如延胡索酸-延胡索
酸一钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸一钠-延胡 索酸二钠混合物等)、葡糖酸缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合 物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸缓 冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸 钾混合物等)、乳酸缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化 钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸缓冲液(例如乙酸-乙酸 钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，也提到了磷酸缓冲
液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐例如Tris。
可以加入防腐剂延缓微生物生长，加入量的范围为0.2%到1%
(w/v)。用于与本发明所用的抗体一起使用的合适的防腐剂包括苯
酚、苯甲醇、甲酚(metacresol)、羟苯甲酯、羟苯丙酯、氯化十八 烷基二甲基苄基铵、benzalconiumhalides (例如氯、溴、碘)、六甲 氯铵、对羟基苯甲酸垸酯例如羟苯甲酯或羟苯丙酯、儿茶酚、间苯 二酚、环己醇和3-戊醇。
可以加入有时被称作"稳定剂"的等渗剂以保证液体组合物的 等渗性，其包括多羟糖醇，优选三羟或更高的多羟糖醇，例如丙三 醇、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
稳定剂指一大范围的赋形剂，其功能范围可以从膨胀剂到溶解 治疗剂或有助于预防变性或粘附于容器壁的添加剂。典型的稳定剂 可以是多羟糖醇(如上列举的) ，氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，例如乳糖、 海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇
(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇，例如肌醇
(inositol);聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，例如尿
素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、oc-—硫代甘油和 硫代硫酸钠；低分子量多肽(即小于IO个残基)；蛋白质，例如人 血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物， 例如聚乙烯吡咯垸酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖； 二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖，例如棉子糖；多糖，例如 葡聚糖。稳定剂的范围可以从每活性蛋白部分重量的0.1到IO，OOO
倍重量。
可以加入无毒的表面活性剂或去污剂(也称作"增湿剂")以 有助于溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白避免发生搅拌诱导的聚集， 这也容许制剂暴露于有张力的剪切面，且不引起蛋白的变性。合适
的无毒的表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、 80等)、polyoxamer (184、 188等)、Pluronic⑧多元醇、聚氧乙烯失水山梨糖醇单酯 (TWEEN -20、 TWEEN -80等)。无毒的表面活性剂的范围可以
从约0.05mg/ml到约 1.0mg/ml ， 优选从约0.07mg/ml到约
0.2mg/ml。
附加的多种赋形剂包括膨胀剂(例如淀粉)、螯合剂(例如 EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和潜溶 剂。根据所治疗的特殊适应症所需，本文制剂也可以含有一种以上 的活性化合物，优选地是具有互补活性且不互相不利影响的那些化 合物。例如，进一步提供免疫抑制剂可能是所需的。在组合物中所 具有的这些分子的量对于目标目的是有效的。活性组分也可以包裹 于例如经coascervation技术或经界面聚合法所制备的微胶囊例如羟 甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(异丁燏酸甲酯)微胶囊中，于胶状药物输送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳
米胶囊)或大乳剂中。在Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)中阐述了这些技术。
用于体内使用的制剂是无菌的。例如通过经无菌滤膜的过滤可 以容易地完成这一点。可以制备出缓释制品。缓释制品的合适的例 子包括含有抗体变体的固体疏水性聚合物的半通透基质，所述基质 是成形的形式，例如膜片或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水 凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯
(美国专利No. 3,773,919) 、 L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、 不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物，例如 LUPRON DEPOTTM (由乳酸-羟基乙酸共聚物和乙酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)组成的可注射的微球)、以及聚-D-(-)-3-羟基丁 酸。虽然聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够释放分子 100多天，但是某些水凝胶只能释放蛋白更短的时间。当被包囊化 的抗体在体内停留长时间时，在37。C对湿度的暴露可以使得它们变 性或聚集，造成生物活性的对失以及免疫原性的可能变化。根据所 涉及的机理可以设计出用于稳定的合理的策略。例如，如果发现聚 集机制是因为经硫代二硫化物互换所形成的分子间S-S键，那么通 过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制水份含量、利用合适的添加 剂以及开发特异的聚合物基质组成都可以实现稳定作用。
能有效地治疗特殊疾患或病变的抗体或其片段的量依赖于疾患 或病变的性质，通过标准的临床技术可以确定出来。只要可能，需 要首先在体外确定出本发明的剂量-应答曲线和药物组合物，然后在 进行人体试验之前先在动物模型系统中进行测试。
在优选的实施方案中，通过皮下注射可以施用抗体或其片段的 水溶液。每个剂量范围可以从每kg体重约0.5mg到约50mg，或者 更优选地从每kg体重约3mg到约30mg。根据多种临床因素包括疾病类型、疾病严重度和对象对治疗剂 的敏感性，用于皮下施用的剂量方案可以从每月1次到每日1次不 等。
本发明的治疗性应用
单独施用或与细胞毒因子联合施用或与替代治疗分子联合施用
的、有或没有治疗部分与之缀合的抗IgE抗体被用作为治疗剂。为 了治疗或预防与替代治疗相关的IgE介导的疾病、疾患或病变，本 发明包括基于抗体的治疗，其包括给动物、优选哺乳动物、及最优 选人施用抗IgE抗体。
本发明所用的抗IgE抗体可以被治疗性地用于多种疾病。抗体 可以用于治疗其中给患者施用了替代治疗分子的任一疾病，所述替 代治疗分子引发IgE介导的应答，从而降低了过敏性休克的危险或 缓解了与过敏性介质的释放相关的超敏反应症状。这些抗体通过清 除特异于所施用分子的中和IgE分子也可以减少治疗的频率和/或替 代治疗分子的剂量。为了治疗疾患，优选地使用针对IgE的高亲和 力的和/或有效的体内抑制抗体或中和抗体、其片段或区域，并且适 用于本方法的治疗的抗体优选地不应当与结合于致敏的肥大细胞和 嗜碱性粒细胞上的IgE反应，但应当保持识别可溶性IgE和B细胞 上的膜IgE的能力。
本发明所用的治疗性化合物包括但不限于抗IgE抗体(包括在 此所述的其片段、类似物和衍生物)以及编码抗体的核酸。可以用 本领域己知的或本文所述的药学可接受的组合物提供本发明所用的 抗体。例如在Chang et al. (Biotechnology 8, 122-126 (1990));欧洲专 利No. EP0407392和一些美国专利，包括美国专利No. 5,449,760、 5,422,258和5,614,611中都已经描述了这种IgE同种型特异抗体。本 发明所用的其他抗体包括如在WO04070010和WO04070011中所述的高亲和力抗IgE抗体以及在美国专利5,965,709、 5,994,511、 6,172,213、 6329,509、 6，682，735禾卩6,761,889中所述的抗IgE抗体。 所有这些专利和申请均并入本文参考。
可以单独地或联合其他类型的治疗例如免疫治疗、支气管扩张 剂、抗组胺药或抗白三烯药物一起施用抗IgE抗体。
可以在替代治疗之前、期间或之后施用抗IgE抗体。如上所 述，替代治疗被用于治疗患有血友病A或B、粘多糖增多症、高歇 氏病和法布里病以及蓬佩病(Pompe disease)和其他遗传性或获得 性生物学蛋白缺陷症的患者。可以急性期或长期基础给予替代治 疗。替代治疗包括但不限于酶替代治疗、IgG替代治疗和激素替代 治疗。替代治疗的常见例子是直接往血液中注射低的或缺失的凝血 因子以治疗血友病。
可以在施用一种或多种替代治疗分子之前、期间或之后施用抗 IgE抗体。替代治疗分子包括但不限于凝血物质，包括因子VIII和 因子IX;人a-L-艾度糖苷酸酶；laronidase;人(3-葡糖脑苷脂酶；伊 米苷酶(imiglucerase);阿糖苷酶(alglucemse);人(3-半乳糖苷酶 A; agalsidase (3;人a-葡糖苷酶；alglucosidase a;或被施用替代哺 乳动物体内的缺陷蛋白并且能引起IgE介导的反应的任何蛋白。替 代治疗分子可以包括用于或通过基因治疗输送的分子。例如，通过 利用基因治疗可以输送作为替代治疗分子的人p-葡糖脑苷脂酶。
本发明提供了通过给哺乳动物施用有效量的抗IgE抗体或包括 抗IgE抗体的药物组合物治疗和预防超敏反应和/或过敏症的方法。 在一个优选方面，抗体是基本上纯化的(例如，基本上不含有限制 其作用或产生非所需副作用的物质)。
多种输送系统都是已知的，并且可以用于施用本发明所用的抗 体，包括例如注射液、脂质体包囊、微粒、微囊、能表达化合物的 重组细胞、受体介导的胞吞作用(见例如Wu et al., J. Biol. Chem.262:4429-4432 (1987))、作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核 酸的构建体等。
可以按任一可接受的方式给哺乳动物施用抗IgE抗体。导入方 法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜 外、吸入和口服途径。通过任一便利途径可以施用抗体或组合物， 例如通过输注或弹丸式注射、通过经表皮或粘膜层的吸收(例如口 腔粘膜、直肠和肠粘膜等)并且可以与其他生物活性物质一起施 用。施用可以是全身的或局部的。另外，希望可以通过任何合适的 途径将治疗性抗体或组合物导入到中枢神经系统内，所述途径包括 室内和鞘内注射；通过例如与池(reservoir)例如Ommaya池相连的 室内导管可能有助于室内注射。例如通过使用吸入器或雾化器以及 具有喷雾剂的制剂也可以采用肺部施用。也可以往患者的肺内施用 干粉末组合物形式的抗体(见例如美国专利No. 6,514,496)。
在一个特别的实施方案中，往需要治疗的部位局部地施用本发 明所用的治疗性抗体或组合物可能是所需的。例如但不限定于通过 局部输注、局部应用、通过注射、通过导管方式、通过栓剂方式、 或通过植入物方式都可以实现这一点，所述植入物是多孔的、非多 孔的、或胶状物质，包括膜，例如sialastic membrane、或纤维类物 质(fibers)。优选地，当施用抗体时，必需谨慎地使用不会吸收抗 体的物质。
在另一个实施方案中，抗体可以在载体特别是脂质体内输送 (见Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al.， in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.)， Liss, New York， pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein,出 处同上，pp. 317-327;见上面的出处)。
在另一个实施方案中，可以通过控释系统(controlled release system)输送抗体。在一个实施方案中，可以使用泵(见Langer，如目U; Sefton， CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al. Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(见Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983);也见于Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al" Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al" J. Neurosurg. 71:105 (1989))。在另一个实施方案中，控释系统可以被置于治疗耙点的附 近。
