卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物及其制备方法
专利名称：卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物及其制备方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(以下简称为SOD)是广泛地分布在动物、植物、微生物等生物体内的酶。SOD具有非均化分解作为富于反应性的游离活性氧的超氧化物阴离子自由基的活性。期待可以将SOD用于抗风湿药物、自身免疫性疾病治疗剂、心肌梗塞治疗剂和脏器移植，以及用于除去脑梗塞后的抗血栓剂的使用时在生物体内产生的自由基，还可期待将其用于各种炎症等(参照非专利文献1)。
对于SOD，提出了各种衍生物。例如，提出了使用将特定SOD卵磷脂化而获得的卵磷脂化超氧化物歧化酶(以下，将卵磷脂化超氧化物歧化酶简称为PC-SOD)的制剂，该制剂在作为目标的患部的集结性和在生物体内的稳定性等有了大幅提高(参照专利文献1)。
专利文献1日本专利第3070980号公报非专利文献1谷口直之编，《活性酶在临床方面的展望》，医药杂志社，东京61-111页(1994年)发明的揭示但是，该PC-SOD作为医药品使用时在实际使用方面存在一些问题。例如，该PC-SOD通过使特定SOD和卵磷脂衍生物反应的方法制得。但是，通过现有方法制得的PC-SOD存在酶活性不一定稳定的问题，且可能会对制剂化工序及制剂产生影响。另外，现有方法的收率也不够高。
本发明的目的是提供可用作医药品基质(base)、且稳定性良好的PC-SOD组合物及其制备方法。
本发明者进行认真研究后发现，以特定SOD的1～4个氨基被卵磷脂残基取代的PC-SOD(A)(以下称为PC-SOD(A))为主成分的PC-SOD组合物可解决前述课题。对制备该PC-SOD组合物的条件进行探讨后发现，通过使卵磷脂衍生物和特定SOD以特定比例反应，采用特定的精制方法进行精制，可以高收率地获得该PC-SOD组合物。
即，本发明的PC-SOD组合物的特征在于，包含铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶的1个以上的氨基被下述通式(I) 表示的卵磷脂残基取代的PC-SOD，该PC-SOD以前述m个氨基被前述卵磷脂残基取代的前述PC-SOD(A)为主成分，其中，m为1～4的整数，m的平均值为1.5～2.4，该PC-SOD(A)由25～40摩尔％m＝1的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a1)、35～50摩尔％m＝2的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a2)、10～20摩尔％m＝3的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a3)和5～15摩尔％m＝4的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a4)形成，通式(I)中的R为碳数8～30的烷基，n为2～10的整数。
此外，本发明还涉及PC-SOD组合物的制备方法，该方法的特征在于，实施相对于1摩尔的下述通式(III) 表示的卵磷脂衍生物，使0.05～0.4倍摩尔的铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶与其反应，获得未精制的PC-SOD的卵磷脂化工序后，通过利用离子交换柱色谱法对该未精制PC-SOD进行精制的精制工序，制造权利要求1～7中任一项记载的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，通式(III)中，R为碳数8～30的烷基，Z为羟基或从形成活性酯的基团除去了羰基而得的基团，n为2～10的整数。
本发明的PC-SOD组合物是酶活性的稳定性及在生物体内的稳定性良好、易于制剂化的优良组合物，因此可作为医药品基质使用。此外，利用本发明的制备方法，能够以高收率地制备前述PC-SOD组合物。
实施发明的最佳方式本发明的PC-SOD组合物包含具备铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶(以下简称为来自人的SOD)的1个以上的氨基被下述通式(I)表示的卵磷脂残基取代的结构的PC-SOD。