例如在标准临床研究中，可以确定出能有效地治疗或预防接受 替代治疗分子的哺乳动物体内的IgE介导的应答的抗体的量。可以 在与疾病相符合的治疗方案中施用抗体，例如一天到数天内给予单 次或数次剂量以缓解疾病状态，或者在长时间内施用周期剂量以预 防超敏反应或过敏症的先兆。另外，可以任选地采用体外检测法， 这有助于鉴定出最佳剂量范围。制剂中所采用的精确剂量也依赖于 施用的途径、以及疾病或疾患的严重程度，根据临床医师的判断以 及每个患者的情况可以确定。从源自体外或动物模型测试系统的剂 量-应答曲线中可以外推出有效剂量。
对抗体而言，施用给患者的剂量典型是患者体重的O.lmg/kg到 100mg/kg。优选地，施用给患者的剂量是患者体重的O.lmg/kg到 20mg/kg之间，更优选地是患者体重的lmg/kg妾lj 10mg/kg。由于对 外源多肽的免疫应答，所以人抗体在人体内通常比来自其他物种的 抗体具有更长的半衰期。因此，更低剂量的人抗体和/或更小频率的 施用常常是可能的。此外，通过修饰例如脂质化增强抗体的摄入及组织穿透力(例如进入脑部)可以减少施用抗IgE抗体的剂量和频 率。
另外，本发明所用的抗体可以与多种效应物分子例如异源多 肽、药物、放射性核苷、或毒素缀合。见例如PCT申请WO
92/08495、 WO 91/14438、 WO 89/12624、美国专利No. 5,314,995、 和EP 396,387。抗体或其片段可以与治疗性部分例如细胞毒素例如 细胞生长抑制剂或细胞杀灭剂、治疗性物质或放射性金属离子例如a 粒子辐射物例如213Bi缀合。细胞毒素或细胞毒性物质包括任何对细 胞有害的物质。例子包括紫杉醇(paclitaxol)、细胞松弛素B、短 杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖 苷、tenoposide、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺红 菌素、dihydroxy anthracin dione、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素 D、 l-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘 洛尔和嘌呤霉素和其类似物或同源物。治疗性物质包括但不限于抗 代谢物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、烷化剂(例如氮 芥、thioepa chlorambucil、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和氮乙 环己亚硝脲(CCNU) 、 cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、 链脲菌素、丝裂霉素C、和顺二氯二氨铂(II) (DDP)顺铂)、蒽 环类(例如道诺红菌素(以前叫做道诺霉素)和阿霉素)、抗生素 (例如更生霉素(以前叫做放线菌素)、博来霉素、光祌霉素和氨 茴霉素(AMC))、以及抗有丝分裂物质(例如长春新碱和长春花 碱)。
因为缀合物可以用于修饰给定的生物学应答，治疗剂或药物部 分并非解释为限定于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具 有所需生物学活性的蛋白或多肽。这些蛋白可以包括例如毒素，例
如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子、a-干扰素、|3-白介素、神经生长因 子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂例如TNF-a、 TNF-(3、 AIMI (见国际公开No. WO 97/33899) 、 AIM II (见国 际公开No. WO 97/34911) 、 Fas配体(Takahashi et al., Int. Immunol. 6:1567-1574 (1994)) 、 VEGI (见国际公开No. WO 99/23105)、血 栓形成剂或抗血管生成剂例如制管张素(angiostatin)或血管内皮抑 素(endostatin);或生物应答修饰剂，例如淋巴因子、白介素-l ("IL-l")、白介素-2 ( "IL-2")、白介素-6 ( "IL-6")、粒 细胞巨噬细胞集落剌激因子("GM-CSF")、粒细胞集落剌激因 子("G-CSF")、或其他生长因子。
实施例
以下实施例是举例说明而不是任何形式的限制。
实施例1: TES-C21和TESC-2的生成和筛选
用从血清中纯化的多克隆人IgE (Ventrex提供)免疫雄性 Balb/c小鼠数次。IgE与合适的佐剂相结合。在末次注射免疫原后处 死小鼠，取出脾制备用于与骨髓瘤细胞融合的单细胞悬液。用聚乙 二醇1450 (Kodak) 、 CMF-PBS和DMSO的融合混合物融合脾细胞 和Sp2/0细胞。在组合了细胞悬浮液之后，加入DMEM。
然后用针对结合于Immulon 2平板上的人IgE的酶联免疫吸附 检测法(ELISA)筛选出融合形成的杂交瘤。其中一种杂交瘤生成 了鼠抗IgE抗体TES-C21。
用编码TES-C21 H和L链可变区、和人yl和K恒定区的核酸序 列共转染Sp2/0细胞，等分铺板到96孔板内进行选择。筛选上清中 与人IgE结合的人IgG分泌物。转染瘤细胞适合于生长在无血清培养基内。然后用固定的蛋白
A柱从铺满培养物的培养基中纯化出所形成的嵌合克隆TESC-2。
用ELISA进一步筛选TES-C21，并确认其特异于人IgE，且与 IgG、 IgM、 IgA、 IgD、人血清白蛋白、运铁蛋白或胰岛素没有交叉 反应。TES-C21均等地与不同的人IgE分子结合。TES-C21以剂量 依赖性方式与分泌IgE的细胞系SKO-007、 U266和SE44结合，说 明其与人膜IgE结合。但是TES-C21不与具有表面IgM、 IgD、 IgG、或IgA的人B细胞系、或者不与T细胞系、或者不与SE44的 亲代鼠细胞系、或者不与分泌嵌合人IgG的鼠细胞系结合。TES-C21也不与多种细胞类型上的低亲和力FcsRII受体上的IgE结合。 这也不会诱导新鲜制备的人血嗜碱性粒细胞释放组胺，其中FcsRI 装配有IgE。 10吗/ml的TES-C21能完全抑制l[ig IgE与FcsRII的结
实施例2:结合选择性的确定
TESC-2禾卩TES-C21与结合于微滴定平板上的IgE均等地结合。 如下证实这一点。用HIV-1 gpl20衍生的R15K肽-卵白蛋白缀合物 包被Immulon 2板，SE44 (具有与HIV-1 gpl20衍生的肽R15K结合 的抗体的可变区的嵌合人IgE)与固定抗原结合。加入不同浓度的 TES-C21或TESC-2。利用辣根过氧化物酶("HRP")缀合的山羊 抗小鼠IgG (对于TES-C21)或HRP-山羊抗人IgG， Fc (对于 TESC-2)检测结合。发现TESC-2和TES-C21对于结合于微滴定平 板上的IgE具有相同的相对亲和力。
TESC-2和TES-C21也显示出能与产IgE细胞(SKO-007)同等 地结合。通过在0°C、不同抗体浓度下，温育2xl(^这些细胞/100)11 PBS-l。/。山羊血清30分钟可以证实这一点。用FITC-山羊(Fab)2抗小 鼠IgG检测TES-C21的结合；用FITC-山羊(Fab)2抗人IgG检测TESC-2的结合。通过用Coulter Epics V的荧光流式细胞计量术定量 结合。FITC强度门设定为在没有初级免疫球蛋白(primary immunoglobulins)时生成10%±0.5%阳性细胞。
发现TES-C21和TESC-2都不与结合于低亲和力IgE受体的IgE 结合。利用分泌IgG的人类淋巴母细胞系IM-9细胞研究了 TESC-2 识别复合有CD23的IgE的可能性。用抗Leu20 (特异于CD23的 MAb)的强染色验证了 IM-9细胞上CD23的存在。将IM-9细胞与 5到10(ig/ml的人IgE—起温育，洗涤，然后与生物素标记的TESC-2或阳性对照抗IgE MAb TES-19 —起温育，之后与FITC-链霉抗生 物素蛋白一起温育，并用流式细胞计量术进行分析。
嵌合TESC-2和鼠TES-C21都显示出能抑制IgE与FcsRII的结 合。在加入具有Fc汰II的IM-9细胞之前，用20昭IgE-SE44在37。C 下预温育不同浓度的抗体1小时。利用生物素化的TES-19和FITC-链霉抗生物素蛋白检测与IgE的结合，并用荧光流式细胞计量术进 行定量。
为了排除在这些试验的预温育期间形成TESC-2和IgE的免疫复 合物、从而产生假阳性的可能性，利用生物素标记的TESC-2或 FITC山羊抗人IgE (对于TES-C21)确认了这些免疫复合物也不与 FcsRII结合。
实施例III:组胺释放检测
如下面的表1所示，TESC-2和TES-C21都不会诱导新鲜制备的 人血嗜碱性粒细胞释放组胺，其中FcsRI装配有IgE。因为不同供体 的嗜碱性粒细胞释放介质的可变性，针对多个供体的嗜碱性粒细胞 制品，在多个浓度检测了抗体。观察到TESC-2或TES-C21都不会 诱导组胺释放。但是，表面IgE与多克隆山羊抗IgE抗体的交联诱 导了组胺释放。表1_
净组胺释放
抗体浓度(ng/ml)供体l供体2供体3供体4
多克隆山羊抗人IgE0.170645581
TESC-20.40
203
1002
5002
TES-C210.410
210
1000
5010
为了揭示在引入交联抗原或其他试剂之后，TES-C21可以与嗜 碱性粒细胞结合并诱导受体交联以诱导组胺释放的可能性，用二级 抗体进行交联。因为抗人IgG能单独诱导组胺释放(因为人IgG已 经与分离的嗜碱性粒细胞上的FcyR结合的事实)，因此在这些实验 中只使用鼠抗体TES-C21。交联山羊抗小鼠IgG增强了次最佳浓度 的阳性对照小鼠抗人IgE诱导的组胺释放，所述阳性对照小鼠抗人 IgE不抑制人IgE与FcsRI的结合。但是，在这些非常许可的条件 下，TES-C21不诱导组胺。
制备鼠抗体TES-C21的人源化版本，如在1997年5月25日授 权的澳大利亚专利No. 675449中所详述。可以遵循相似的方法制备 其他人源化的抗IgE抗体。适合用于本发明的一些产人源化抗IgE 抗体的转染瘤可以来自ATCC，编号如下11130、 11131、 11132、 11133。与以编号11131保藏的转染瘤生成的抗IgE抗体相似的抗 IgE抗体是具有用于治疗遗传过敏性皮炎的充分临床开发潜能的那些抗体。其他适合于治疗遗传过敏性皮炎的人源化抗体是Genentech, Inc生成的E25 (rhuMAb-E25)。在Presta et al.， J. Immunol. 151-:2623-2632 (1993)中描述了这个抗体。
上述的说明、术语、表达式和实施例仅仅是举例说明的，并不 作为限制。本发明包括上述实施方案的所有已知的和未知的等价形 式。下面的权利要求书限定了本发明，其不受本文的任何其他部分 或任何其他来源中的任何陈述的限制。
权利要求
1. 一种用于治疗或预防被施用引发IgE介导的应答的一种或多种替代治疗分子的哺乳动物体内的超敏反应和/或过敏症的方法，包括给哺乳动物施用足以治疗或预防超敏反应和/或过敏症的量的抗IgE抗体或其结合片段。
2. —种用于减轻或阻止被施用替代治疗分子的哺乳动物体内的 IgE介导的应答的方法，包括给哺乳动物施用足以减轻或预防IgE介 导的应答的量的抗IgE抗体或其结合片段。
3. —种用于降低被施用引发IgE介导的应答的替代治疗分子的 哺乳动物体内的过敏症危险的方法，包括给哺乳动物施用足以降低 过敏症危险的量的抗IgE抗体或其结合片段。
4. 一种用于诱导被施用引发IgE介导的应答的替代治疗分子的 哺乳动物体内的免疫耐受性的方法，包括给哺乳动物联合施用足以 诱导对所述替代分子的耐受性的有效脱敏量的替代治疗抗原和抗IgE抗体或其结合片段。
5. —种用于抑制被施用替代治疗分子的哺乳动物体内的IgE抗 体生成的方法，其包括给哺乳动物施用足以抑制IgE抗体生成的量 的抗IgE抗体或其结合片段。
6. —种减少有效治疗疾病所需的替代治疗分子的量的方法，包 括给哺乳动物施用足以减少中和性IgE并因此减少所需替代分子的 量的抗IgE抗体或其结合片段。
7. —种给哺乳动物施用替代治疗的方法，包括给哺乳动物施用 替代治疗分子以及给哺乳动物施用抗IgE抗体或其结合片段。
8. 权利要求1到7中任一项的方法，其中所述抗IgE抗体是单 克隆抗体。
9. 权利要求8的方法，其中所述单克隆抗体是人抗体、人源化 抗体、嵌合抗体或单链抗体。
10. 权利要求8的方法，其中所述单克隆抗体作为组合物施 用，所述组合物还包括生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、或 稳定剂。
11. 权利要求1到7中任一项的方法，其中所述结合片段是 ScFv、 Fv、 Fab、 F(ab')或F(ab')2。
12. 权利要求1到7中任一项的方法，其中静脉内、腹膜内、 经吸入、肌内、皮下或口服施用所述抗体。
13. 权利要求1到4中任一项的方法，其中所述IgE介导的应 答是过敏反应。
14. 权利要求1到13中任一项的方法，其中所述替代治疗分子 是因子VIII、因子IX、人a-L-艾度糖苷酸酶、人(3-葡糖脑苷脂酶或 人(3-半乳糖苷酶A。
15. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于治疗或预防被施用引 发IgE介导的应答的一种或多种替代治疗分子的哺乳动物体内的超 敏反应和/或过敏症的药物中的用途。
16. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于减轻或阻止被施用替 代治疗分子的哺乳动物体内的IgE介导的应答的药物中的用途。
17. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于降低被施用引发IgE 介导的应答的替代治疗分子的哺乳动物体内的过敏症危险的药物中 的用途。
18. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于诱导被施用引发IgE 介导的应答的替代治疗分子的哺乳动物体内的免疫耐受性的药物中 的用途。
19. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于抑制被施用替代治疗 分子的哺乳动物体内的IgE抗体生成的药物中的用途。
20. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于减少有效治疗疾病所需的替代治疗分子的量的药物中的用途。
21. 权利要求13到18中任一项的用途，其中所述抗IgE抗体 是单克隆抗体。
22. 权利要求19的用途，其中所述单克隆抗体是人抗体、人源 化抗体、嵌合抗体或单链抗体。
23. 权利要求19的用途，其中所述单克隆抗体作为组合物施 用，所述组合物还包括生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、或 稳定剂。
24. 权利要求13到18中任一项的用途，其中所述结合片段是 ScFv、 Fv、 Fab、 F(ab')或F(ab')2。
25. 含有替代治疗分子和抗IgE抗体或其结合片段、类似物或 衍生物的药物组合物。
全文摘要
本发明通常涉及一种通过施用抗IgE抗体或其结合片段治疗和/或预防接受引发IgE介导的应答的替代治疗分子的患者体内的超敏反应的方法，所述超敏反应包括过敏症。抗IgE抗体抑制哺乳动物体内的IgE介导的过敏反应，也能降低发生针对替代治疗分子的过敏反应的危险。随着时间施用抗IgE抗体也下调了高亲和力的IgE受体，进一步降低了超敏反应和/或过敏症的危险。抗IgE抗体与循环的或血清的IgE和/或B细胞上膜形式的IgE结合，但是不与结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的IgE结合，因为这可能会引起交联。这个方法也通过减少或清除特异于替代治疗分子的中和IgE抗体降低了施用替代治疗分子的剂量和/或频率。
文档编号A61K39/395GK101432019SQ200580033869
公开日2009年5月13日 申请日期2005年10月4日 优先权日2004年10月5日
发明者冯赐忠, 斯坦利·T.·刘易斯 申请人:泰勒公司
用抗IgE抗体治疗和预防接受替代治疗的患者体内的 超敏反应和/或过敏症
背景技术：
随着药物的更广泛的使用，药物诱导的过敏症频繁增加。抗菌 药是最为常见的始作俑者，而青霉素是被最广为研究的药物。其他 常引起这些反应的化合物包括非甾体类抗炎药、麻醉剂、肌肉松驰 药、胶乳和放射造影剂。最近，己经在被施用替代治疗分子的患者
中观察到了这些反应，所述分子如凝血剂，包括在血友病A或B患 者中的因子VIII和因子IX (Shopnick, et al., Transfusion (1996) 36: 358-61; Dioun， et al. B. J. Allergy Clin Immunol (1998) 102: 113-7); 粘多糖增多症患者使用的人a-L-艾度糖苷酸酶(Wraith, et al.， J Pediatr (2004) 144: 581-588);高歇氏病患者中的人P-葡糖脑苷脂酶 (Aviner, et al.， Blood Cells Mol Dis (1999) 25: 92-94)和法布里病患 者使用的人J3-半乳糖苷酶(Wilcox, et al.， Am J Hum Genet (2004) 75: 65-74)。
过敏症是免疫球蛋白(Ig) E介导的从肥大细胞和嗜碱性粒细胞 中免疫释放介质所引起的全身性严重性速发反应。
这种速发的超敏应答基于B细胞生成的免疫球蛋白E型抗体 (IgE抗体)，所述B细胞在暴露于作为过敏原的物质(即本文中 替代治疗分子)之后分化成了分泌抗体的浆细胞。IgE首先致敏局部 的肥大细胞；IgE抗体通过其恒定区与肥大细胞表面上的Fcs受体结 合，然后浆B细胞生成的IgE进入循环并与循环的嗜碱性粒细胞以 及全身组织中的肥大细胞上的Fce受体结合。随后，所结合的IgE 与过敏原相接触，通过与过敏原的结合交联高亲和力的IgE受体(FcsRI)，造成细胞脱粒并释放出大量的过敏介质，如组胺、前列
腺素、白三烯、蛋白酶等。这些物质的释放造成了速发型超敏反应 的临床症状，即呼吸道平滑肌的收縮、小血管的扩张以及血管对水 和血浆蛋白的通透性的增加、粘液的分泌、以及对皮肤的神经末梢 的刺激所造成的皮肤瘙痒和疼痛。另外，强化了第二次接触过敏原
后的反应，因为一些B细胞在第一次与过敏原接触后通过在细胞表 面表达IgE形成了表面IgE阳性的B细胞(sIgE+ B细胞)的"记忆 池(memorypool)"。第二次暴露可以导致一些患者的过敏症。
用抗IgE抗体治疗哮喘已经显示出其通过去除循环IgE以及下 调IgE免疫应答抑制过敏反应是有益的，IgE免疫应答是诱导哮喘的 最早期事件。因为其他抗体类型的应答未受到影响，因此实现了对 过敏症状的速发和长效的作用。对人嗜碱性粒细胞密度的早期研究 显示出了患者血浆IgE水平和每个嗜碱性粒细胞的FcsRI受体数目 之间的相关性(Malveaux " a/,, / C7/"./廳"，1978， 62:176)。他们 发现过敏个体和非过敏个体中的FcsRI密度范围从每个嗜碱性粒细 胞104到106个受体。后来发现通过抗IgE治疗过敏性疾病将循环 IgE的量降低到了治疗前水平的1 % ( MacGlashan " ， J! /mm朋o/., 1997， 158:1438-1445) 。 MacGlashan分析了从经完整抗IgE抗体治 疗过的患者中获得的血清，所述抗IgE抗体与循环于患者血清中的 游离IgE结合。他们报道降低患者体内的循环IgE水平造成了在嗜 碱性粒细胞表面上存在更低数目的受体。因此，他们假设嗜碱性粒 细胞和肥大细胞表面上的FcsRI密度是受循环IgE抗体水平直接或 间接调节的。
利用人源化的抗IgE抗体XOLAIR ，这种治疗方法已经被用于 治疗过敏性疾病，如过敏性鼻炎和哮喘(Corne， J. W C/k /匿仏1997, 99:879-887; Racine-Poon, A. " a/., C//w.尸/za環co/. T7zer. 1997， 62:675-6卯；Fahy， J.V. ef 爿m. J! C〃Y. O^e Met/. 1997,155: 1824-1834; Boulet, L. P. " a/" j附. / 7 esp. CWf. Oare Med., 1997, 155: 1835-1840; Milgrom， E. d a/" TV. J! Med， 1999， 341: 1966-1973)。这些临床数据证实抑制IgE与其受体的结合是治疗IgE介 导的疾病的有效方法。
接受替代治疗分子且表现出对所述分子的过敏性应答的患者必 须进行多次小剂量输注，以便诱导免疫耐受或使得患者脱敏。这对 于表现出严重过敏反应的患者是非常危险的，并且可以造成过敏性 休克。 一些患者不能进行这种类型的治疗，他们只能依赖于其他较 少有效的药物。具有完全基因缺失所造成的遗传缺陷的患者容易发 生这种类型过敏症的危险，因为他们对药物不具有耐受性。如果药 物不能被施用，这些常常都是致命的疾病，然而治疗同样也可能是 致命的。因此，非常需要容许施用替代治疗分子且没有超敏反应或 过敏症危险的治疗方法。
发明简述
本发明一般涉及通过施用抗IgE抗体或其结合片段治疗和/或预 防被施用一或多种引起IgE介导性应答的替代治疗分子的哺乳动物 体内的超敏反应和/或过敏症的方法。抗IgE抗体抑制哺乳动物体内 的IgE介导的过敏反应，因此降低了对替代治疗分子的过敏反应的 危险。随着时间施用抗IgE抗体下调了高亲和力的IgE受体
(FcsRI)，还降低了过敏应答的危险。
在本方法中，抗IgE抗体与循环或血清IgE和/或结合于B细胞 的IgE结合，但是优选地不与结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE 结合，因为这可能会造成交联。另外，抗IgE抗体也阻止了 IgE与 B细胞和抗原呈递细胞例如树突状细胞上的低亲和力的IgE受体
(FcsRII)的结合，因此进一步减少了 B细胞生成的过敏原特异性 IgE。本发明也涉及一种用于减轻或消除被施用一或多种替代治疗分 子的哺乳动物体内的IgE介导的应答的方法，包括给哺乳动物施用
抗IgE抗体。
本发明也涉及包括替代治疗分子和抗IgE抗体或其结合片段、 类似物或衍生物的药物组合物。
另外，哺乳动物应答于治疗所生成的一些IgE抗体是中和性 的，因此替代治疗(RT)的疗效随着时间而降低。因此，为了获得 最佳的临床受益，需要更高剂量的RT分子。通过施用与RT分子特 异性IgE结合的抗IgE抗体，减少了治疗患者所需的RT分子的量， 因此减少了药物施用的频率并潜在减少了患者的治疗费用。
所治疗的表现出IgE介导性应答的疾病包括但不限于遗传缺陷 病，例如血友病A和B、高歇氏病、法布里病、粘多糖增多症、涉 及先天性代谢错误的疾病、和肝酶疾病，例如酸性-a-糖苷酶。
抗IgE抗体包括但不限于天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗 体、单价抗体、双特异抗体、异缀合(heteroconjugate)抗体、多特 异抗体、人抗体、人源化抗体、去免疫抗体、或嵌合抗体、单链抗 体、Fv片段、Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库生成的片段、抗 独特型(抗Id)抗体(包括抗本发明的抗体的抗Id抗体)、以及上 面任何一种的表位结合片段。抗体可以是片段，例如Fab、 Fab'、 F(ab'》、Fv、和单个结合结构域片段。抗体也可以是单链抗体，例 如scFv。
本发明也涉及包括上述抗IgE抗体以及与一或多种药学可接受 的载体、稀释剂、赋形剂、或稳定剂组合的组合物的用途。可以通 过一或多种途径，包括静脉内、腹膜内、吸入、肌内、皮下和口服 途径施用本发明所用的抗体或组合物。利用给患者输送治疗有效量 的本发明请求保护的抗体的吸入设备可以施用本发明所用的抗体或 组合物。通过详细描述的说明书和权利要求书，本发明的其他部分将是 显而易见的。
发明详述
本申请中所用的术语被解释为本领域普通技术人员所知的一般 和典型含义。但是，如下面的说明书所说明的那样，对下面的术语 给出了最广义的合理解释。
本文所用术语"抗体"在此以其最广泛的含义使用，其包括免 疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有免疫特 异性结合抗原的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任一
类型的(例如，IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA或IgY)、任一类别的 (例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl或IgA2)或亚类的免疫球 蛋白分子。抗体包括但不限于天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗 体、单价抗体、双特异抗体、异缀合抗体、多特异抗体、人抗体、 人源化抗体、去免疫抗体、或嵌合抗体。天然抗体和免疫球蛋白通 常是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，它由两条相同的轻链 (L)和两条相同的重链(H)组成。每条重链在其一个末端都有一 个可变结构域(Vh)，紧接着的是多个恒定结构域。每条轻链在其 一个末端都有一个可变结构域(Vl)，以及在另一个末端具有一个 恒定结构域。但是，本文所用"抗体"包括仅具有一条链(对靶具 有特异性的重链或轻链)的单结构域抗体以及单链抗体、Fv片段、 Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库生成的片段、抗独特型(抗 Id)抗体(包括本发明抗体的抗Id抗体)、以及上面任何一种的表 位结合片段。
如本文所用，"人"抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列 的抗体，以及包括从人免疫球蛋白文库或从不表达内源性免疫球蛋白的、 一或多种人免疫球蛋白的转基因动物中分离的抗体，如下文
以及例如在Kucherlapati等的美国专利No. 5,939，598中所述。
本文所用术语"抗体片段"包括全长抗体的一部分，通常是靶 结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片 段。术语抗体的"结合片段"表示具有与全长抗体相同的定量的生 物活性或可检测到的免疫学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的结 合片段是与IgE免疫球蛋白结合和/或防止或显著地降低这个分子与 高亲和力受体FcsRI和/或低亲和力IgE受体FcsRII结合的能力的片 段。
本文所用术语"单克隆抗体"包括从基本上同质的抗体群中获 得的抗体。构成该群的单个抗体都是相同的，除了可能存在少量的 天然发生的突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对于单个靶位 点。此外，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传 统(多克隆)抗体制备不同的是，每个单克隆都针对于靶上的单个 决定簇。除它们的特异性以外，单克隆抗体的优点是可以通过杂交 瘤培养物合成，并且没有其他免疫球蛋白的污染。修饰词"单克 隆"表示从基本上同质的抗体群中获得的抗体的特征，并不能被解 释为需要用任何特殊的方法生成抗体。例如，本发明所用的单克隆 抗体可以通过熟知方法从噬菌体抗体文库中分离得到。可以用 Kohler and Milstein, Nature 256， 495 (1975)首先描述的杂交瘤方法制 备或者可以用重组方法制备本发明所用的亲代单克隆抗体。
"人源化"形式的非人(例如鼠)抗体包括嵌合的免疫球蛋 白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab')2或抗体的 其它耙结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。一 般而言，人源化抗体包括基本上所有的至少一个、典型地两个可变 结构域，其中所有或基本上所有的CDR区都对应于非人免疫球蛋白 的CDR区，以及所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体也可以包括至少一部分免疫球蛋白恒定区 (Fc)，典型地是所选的人免疫球蛋白模板的恒定区。
本文所用术语"抗IgE抗体"包括与一种或多种IgE分子结合 并抑制或显著降低IgE分子与高亲和力受体FcsRI和/或低亲和力受 体FcsRII的结合的抗体。抗IgE抗体可以与IgE分子的任何部分结 合，例如IgE分子的恒定区或可变区。抗IgE抗体可以与多种种类 的IgE分子结合或者可以与特殊的IgE种类结合，例如与IgE抗体的 结合位点结合。
本文所用术语"IgE介导的"包括以过度生成免疫球蛋白IgE和 /或IgE依赖性免疫学反应和炎症反应为特征的病变或疾病。它包括 但不限于与过敏性超敏反应相关的病变。
可以用RAST试验确定哺乳动物是否需要这种治疗。RAST试 验(放射变应原吸附试验的縮写)是用于确定患者是否对给定化合 物过敏的血液试验。RAST试验检测患者血液中的与给定过敏原特 异性反应的IgE的量。本发明打算利用替代治疗分子作为过敏原进 行RAST试验。
耙制备
可溶性的耙或其片段可以被用作生成抗体的免疫原，例如IgE 或其片段。可以重组生成或者用合成方法制备靶。也可以从天然来 源中分离出靶。
抗IgE抗体的生成
用本领域已知的任何合适的方法都可以生成本发明所用的抗 体。本发明所用的抗体可以包括单克隆抗体。制备抗体的方法对于 本令页域技术人员是已知的(Harlow, et al.， Antibodies: a LaboratoryManual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988),)，在
此以其全文并入参考)。
例如，如上所述的免疫原可以被施用给多种宿主动物，包括但 不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导生成含有特异于所述抗原的多克 隆抗体的血清。免疫原的施用可以包括一次或多次注射免疫剂，如 果需要还可以包括佐剂。根据宿主种类，可以用多种佐剂增加免疫 学应答，佐剂包括但不定于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物质胶 例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、 和可能有用的人佐剂例如BCG (卡介苗)以及短小棒状杆菌
(Co^y e^cter/mw / wvmw )。其他可以采用的佐剂的例子包括 MPL-TDM佐齐U (单磷酰月旨质 A 、 合成的 trehalose dicorynomycolate)。本领域技术人员不需要过多的实验就可以选择 出免疫接种方案。这些佐剂在本领域也是公知的。
典型地，通过多次皮下或腹膜内注射可以给哺乳动物注射免疫 原和/或佐剂，尽管也可以通过肌肉内和/或静脉内给于。免疫原可以 包括人IgE多肽或其融合蛋白或变体。根据多肽的性质(即疏水性 百分比、亲水性百分比、稳定性、净电荷、等电点等)，将免疫原 缀合于已知在被免疫的哺乳动物中已知具有免疫原性的蛋白可能是 有用的。这种缀合包括通过给本发明所用的抗体和免疫原性蛋白衍 生出活性化学功能基团以便形成共价键的化学缀合、或通过基于融 合蛋白的方法、或本领域技术人员已知的其他方法。这种免疫原性 蛋白的例子包括但不限于匙孔血蓝蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、 牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、以及泛主T辅助肽
(promiscuous T helper peptide)。如上所述，可以用多禾中佐剂增加 免疫学应答。利用杂交瘤方法可以制备单克隆抗体，例如Kohler和 Milstein， Nature, 256:495 (1975)和美国专利No. 4,376,110、 Harlow 等，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2,sup.nd ed. (1988)、 Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-Cdl Hybridomas (Elsevier, N.Y., (1981))所述的那些方法，或 者本领域技术人员已知的其他方法。可以被用于生成单克隆抗体的 方法的其他例子包括但不限于人B细胞杂交瘤技术(Kosbor etal., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al,, 1983, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 )和EBV杂交瘤技术(Cole et al" 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss， Inc., pp, 77-96)。这些抗体可以是任一免疫球蛋白类别，包括IgG、 IgM、 IgE、 IgA、 IgD及其任一亚类。可以在体外或体内培育生产本发明 的mAb的杂交瘤。
在杂交瘤方法中，典型地用免疫原免疫接种小鼠、人源化小 鼠、具有人免疫系统的小鼠、仓鼠、或其他合适的宿主动物，以引 发生成或能够生成与IgE特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可 以用抗原体外免疫淋巴细胞。
通常，在制备产生抗体的杂交瘤中，如果需要人类来源的细 胞，可以使用外周血淋巴细胞("PBL")，如果需要非人哺乳动 物来源的细胞，可以使用脾细胞或淋巴结细胞。然后利用适当的融 合剂例如聚乙二醇融合淋巴细胞和永生化细胞系，以形成杂交瘤细 胞(Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), pp. 59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细 胞，特别是啮齿类动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。常常采用大鼠 或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以培养于合适的培养基中，所 述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或存 活的物质。例如，如果亲代细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地包括次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸苷("HAT培养基")，所述物质阻止了 HGPRT缺 陷细胞的生长。
优选的永生细胞系是那些能有效融合的、支持所选的产抗体细 胞稳定地高水平表达抗体的那些细胞系，并且是对培养基例如HAT 培养基是敏感的。例如，永生细胞系包括鼠骨髓瘤细胞系，例如可 以从Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.禾卩the American Type Culture Collection, Manassas, Va.获得。如在说明书中 所指出的那样，也描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨骨遣瘤细胞系(heteromyeloma cell lines ) ( Kozbor， J. Immunol" 133:3001 (1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker， Inc., New York, (1987) pp. 51-63)。
然后可以分析培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对IgE的 单克隆抗体。用免疫沉淀法或体外结合检测法例如放射免疫检测法 (RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)可以测定出杂交瘤所生成的单 克隆抗体的结合特异性。这些技术在本领域是已知的，并且是在本 领域技术人员的知识范围之内。例如，用Scatchard分析可以测定出 单克隆抗体与IgE的结合亲和力(Munson et al., Anal. Biochem, 107:220(1980))。
在鉴定出所需的杂交瘤细胞之后，通过限制稀释方法可以亚克 隆所述克隆，并用标准方法进行生长(Goding，如前)。用于此目 的的合适的培养基包括例如Dulbecco，s Modified Eagle's培养基和 RPMI-翻。
用传统的免疫球蛋白纯化方法例如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层 析、凝胶排阻层析、凝胶电泳法、透析或亲和层析都可以从培养基 中分离或纯化出亚克隆所分泌的单克隆抗体。本领域具有多种用于生产单克隆抗体的方法，因此本发明并没
有局限于仅在杂交瘤中生产。例如，用在美国专利No. 4,816,567中 所述的那些重组DNA方法可以制备单克隆抗体。在上下文中，术语
"单克隆抗体"指衍生自单个真核、噬菌体、或原核克隆的抗体。 利用传统方法可以容易地克隆并测序编码本发明的单克隆抗体的 DNA (例如，通过使用能与编码鼠抗体的重链和轻链、或来自人、 人源化的或其他来源的这些链的基因特异性结合的寡核苷酸探 针)。本发明的杂交瘤细胞作为这些DNA的优选来源。 一旦分离， DNA可以被置于表达载体内，然后将表达载体转化到不能生成免疫 球蛋白的宿主细胞例如NSO细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢
(CHO)细胞或骨髓瘤细胞内，以实现在重组宿主细胞内合成单克 隆抗体。例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同 源的鼠序列(美国专利No. 4,816,567; Morrison et al,如前)，或者 通过将免疫球蛋白的编码序列共价地连接于非免疫球蛋白多肽的编 码序列的全部或部分，也可以修饰DNA。这种非免疫球蛋白多肽可 以被取代为本发明抗体的恒定结构域，或者可以被取代为本发明抗 体的一个抗原组合位点(antigen-combining site)的可变结构域，生 成能够与超过一种类型的抗原结合的二价抗体。
抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法在本领域是熟 知的。例如， 一种方法包括重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重 链。通常在Fc区的任一位点截短重链，以阻止重链交联。或者，相 关的半胱氨酸残基可以用另一种氨基酸残基取代或者被缺失，以阻 止交联。
用已知的技术可以生成能识别特异表位的抗体片段。例如，通 过用酶例如木瓜蛋白酶(生成Fab片段)或胃蛋白酶(生成F(ab')2 片段)蛋白酶剪切免疫球蛋白分子可以生成本发明所用的Fab和F(ab')2片段。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结 构域。
对于一些用途，包括抗体在人体的体内用途以及体外检测法中 的用途，优选地使用嵌合的、人源化的、或人抗体。嵌合抗体是其 中抗体的不同部分衍生自不同的动物物种的分子，例如具有衍生自 鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生成嵌 合抗体的方法在本领域是己知的。见例如Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202;美国专利5，807，715、 4,816,567和 4,816397，在此以其全文并入参考。人源化抗体是来自非人物种抗 体的与所需抗原结合的抗体分子，所述分子具有一种或多种来自非 人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区 (FR)。用来自CDR供体抗体的相应残基取代人构架区中的构架 残基，以变更、优选提高抗原结合。用本领域公知的方法鉴定出这 些构架取代，例如通过CDR和构架残基的相互作用的建模来鉴定对 抗原结合重要的构架残基，以及通过序列比较鉴定特殊位点上的独 特构架残基(见例如Queen et al.,美国专利5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)，在此以其全文并入参考)。
用本领域已知的多种技术可以将抗体人源化，所述技术包括例 如CDR移植(EP 239,400、 PCT申请WO 91/09967、美国专利 5,225,539、 5,530,101禾n 5,585,089 )、镶饰(veneering)或重塑 (resurfacing) ( EP 592,106 、 EP 519,596 、 Padlan， Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991) ; Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994))和链改组(chain shuffling)(美国专利5,565,332)。人源 化抗体通常具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这 些非人氨基酸残基常常被称作"输入(import)"残基，其典型地来自于"输入"可变结构域。遵照Winter及其同事(Jones etal., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)的方法，人源化可以 基本上通过用啮齿类动物的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序 列来进行。因此，这些"人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利No. 4,816,567)，其中非常少的完整的人可变结构域被来自非人物种的 相应序列所取代。实践中，人源化抗体典型地是人抗体，其中一些 CDR残基以及可能的一些FR残基被啮齿类动物抗体的类似位点所 取代。
人源化抗体通常包括基本上所有的至少一个、典型2个可变结 构域，其中所有或基本上所有的CDR区都对应于非人免疫球蛋白的 CDR区，以及所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白共有序 列的FR区。人源化抗体最佳地也包括至少一部分免疫球蛋白恒定区 (Fc)，典型地是人免疫球蛋白的Fc (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)1和Presta， Curr. Op. Struct. Biol" 2:593-596 (1992))。
完全的人抗体特别适合于人类患者的治疗性治疗。用本领域已 知的多种方法可以制备人抗体，所述方法包括上述利用衍生自人免 疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示法。也见于美国专利No. 4,444,887和4,716,111;和PCT公开WO 98/46645、 WO 98/50433、 WO 98/24893、 WO 98/16654、 WO 96/34096、 WO 96/33735和WO 91/10741，在此以其全文并入参考。Coleetal.,和Boerder et al.的技 术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss， (1985);禾卩 Boerner et al.， J. Immunol" 147(l):86-95, (1991))。
利用不能表达功能性内源免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基 因的转基因小鼠也可以生成人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机地或经同源重组导入小鼠胚胎干细胞内。 或者，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人可变区、恒定区和 多变区导入小鼠胚胎干细胞内。通过经同源重组导入人免疫球蛋白 基因座可以分别或同时使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因成为无 功能的。具体地，JH区的纯合缺失阻止了内源抗体的生成。扩增修 饰的胚胎干细胞，并将其微注射到胚泡内生成嵌合小鼠。然后喂养 嵌合小鼠以生成表达人抗体的纯合后代。
用所选的抗原按正常的方式免疫接种转基因小鼠。利用传统的 杂交瘤技术可以从免疫接种的转基因小鼠中获得针对所述抗原的单 克隆抗体。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化 期间进行重排，并随后进行类别转换和体细胞突变。因此，利用这
种技术，可以生产治疗用的IgG、 IgA、 IgM和IgE抗体。关于生产 人抗体的技术的综述，见Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)。关于对用于生产人抗体和人单克隆抗体的技术以及生 产这些抗体的方案的详细讨论，见例如PCT公开WO 98/24893、 WO 92/01047、 WO 96/34096、 WO 96/33735、欧洲专利No. 0598 877、美国专利No. 5,413,923、 5,625,126、 5,633,425、 5,569,825、 5，661，016 、 5,545,806 、 5,814,318 、 5，885，793 、 5,916,771和 5,939,598，在此以其文并入参考。另外，公司如Abgenix, Inc. (Freemont, CA)、 Genpharm (San Jose, CA.)禾口 Medarex， Inc. (Princeton, NJ)都能利用与上述相似的技术提供针对所选抗原的人抗体。
相似地，通过往转基因动物例如其中内源免疫球蛋白基因已经 被部分或完全失活的小鼠中导入人免疫球蛋白基因座可以制备人抗 体。攻击后，观察到人抗体生成，其在所有方面都与在人中所看到 的极为相似，包括基因重排、装配以及抗体池(antibody repertoire) 的形成。例如，在美国专利No. 5,545,807、 5,545,806、 5,569,825、 5,625,126、 5，633，425、 5,661,106以及下面的科学文献Marks et al.，Biotechnol., 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994) ; Fishwild et al., Nature Biotechnol., 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.， 14:826 (1996); Lonberg and Huszer, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)中都描述了这种方法。
通过免疫移植了人外周血白细胞、脾细胞或骨髓(例如XTL的 Trioma技术)的小鼠也能制备人单克隆抗体。利用称作"导向选择 (guided selection)"的技术可以生成识别所选表位的完全的人抗 体。在这个方法中，用所选的非人单克隆抗体例如小鼠抗体指导选 择识别相同表位的完全的人抗体(Jespers et al., Bio/technology 12: 899-卯3 (1988))。
异缀合抗体也可以用于本发明。异缀合抗体是由两种共价连接 的抗体组成。这些抗体例如已经被提议用于将免疫系统细胞耙向于 非所需细胞(美国专利No. 4,676,980)。打算利用合成蛋白质化学 中已知方法在体外制备抗体，所述方法包括涉及交联剂的那些方 法。例如，利用二硫化物交换反应或者通过形成硫酯键可以构建免 疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括iminothiolate和methyl-4-mercaptobutyrimidate以及那些例如在美国专利No. 4,676,980中所 述的试剂。
抗IgE抗体的鉴定
测试候选的抗IgE抗体，用酶联免疫吸附检测法(ELISA)、 Western免疫印迹法或其他免疫化学技术可以进行鉴定。进行检测以 表征单个抗体，包括(1)抑制IgE与带FcsRI的肥大细胞和嗜碱 性粒细胞的结合；(2)抑制IgE与带FcsRII的树突状细胞和B细 胞的结合；(3)与带膜IgE的B细胞结合；及(4)抑制IgE与固 相上的重组可溶性FcsRI蛋白的结合。用一种或多种检测法选择出 作为抗IgE抗体的单个抗体。本发明所用的抗体包括但不限于天然抗体、多克隆抗体、单克 隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异缀合抗体、多特异性抗体、 人抗体、人源化抗体、去免疫抗体、或嵌合抗体、单链抗体、Fv片
段、Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库生成的片段、抗独特型 (抗Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗独特型抗体)、以及上面 任一的表位结合片段。
抗体可以是人抗原结合抗体片段，并包括但不限于Fab、 Fab'和 F(ab')2、 Fd、单链Fvs (scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs
(sdFv)及包括VL或VH结构域的片段(其是结合片段的例子)。 包括单链抗体的结合抗原抗体片段可以单独包括可变区或者可变区 与下面的全部或部分组分的组合绞链区、CH1、 CH2、和CH3结 构域。本发明也包括抗原结合片段，其包括可变区与绞链区、 CH1、 CH2、禾Q CH3结构域的任一组合。本发明的抗体可以来自任 何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、非人灵长 类动物、啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、 豚鼠、骆驼、马或鸡。
根据抗体所识别的或特异结合的IgE的表位或部分可以描述或 说明本发明所用的抗体。所述表位或多肽部分可以如本文所述说 明，例如通过N末端和C末端的位置、通过连续氨基酸残基的大 小、或者WO05/075504所公开的那些内容，其在此并入参考。
抗体片段
已经开发出了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，这些片 段提供完整抗体的蛋白裂解消化而衍生(见，例如Mori脂toetal., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)和 Brennanetal.， Science 229: 81 (1985))。但是，现在可以用重组宿主 细胞直接生成这些片段。例如，可以从抗体噬菌体文库中分离出抗体片段。或者，可以从大肠杆菌(￡. co//)中直接回收到F(ab')2-SH 片段，并化学偶联形成F(ab')2片段(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中 直接地分离到F(ab')2片段。用于生成抗体片段的其他技术对于本领 域技术人员是显而易见的。在其他的实施方案中，所选的抗体是单 链Fv片段(scFv) (PCT专利申请WO 93/16185)。抗体的结合片 段包括Fv、 F(ab)、和F(ab')2片段。"Fv"片段含有完整的靶识别及 结合位点。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，确 定出VH-VL二聚体表面上的靶结合位点。总而言之，6个CDR赋予 了抗体靶结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或仅仅包括特 异于靶的三个CDR的半个Fv)也具有识别并结合靶的能力，尽管 亲和力比整个结合位点低。单链Fv (ScFv)抗体片段包括抗体的 Vh和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链上。Fv多肽通 常还包括Vh和VL结构域之间的多肽接头，其使得ScFv形成用于靶 结合的所需结构。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域 (CH1)。通过在重链CH1结构域的羧基末端添加一些残基，包括 抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸，Fab'片段与Fab片段有所不 同。通过裂解F(ab')2胃蛋白酶消化产物的绞链半胱氨酸之间的二硫 键生成了 F(ab')片段。抗体片段的其他化学偶联对于本领域技术人员 是已知的。
生成抗IgE抗体的方法
用合成抗体领域已知的任一方法都可以生成本发明所用的抗 体，特别地是通过化学合成，或优选地通过重组表达技术。
抗IgE抗体或其片段(例如抗体的重链或轻链或单链抗体)的 重组表达需要构建含有编码抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。 一旦已经获得编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其 部分的多核苷酸，利用本领域公知的技术通过重组DNA技术可以生 成用于生成抗体分子的载体。因此，在此描述了通过表达含有抗体 编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员 公知的方法可以用于构建含有抗体编码序列以及合适的转录及翻译
控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成 技术以及体内遗传重组。因此，可以用包含与启动子可操纵地连接 的核苷酸序列的可复制载体制备抗IgE抗体，所述核苷酸序列编码 本发明所用的抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变结构 域。这些载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(见例 如PCT公开WO 86/05807、 PCT公开WO 89/01036、和美国专利No. 5,122,464)并且抗体的可变结构域可以被克隆到这种载体内，以便 表达整个重链或轻链。
用传统技术将表达载体转移到宿主细胞内，然后用传统技术培 养转染细胞以生成本发明的抗体。在用于表达双链抗体的优选实施 方案中，可以在宿主细胞内共表达编码重链和轻链的载体以表达整 个免疫球蛋白分子。
可以用多种宿主表达载体系统表达本发明所用的抗体分子。这 些宿主表达载体代表可以通过其生成并随后纯化感兴趣编码序列的 载体，也可以表示当被合适核苷酸编码序列转化或转染时能原位表 达本发明的抗体分子的细胞。这些宿主表达载体包括但不限于微生 物，例如经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘 粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(S. ^Z)"fe));经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母 (例如酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia));经含 有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫 细胞系统；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)感染的或经含有抗体编码序列的重组质粒表 达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有衍生自哺乳动 物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动
物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子) 的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、 CHO、 BHK、 293、 3T3细胞)。优选地，用于表达重组抗体分子的是细菌细胞， 例如大肠杆菌，以及更优选地是真核细胞，特别是用于表达整个重 组抗体分子的真核细胞。例如，与载体例如来自人巨细胞病毒的主 要中间早期基因启动子元件相连接的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵 巢细胞(CHO)是抗体的有效表达载体(Foeckingetal.， Gene 45:101 (1986); Cockett et al.， Bio/Technology 8:2 (1990))。
在细菌系统中，根据所表达抗体分子的用途，可以有利地选择 多种表达载体。例如，对于生成抗体分子的药物组合物，当要生成 大量的这种蛋白时，指导高水平地表达能被容易纯化的融合蛋白产 物的载体是所需的。这些载体包括但不限于大肠杆菌表达载体 pUR278 (Rutheretal"EMBOJ. 2:1791 (1983))，其中抗体编码序列 可以被单个地框内连接于具有lac Z编码区的载体，以便生成融合蛋 白；pIN载体(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) 等。也可以用pGEX载体将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶 (GST)的融合蛋白。通常，这些融合蛋白是可溶的，并通过吸附 以及与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠结合以及随后在存在游离谷胱甘肽的 情况下洗脱可以容易地从裂解细胞中被纯化。pGEX载体被设计成 包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，使得可以从GST部分中释 放出克隆的耙基因产物。
在昆虫系统中，可以用苜蓿银纹夜蛾(J^3grap/2" cfl/z/or /co) 核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。病毒生长于草地夜蛾(&o^ptera/rwgi^eW")内。可以将抗体编码序列单独地 克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)内，并将其置于 AcNPV启动子(例如多晶体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用大量的基于病毒的表达系 统。在腺病毒被用作表达载体的情况中，感兴趣的抗体编码序列与 腺病毒转录/翻译控制复合物例如晚期启动子和三联前导序列相连 接。然后，通过体外或体内重组可以将该嵌合基因插入到腺病毒基 因组内。在病毒基因组的非必需区域(例如El或E3区)内的插入 生成了重组病毒，其是活病毒并且能在受感染的宿主内表达抗体分 子(例如见Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984))。对所插入的抗体编码序列的有效翻译可能也需要特异的起 始信号。这些信号包括ATG起始密码子和临近序列。此外，起始密 码子必须与所需编码序列的读框同相(in phase)以保证整个插入物 的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的， 包括天然和合成的。通过引入合适的转录增强子元件、转录终止子
等可以增强表达效率(见Bittner et al.， Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987))。
另外，可以选择出宿主细胞株，其以所需的特殊方式调节所插 入序列的表达，或者修饰并加工基因产物。对蛋白产物的这种修饰 (例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白的功能可能是重要 的。不同的宿主细胞具有用于蛋白和基因产物的翻译后加工及修饰 的特征性和特异的机制。可以选择出合适的细胞系或宿主系统以保 证正确的修饰并加工所表达的外源蛋白。至今为止，可以使用具有 用于合适加工原始转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的 真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、 COS、 293、 3T3、或骨髓瘤细胞。对于重组蛋白的长期高产率的生成，稳定的表达是优选的。例 如，可以工程化稳定表达抗体分子的细胞系。用受合适的表达控制 元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸位点
等)和选择标记物控制的DNA可以转化宿主细胞，而不是用含有病 毒复制起点的表达载体。在导入外源DNA之后，工程化的细胞可以 容许在富集培养基中生长1到2天，然后转移到选择培养基内。重 组质粒内的选择标记物赋予了对选择的抗性，并容许细胞稳定地将 质粒整合到其染色体内并生长形成转化灶(focus)，其依次可以被 克隆并扩增成细胞系。该方法可以被便利地用于工程化表达抗体分 子的细胞系。这些工程化的细胞系可以特别适用于筛选并评价与抗 体分子直接或间接地相互作用的化合物。
可以使用多种选择系统，包括但不限于分别在tk、 hgprt或aprt 细胞中可以使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler et al., Cell 11:223 (1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Szybalska & Szybalski， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992))和腺嘌呤磷酸 核糖转移酶基因(Lowyetal., Cell 22:817 (1980))。抗代谢物抗性也 可以被用作选择下面基因的基础dhfr，其赋予了对氨甲蝶呤的抗性
(Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 77:357 (1980); O'Hare et al.: Proc.Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)) ; gpt，其赋予了对霉酚酸 的抗性(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)) ; neo，其赋予了对氨基糖苷G-418的抗性(Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991));以及hygro，其赋予了对潮霉素的抗性
(Santerreetal.， Gene 30:147 (1984))。重组DNA技术领域普遍知道 的方法可以被常规地应用于选择所需的重组克隆，例如在Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (19卯)；以及在Chapters 12 and 13，Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)
中描述了这些方法，在此以其全文并入参考。
通过载体扩增可以增加抗体分子的表达水平(综述见 Bebbington and Hentschel， "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" (DNA Cloning, Vol.3. Academic Press, New York, 1987))。当表达抗 体的载体系统中的标记物是可扩增的时，增加宿主细胞培养物中的 抑制物的水平可以增加标记物基因的拷贝数。因为扩增区与抗体基 因相关，所以也会增加抗体的产量(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983))。
宿主细胞可以被两种表达载体所共转染，第一种载体编码重链 衍生多肽以及第二种载体编码轻链衍生多肽。两种载体都含有能够 等量表达重链多肽的相同的选择标记物。或者，可以使用编码并能 表达重链和轻链多肽的单个载体。在这种情况中，轻链应该置于重 链之前，以避免生成过量的有毒游离重链(Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler， Pro" Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980))。重链和 轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
一旦通过动物、化学合成或重组表达生成了抗IgE抗体，用本 领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任一方法都可以将其纯化， 例如通过层析法(例如离子交换层析、亲和层析、特别是通过蛋白 A后的特异抗体的亲和层析，以及大小排阻层析)、离心、差异溶 解度、或通过用于纯化蛋白的任何其他标准技术。另外，抗体或其 片段可以与在此所述的或本领域已知的异源多肽序列融合，以促进 纯化。
本发明涵盖抗IgE抗体或其与多肽重组融合的或化学缀合的 (包括共价或非共价缀合的)片段的用途。在使用本领域已知方法的体外免疫检测法和纯化方法中都可以使用本方法所用的融合的或
缀合的抗体。见例如Harbor et al.,如前；和PCT申请WO 93/21232、 EP 439,095 、 Naramura et al" Immunol, Lett. 39:91-99 (1994);美国专利No.5,474,981、 Gillies et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428-1432 (1992); Fell et al.， J. Immunol. 146:2446-2452(1991);在此
以其全文并入参考。
此外，抗体或其片段可以与标记物序列例如肽融合以便促进纯 化。在优选的实施方案中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如 pQE载体所提供的标记等(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif" 91311)，其中多种标记物是可商购获得的。如在 Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)中所述的那 样，例如，六组氨酸提供了对融合蛋白的便利纯化。其他用于纯化 的肽标记包括但不限于"HA"标记，其对应于衍生自流感血凝素蛋 白的表位(Wilson etal., Cell 37:767 (1984))禾Q "flag"标记。
药物制剂
通过混合具有所需纯度的抗体以及任选的本领域典型所用的 "药学可接受的"载体、赋形剂或稳定剂(所有都被称作"赋形 剂")可以将抗IgE抗体或其片段的治疗性制剂制备成冻干制剂或 水溶液的储存物。例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂 (isotonifier)、非离子型去污剂、抗氧化剂和其他各种添加剂(见 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed. (1980))。在所采用的剂量和浓度，这些添加剂对受体必须是无毒 的。治疗性制剂也可以包括抗IgE抗体或片段和替代分子的组合。
缓冲剂有助于将pH值维持于近似生理条件的范围内。它们的浓 度范围优选是从约2mM到约50mM。用于本发明所用的抗体的合适 的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸缓冲剂(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬 酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸一钠 混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、 酒石酸缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合 物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸一钠混合物等)、延胡索酸缓冲液(例如延胡索酸-延胡索
酸一钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸一钠-延胡 索酸二钠混合物等)、葡糖酸缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合 物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸缓 冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸 钾混合物等)、乳酸缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化 钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸缓冲液(例如乙酸-乙酸 钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，也提到了磷酸缓冲
液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐例如Tris。
可以加入防腐剂延缓微生物生长，加入量的范围为0.2%到1%
(w/v)。用于与本发明所用的抗体一起使用的合适的防腐剂包括苯
酚、苯甲醇、甲酚(metacresol)、羟苯甲酯、羟苯丙酯、氯化十八 烷基二甲基苄基铵、benzalconiumhalides (例如氯、溴、碘)、六甲 氯铵、对羟基苯甲酸垸酯例如羟苯甲酯或羟苯丙酯、儿茶酚、间苯 二酚、环己醇和3-戊醇。
可以加入有时被称作"稳定剂"的等渗剂以保证液体组合物的 等渗性，其包括多羟糖醇，优选三羟或更高的多羟糖醇，例如丙三 醇、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
稳定剂指一大范围的赋形剂，其功能范围可以从膨胀剂到溶解 治疗剂或有助于预防变性或粘附于容器壁的添加剂。典型的稳定剂 可以是多羟糖醇(如上列举的) ，氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，例如乳糖、 海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇
(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇，例如肌醇
(inositol);聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，例如尿
素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、oc-—硫代甘油和 硫代硫酸钠；低分子量多肽(即小于IO个残基)；蛋白质，例如人 血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物， 例如聚乙烯吡咯垸酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖； 二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖，例如棉子糖；多糖，例如 葡聚糖。稳定剂的范围可以从每活性蛋白部分重量的0.1到IO，OOO
倍重量。
可以加入无毒的表面活性剂或去污剂(也称作"增湿剂")以 有助于溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白避免发生搅拌诱导的聚集， 这也容许制剂暴露于有张力的剪切面，且不引起蛋白的变性。合适
的无毒的表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、 80等)、polyoxamer (184、 188等)、Pluronic⑧多元醇、聚氧乙烯失水山梨糖醇单酯 (TWEEN -20、 TWEEN -80等)。无毒的表面活性剂的范围可以
从约0.05mg/ml到约 1.0mg/ml ， 优选从约0.07mg/ml到约
0.2mg/ml。
附加的多种赋形剂包括膨胀剂(例如淀粉)、螯合剂(例如 EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和潜溶 剂。根据所治疗的特殊适应症所需，本文制剂也可以含有一种以上 的活性化合物，优选地是具有互补活性且不互相不利影响的那些化 合物。例如，进一步提供免疫抑制剂可能是所需的。在组合物中所 具有的这些分子的量对于目标目的是有效的。活性组分也可以包裹 于例如经coascervation技术或经界面聚合法所制备的微胶囊例如羟 甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(异丁燏酸甲酯)微胶囊中，于胶状药物输送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳
米胶囊)或大乳剂中。在Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)中阐述了这些技术。
用于体内使用的制剂是无菌的。例如通过经无菌滤膜的过滤可 以容易地完成这一点。可以制备出缓释制品。缓释制品的合适的例 子包括含有抗体变体的固体疏水性聚合物的半通透基质，所述基质 是成形的形式，例如膜片或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水 凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯
(美国专利No. 3,773,919) 、 L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、 不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物，例如 LUPRON DEPOTTM (由乳酸-羟基乙酸共聚物和乙酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)组成的可注射的微球)、以及聚-D-(-)-3-羟基丁 酸。虽然聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够释放分子 100多天，但是某些水凝胶只能释放蛋白更短的时间。当被包囊化 的抗体在体内停留长时间时，在37。C对湿度的暴露可以使得它们变 性或聚集，造成生物活性的对失以及免疫原性的可能变化。根据所 涉及的机理可以设计出用于稳定的合理的策略。例如，如果发现聚 集机制是因为经硫代二硫化物互换所形成的分子间S-S键，那么通 过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制水份含量、利用合适的添加 剂以及开发特异的聚合物基质组成都可以实现稳定作用。
能有效地治疗特殊疾患或病变的抗体或其片段的量依赖于疾患 或病变的性质，通过标准的临床技术可以确定出来。只要可能，需 要首先在体外确定出本发明的剂量-应答曲线和药物组合物，然后在 进行人体试验之前先在动物模型系统中进行测试。
在优选的实施方案中，通过皮下注射可以施用抗体或其片段的 水溶液。每个剂量范围可以从每kg体重约0.5mg到约50mg，或者 更优选地从每kg体重约3mg到约30mg。根据多种临床因素包括疾病类型、疾病严重度和对象对治疗剂 的敏感性，用于皮下施用的剂量方案可以从每月1次到每日1次不 等。
本发明的治疗性应用
单独施用或与细胞毒因子联合施用或与替代治疗分子联合施用
的、有或没有治疗部分与之缀合的抗IgE抗体被用作为治疗剂。为 了治疗或预防与替代治疗相关的IgE介导的疾病、疾患或病变，本 发明包括基于抗体的治疗，其包括给动物、优选哺乳动物、及最优 选人施用抗IgE抗体。
本发明所用的抗IgE抗体可以被治疗性地用于多种疾病。抗体 可以用于治疗其中给患者施用了替代治疗分子的任一疾病，所述替 代治疗分子引发IgE介导的应答，从而降低了过敏性休克的危险或 缓解了与过敏性介质的释放相关的超敏反应症状。这些抗体通过清 除特异于所施用分子的中和IgE分子也可以减少治疗的频率和/或替 代治疗分子的剂量。为了治疗疾患，优选地使用针对IgE的高亲和 力的和/或有效的体内抑制抗体或中和抗体、其片段或区域，并且适 用于本方法的治疗的抗体优选地不应当与结合于致敏的肥大细胞和 嗜碱性粒细胞上的IgE反应，但应当保持识别可溶性IgE和B细胞 上的膜IgE的能力。
本发明所用的治疗性化合物包括但不限于抗IgE抗体(包括在 此所述的其片段、类似物和衍生物)以及编码抗体的核酸。可以用 本领域己知的或本文所述的药学可接受的组合物提供本发明所用的 抗体。例如在Chang et al. (Biotechnology 8, 122-126 (1990));欧洲专 利No. EP0407392和一些美国专利，包括美国专利No. 5,449,760、 5,422,258和5,614,611中都已经描述了这种IgE同种型特异抗体。本 发明所用的其他抗体包括如在WO04070010和WO04070011中所述的高亲和力抗IgE抗体以及在美国专利5,965,709、 5,994,511、 6,172,213、 6329,509、 6，682，735禾卩6,761,889中所述的抗IgE抗体。 所有这些专利和申请均并入本文参考。
可以单独地或联合其他类型的治疗例如免疫治疗、支气管扩张 剂、抗组胺药或抗白三烯药物一起施用抗IgE抗体。
可以在替代治疗之前、期间或之后施用抗IgE抗体。如上所 述，替代治疗被用于治疗患有血友病A或B、粘多糖增多症、高歇 氏病和法布里病以及蓬佩病(Pompe disease)和其他遗传性或获得 性生物学蛋白缺陷症的患者。可以急性期或长期基础给予替代治 疗。替代治疗包括但不限于酶替代治疗、IgG替代治疗和激素替代 治疗。替代治疗的常见例子是直接往血液中注射低的或缺失的凝血 因子以治疗血友病。
可以在施用一种或多种替代治疗分子之前、期间或之后施用抗 IgE抗体。替代治疗分子包括但不限于凝血物质，包括因子VIII和 因子IX;人a-L-艾度糖苷酸酶；laronidase;人(3-葡糖脑苷脂酶；伊 米苷酶(imiglucerase);阿糖苷酶(alglucemse);人(3-半乳糖苷酶 A; agalsidase (3;人a-葡糖苷酶；alglucosidase a;或被施用替代哺 乳动物体内的缺陷蛋白并且能引起IgE介导的反应的任何蛋白。替 代治疗分子可以包括用于或通过基因治疗输送的分子。例如，通过 利用基因治疗可以输送作为替代治疗分子的人p-葡糖脑苷脂酶。
本发明提供了通过给哺乳动物施用有效量的抗IgE抗体或包括 抗IgE抗体的药物组合物治疗和预防超敏反应和/或过敏症的方法。 在一个优选方面，抗体是基本上纯化的(例如，基本上不含有限制 其作用或产生非所需副作用的物质)。
多种输送系统都是已知的，并且可以用于施用本发明所用的抗 体，包括例如注射液、脂质体包囊、微粒、微囊、能表达化合物的 重组细胞、受体介导的胞吞作用(见例如Wu et al., J. Biol. Chem.262:4429-4432 (1987))、作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核 酸的构建体等。
可以按任一可接受的方式给哺乳动物施用抗IgE抗体。导入方 法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜 外、吸入和口服途径。通过任一便利途径可以施用抗体或组合物， 例如通过输注或弹丸式注射、通过经表皮或粘膜层的吸收(例如口 腔粘膜、直肠和肠粘膜等)并且可以与其他生物活性物质一起施 用。施用可以是全身的或局部的。另外，希望可以通过任何合适的 途径将治疗性抗体或组合物导入到中枢神经系统内，所述途径包括 室内和鞘内注射；通过例如与池(reservoir)例如Ommaya池相连的 室内导管可能有助于室内注射。例如通过使用吸入器或雾化器以及 具有喷雾剂的制剂也可以采用肺部施用。也可以往患者的肺内施用 干粉末组合物形式的抗体(见例如美国专利No. 6,514,496)。
在一个特别的实施方案中，往需要治疗的部位局部地施用本发 明所用的治疗性抗体或组合物可能是所需的。例如但不限定于通过 局部输注、局部应用、通过注射、通过导管方式、通过栓剂方式、 或通过植入物方式都可以实现这一点，所述植入物是多孔的、非多 孔的、或胶状物质，包括膜，例如sialastic membrane、或纤维类物 质(fibers)。优选地，当施用抗体时，必需谨慎地使用不会吸收抗 体的物质。
在另一个实施方案中，抗体可以在载体特别是脂质体内输送 (见Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al.， in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.)， Liss, New York， pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein,出 处同上，pp. 317-327;见上面的出处)。
在另一个实施方案中，可以通过控释系统(controlled release system)输送抗体。在一个实施方案中，可以使用泵(见Langer，如目U; Sefton， CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al. Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(见Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983);也见于Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al" Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al" J. Neurosurg. 71:105 (1989))。在另一个实施方案中，控释系统可以被置于治疗耙点的附 近。
例如在标准临床研究中，可以确定出能有效地治疗或预防接受 替代治疗分子的哺乳动物体内的IgE介导的应答的抗体的量。可以 在与疾病相符合的治疗方案中施用抗体，例如一天到数天内给予单 次或数次剂量以缓解疾病状态，或者在长时间内施用周期剂量以预 防超敏反应或过敏症的先兆。另外，可以任选地采用体外检测法， 这有助于鉴定出最佳剂量范围。制剂中所采用的精确剂量也依赖于 施用的途径、以及疾病或疾患的严重程度，根据临床医师的判断以 及每个患者的情况可以确定。从源自体外或动物模型测试系统的剂 量-应答曲线中可以外推出有效剂量。
对抗体而言，施用给患者的剂量典型是患者体重的O.lmg/kg到 100mg/kg。优选地，施用给患者的剂量是患者体重的O.lmg/kg到 20mg/kg之间，更优选地是患者体重的lmg/kg妾lj 10mg/kg。由于对 外源多肽的免疫应答，所以人抗体在人体内通常比来自其他物种的 抗体具有更长的半衰期。因此，更低剂量的人抗体和/或更小频率的 施用常常是可能的。此外，通过修饰例如脂质化增强抗体的摄入及组织穿透力(例如进入脑部)可以减少施用抗IgE抗体的剂量和频 率。
另外，本发明所用的抗体可以与多种效应物分子例如异源多 肽、药物、放射性核苷、或毒素缀合。见例如PCT申请WO
92/08495、 WO 91/14438、 WO 89/12624、美国专利No. 5,314,995、 和EP 396,387。抗体或其片段可以与治疗性部分例如细胞毒素例如 细胞生长抑制剂或细胞杀灭剂、治疗性物质或放射性金属离子例如a 粒子辐射物例如213Bi缀合。细胞毒素或细胞毒性物质包括任何对细 胞有害的物质。例子包括紫杉醇(paclitaxol)、细胞松弛素B、短 杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖 苷、tenoposide、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺红 菌素、dihydroxy anthracin dione、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素 D、 l-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘 洛尔和嘌呤霉素和其类似物或同源物。治疗性物质包括但不限于抗 代谢物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、烷化剂(例如氮 芥、thioepa chlorambucil、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和氮乙 环己亚硝脲(CCNU) 、 cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、 链脲菌素、丝裂霉素C、和顺二氯二氨铂(II) (DDP)顺铂)、蒽 环类(例如道诺红菌素(以前叫做道诺霉素)和阿霉素)、抗生素 (例如更生霉素(以前叫做放线菌素)、博来霉素、光祌霉素和氨 茴霉素(AMC))、以及抗有丝分裂物质(例如长春新碱和长春花 碱)。
因为缀合物可以用于修饰给定的生物学应答，治疗剂或药物部 分并非解释为限定于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具 有所需生物学活性的蛋白或多肽。这些蛋白可以包括例如毒素，例
如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子、a-干扰素、|3-白介素、神经生长因 子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂例如TNF-a、 TNF-(3、 AIMI (见国际公开No. WO 97/33899) 、 AIM II (见国 际公开No. WO 97/34911) 、 Fas配体(Takahashi et al., Int. Immunol. 6:1567-1574 (1994)) 、 VEGI (见国际公开No. WO 99/23105)、血 栓形成剂或抗血管生成剂例如制管张素(angiostatin)或血管内皮抑 素(endostatin);或生物应答修饰剂，例如淋巴因子、白介素-l ("IL-l")、白介素-2 ( "IL-2")、白介素-6 ( "IL-6")、粒 细胞巨噬细胞集落剌激因子("GM-CSF")、粒细胞集落剌激因 子("G-CSF")、或其他生长因子。
实施例
以下实施例是举例说明而不是任何形式的限制。
实施例1: TES-C21和TESC-2的生成和筛选
用从血清中纯化的多克隆人IgE (Ventrex提供)免疫雄性 Balb/c小鼠数次。IgE与合适的佐剂相结合。在末次注射免疫原后处 死小鼠，取出脾制备用于与骨髓瘤细胞融合的单细胞悬液。用聚乙 二醇1450 (Kodak) 、 CMF-PBS和DMSO的融合混合物融合脾细胞 和Sp2/0细胞。在组合了细胞悬浮液之后，加入DMEM。
然后用针对结合于Immulon 2平板上的人IgE的酶联免疫吸附 检测法(ELISA)筛选出融合形成的杂交瘤。其中一种杂交瘤生成 了鼠抗IgE抗体TES-C21。
用编码TES-C21 H和L链可变区、和人yl和K恒定区的核酸序 列共转染Sp2/0细胞，等分铺板到96孔板内进行选择。筛选上清中 与人IgE结合的人IgG分泌物。转染瘤细胞适合于生长在无血清培养基内。然后用固定的蛋白
A柱从铺满培养物的培养基中纯化出所形成的嵌合克隆TESC-2。
用ELISA进一步筛选TES-C21，并确认其特异于人IgE，且与 IgG、 IgM、 IgA、 IgD、人血清白蛋白、运铁蛋白或胰岛素没有交叉 反应。TES-C21均等地与不同的人IgE分子结合。TES-C21以剂量 依赖性方式与分泌IgE的细胞系SKO-007、 U266和SE44结合，说 明其与人膜IgE结合。但是TES-C21不与具有表面IgM、 IgD、 IgG、或IgA的人B细胞系、或者不与T细胞系、或者不与SE44的 亲代鼠细胞系、或者不与分泌嵌合人IgG的鼠细胞系结合。TES-C21也不与多种细胞类型上的低亲和力FcsRII受体上的IgE结合。 这也不会诱导新鲜制备的人血嗜碱性粒细胞释放组胺，其中FcsRI 装配有IgE。 10吗/ml的TES-C21能完全抑制l[ig IgE与FcsRII的结
实施例2:结合选择性的确定
TESC-2禾卩TES-C21与结合于微滴定平板上的IgE均等地结合。 如下证实这一点。用HIV-1 gpl20衍生的R15K肽-卵白蛋白缀合物 包被Immulon 2板，SE44 (具有与HIV-1 gpl20衍生的肽R15K结合 的抗体的可变区的嵌合人IgE)与固定抗原结合。加入不同浓度的 TES-C21或TESC-2。利用辣根过氧化物酶("HRP")缀合的山羊 抗小鼠IgG (对于TES-C21)或HRP-山羊抗人IgG， Fc (对于 TESC-2)检测结合。发现TESC-2和TES-C21对于结合于微滴定平 板上的IgE具有相同的相对亲和力。
TESC-2和TES-C21也显示出能与产IgE细胞(SKO-007)同等 地结合。通过在0°C、不同抗体浓度下，温育2xl(^这些细胞/100)11 PBS-l。/。山羊血清30分钟可以证实这一点。用FITC-山羊(Fab)2抗小 鼠IgG检测TES-C21的结合；用FITC-山羊(Fab)2抗人IgG检测TESC-2的结合。通过用Coulter Epics V的荧光流式细胞计量术定量 结合。FITC强度门设定为在没有初级免疫球蛋白(primary immunoglobulins)时生成10%±0.5%阳性细胞。
发现TES-C21和TESC-2都不与结合于低亲和力IgE受体的IgE 结合。利用分泌IgG的人类淋巴母细胞系IM-9细胞研究了 TESC-2 识别复合有CD23的IgE的可能性。用抗Leu20 (特异于CD23的 MAb)的强染色验证了 IM-9细胞上CD23的存在。将IM-9细胞与 5到10(ig/ml的人IgE—起温育，洗涤，然后与生物素标记的TESC-2或阳性对照抗IgE MAb TES-19 —起温育，之后与FITC-链霉抗生 物素蛋白一起温育，并用流式细胞计量术进行分析。
嵌合TESC-2和鼠TES-C21都显示出能抑制IgE与FcsRII的结 合。在加入具有Fc汰II的IM-9细胞之前，用20昭IgE-SE44在37。C 下预温育不同浓度的抗体1小时。利用生物素化的TES-19和FITC-链霉抗生物素蛋白检测与IgE的结合，并用荧光流式细胞计量术进 行定量。
为了排除在这些试验的预温育期间形成TESC-2和IgE的免疫复 合物、从而产生假阳性的可能性，利用生物素标记的TESC-2或 FITC山羊抗人IgE (对于TES-C21)确认了这些免疫复合物也不与 FcsRII结合。
实施例III:组胺释放检测
如下面的表1所示，TESC-2和TES-C21都不会诱导新鲜制备的 人血嗜碱性粒细胞释放组胺，其中FcsRI装配有IgE。因为不同供体 的嗜碱性粒细胞释放介质的可变性，针对多个供体的嗜碱性粒细胞 制品，在多个浓度检测了抗体。观察到TESC-2或TES-C21都不会 诱导组胺释放。但是，表面IgE与多克隆山羊抗IgE抗体的交联诱 导了组胺释放。表1_
净组胺释放
抗体浓度(ng/ml)供体l供体2供体3供体4
多克隆山羊抗人IgE0.170645581
TESC-20.40
203
1002
5002
TES-C210.410
210
1000
5010
为了揭示在引入交联抗原或其他试剂之后，TES-C21可以与嗜 碱性粒细胞结合并诱导受体交联以诱导组胺释放的可能性，用二级 抗体进行交联。因为抗人IgG能单独诱导组胺释放(因为人IgG已 经与分离的嗜碱性粒细胞上的FcyR结合的事实)，因此在这些实验 中只使用鼠抗体TES-C21。交联山羊抗小鼠IgG增强了次最佳浓度 的阳性对照小鼠抗人IgE诱导的组胺释放，所述阳性对照小鼠抗人 IgE不抑制人IgE与FcsRI的结合。但是，在这些非常许可的条件 下，TES-C21不诱导组胺。
制备鼠抗体TES-C21的人源化版本，如在1997年5月25日授 权的澳大利亚专利No. 675449中所详述。可以遵循相似的方法制备 其他人源化的抗IgE抗体。适合用于本发明的一些产人源化抗IgE 抗体的转染瘤可以来自ATCC，编号如下11130、 11131、 11132、 11133。与以编号11131保藏的转染瘤生成的抗IgE抗体相似的抗 IgE抗体是具有用于治疗遗传过敏性皮炎的充分临床开发潜能的那些抗体。其他适合于治疗遗传过敏性皮炎的人源化抗体是Genentech, Inc生成的E25 (rhuMAb-E25)。在Presta et al.， J. Immunol. 151-:2623-2632 (1993)中描述了这个抗体。
上述的说明、术语、表达式和实施例仅仅是举例说明的，并不 作为限制。本发明包括上述实施方案的所有已知的和未知的等价形 式。下面的权利要求书限定了本发明，其不受本文的任何其他部分 或任何其他来源中的任何陈述的限制。
权利要求
1. 一种用于治疗或预防被施用引发IgE介导的应答的一种或多种替代治疗分子的哺乳动物体内的超敏反应和/或过敏症的方法，包括给哺乳动物施用足以治疗或预防超敏反应和/或过敏症的量的抗IgE抗体或其结合片段。
2. —种用于减轻或阻止被施用替代治疗分子的哺乳动物体内的 IgE介导的应答的方法，包括给哺乳动物施用足以减轻或预防IgE介 导的应答的量的抗IgE抗体或其结合片段。
3. —种用于降低被施用引发IgE介导的应答的替代治疗分子的 哺乳动物体内的过敏症危险的方法，包括给哺乳动物施用足以降低 过敏症危险的量的抗IgE抗体或其结合片段。
4. 一种用于诱导被施用引发IgE介导的应答的替代治疗分子的 哺乳动物体内的免疫耐受性的方法，包括给哺乳动物联合施用足以 诱导对所述替代分子的耐受性的有效脱敏量的替代治疗抗原和抗IgE抗体或其结合片段。
5. —种用于抑制被施用替代治疗分子的哺乳动物体内的IgE抗 体生成的方法，其包括给哺乳动物施用足以抑制IgE抗体生成的量 的抗IgE抗体或其结合片段。
6. —种减少有效治疗疾病所需的替代治疗分子的量的方法，包 括给哺乳动物施用足以减少中和性IgE并因此减少所需替代分子的 量的抗IgE抗体或其结合片段。
7. —种给哺乳动物施用替代治疗的方法，包括给哺乳动物施用 替代治疗分子以及给哺乳动物施用抗IgE抗体或其结合片段。
8. 权利要求1到7中任一项的方法，其中所述抗IgE抗体是单 克隆抗体。
9. 权利要求8的方法，其中所述单克隆抗体是人抗体、人源化 抗体、嵌合抗体或单链抗体。
10. 权利要求8的方法，其中所述单克隆抗体作为组合物施 用，所述组合物还包括生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、或 稳定剂。
11. 权利要求1到7中任一项的方法，其中所述结合片段是 ScFv、 Fv、 Fab、 F(ab')或F(ab')2。
12. 权利要求1到7中任一项的方法，其中静脉内、腹膜内、 经吸入、肌内、皮下或口服施用所述抗体。
13. 权利要求1到4中任一项的方法，其中所述IgE介导的应 答是过敏反应。
14. 权利要求1到13中任一项的方法，其中所述替代治疗分子 是因子VIII、因子IX、人a-L-艾度糖苷酸酶、人(3-葡糖脑苷脂酶或 人(3-半乳糖苷酶A。
15. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于治疗或预防被施用引 发IgE介导的应答的一种或多种替代治疗分子的哺乳动物体内的超 敏反应和/或过敏症的药物中的用途。
16. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于减轻或阻止被施用替 代治疗分子的哺乳动物体内的IgE介导的应答的药物中的用途。
17. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于降低被施用引发IgE 介导的应答的替代治疗分子的哺乳动物体内的过敏症危险的药物中 的用途。
18. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于诱导被施用引发IgE 介导的应答的替代治疗分子的哺乳动物体内的免疫耐受性的药物中 的用途。
19. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于抑制被施用替代治疗 分子的哺乳动物体内的IgE抗体生成的药物中的用途。
20. 抗IgE抗体或其结合片段在制备用于减少有效治疗疾病所需的替代治疗分子的量的药物中的用途。
21. 权利要求13到18中任一项的用途，其中所述抗IgE抗体 是单克隆抗体。
22. 权利要求19的用途，其中所述单克隆抗体是人抗体、人源 化抗体、嵌合抗体或单链抗体。
23. 权利要求19的用途，其中所述单克隆抗体作为组合物施 用，所述组合物还包括生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、或 稳定剂。
24. 权利要求13到18中任一项的用途，其中所述结合片段是 ScFv、 Fv、 Fab、 F(ab')或F(ab')2。
25. 含有替代治疗分子和抗IgE抗体或其结合片段、类似物或 衍生物的药物组合物。
全文摘要
本发明通常涉及一种通过施用抗IgE抗体或其结合片段治疗和/或预防接受引发IgE介导的应答的替代治疗分子的患者体内的超敏反应的方法，所述超敏反应包括过敏症。抗IgE抗体抑制哺乳动物体内的IgE介导的过敏反应，也能降低发生针对替代治疗分子的过敏反应的危险。随着时间施用抗IgE抗体也下调了高亲和力的IgE受体，进一步降低了超敏反应和/或过敏症的危险。抗IgE抗体与循环的或血清的IgE和/或B细胞上膜形式的IgE结合，但是不与结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的IgE结合，因为这可能会引起交联。这个方法也通过减少或清除特异于替代治疗分子的中和IgE抗体降低了施用替代治疗分子的剂量和/或频率。
文档编号A61K39/395GK101432019SQ200580033869
公开日2009年5月13日 申请日期2005年10月4日 优先权日2004年10月5日
发明者冯赐忠, 斯坦利·T.·刘易斯 申请人:泰勒公司
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