对用于该PC-SOD的制备的SOD获得方法无特别限定，可以是来自人的SOD也可以是其它来源的SOD。即，本发明的来自人的SOD只要是具有与来自人的SOD同样的结构的SOD，来源可以是任意的。
本发明中，PC-SOD由后述的PC-SOD(A)和来自人的SOD的5个以上的氨基被卵磷脂残基(I)取代的PC-SOD(B)(以下称为PC-SOD(B))形成，PC-SOD的总量是指PC-SOD(A)和PC-SOD(B)的合计量。
通式(I)表示的卵磷脂残基(以下称为卵磷脂残基(I))中，R为碳数8～30的烷基，优选碳数14～22的烷基。R优选直链结构或支链结构，特好为直链结构。R优选碳数13、15或17的直链烷基，特好为碳数15的直链烷基。
n为2～10的整数，优选2～6，特好为3。
本发明中，PC-SOD组合物中所包含的PC-SOD是来自人的SOD的1个以上的氨基被卵磷脂残基(I)取代的化合物的总称。由于来自人的SOD中存在12个氨基，所以PC-SOD中的卵磷脂残基(I)数为1～12。
“被卵磷脂残基(I)取代”是指氨基(-NH2)的1个氢原子被卵磷脂残基(I)取代。
本发明的PC-SOD组合物以该卵磷脂残基(I)数(m)为1～4的整数、且m的平均值为1.5～2.4的PC-SOD(A)为主成分。m是与存在于PC-SOD(A)中的氨基结合的卵磷脂残基(I)的结合数。
“以PC-SOD(A)为主成分”是指包含于PC-SOD组合物的PC-SOD的量比中，PC-SOD(A)的比例最大。相对于PC-SOD组合物所包含的PC-SOD总量的PC-SOD(A)的比例优选75质量％以上，特好为85～100质量％。
此外，本发明中的PC-SOD(A)分别以特定的比例包含m值为1、2、3、或4的4种PC-SOD。即，PC-SOD(A)由25～40摩尔％m＝1的PC-SOD(a1)、35～50摩尔％m＝2的PC-SOD(a2)、10～20摩尔％m＝3的PC-SOD(a3)和5～15摩尔％m＝4的PC-SOD(a4)组成。
m的平均值为1.5～2.4。m的平均值是作为摩尔平均值算得的值，可由相对于PC-SOD(a1)、(a2)、(a3)及(a4)的总量的各摩尔比算出。
PC-SOD的卵磷脂残基的结合数较多时，由于疏水性提高，所以与细胞的结合性提高，易于被吸收入脂肪组织等。此外，在生物体内的稳定性也提高。另一方面，PC-SOD的卵磷脂残基的结合数较少时，由于亲水性提高，所以易于在注射剂等水性制剂中的应用。另外，在生物体内的酶活性也提高，具有生物体内作为抗原被识别的可能性下降等优点。
PC-SOD作为医药品使用时，必须要取得生物体内的动态、稳定性、制剂化的难易程度等的平衡。考虑这些因素后，本发明者发现，PC-SOD中的卵磷脂残基(I)的结合数的平均值为1.5～2.4时最合适。另外，考虑本发明的PC-SOD组合物的稳定性后发现，并不仅仅是使PC-SOD中的卵磷脂残基(I)的结合数为1.5～2.4，而是使具有一定数量的卵磷脂残基(I)的PC-SOD和卵磷脂残基(I)的结合数较少的PC-SOD并存，可以在提高其作为医药品基质的稳定性的同时高效地制备医药品基质和制剂。
本发明的PC-SOD组合物除了PC-SOD(A)以外，还可含有PC-SOD(B)。
存在于PC-SOD(B)中的卵磷脂残基(I)数(r)为5～12。由于存在于PC-SOD中的立体结构内部的氨基不易被取代，所以通常情况下r优选5～8。
PC-SOD组合物中含PC-SOD(B)时的PC-SOD(B)的量较好是相对于PC-SOD组合物中所含的PC-SOD的总量不足25质量％，更好的是不足15质量％。该量如果在25质量％以上，则基于前述理由，可能会影响到本发明的效果。
本发明中，PC-SOD是来自人的SOD中的1个以上的氨基被卵磷脂残基(I)取代的化合物，该氨基的1个以上还可被卵磷脂残基(I)以外的基团取代。作为该基团，可例举卵磷脂残基(I)的一部分分解而生成的基团、或用于PC-SOD的合成时的卵磷脂衍生物中所含的卵磷脂衍生物的分解物对氨基取代而形成的基团等。
作为该卵磷脂残基(I)以外的基团的具体例，可例举下述基团。下式中的n的含义与卵磷脂残基(I)中的n的含义相同。
另一方面，PC-SOD中的氨基被不含卵磷脂残基(I)的前述基团(IV)～(VI)等卵磷脂残基(I)以外的基团取代的化合物不包括在本发明的PC-SOD的概念中。
本发明的PC-SOD组合物中所含的PC-SOD(A)的比例最好考虑各方面的因素来进行控制。
例如，利用高效液相色谱法(以下简称为HPLC)测定的PC-SOD(A)的比例相对于PC-SOD的总量优选85％以上(单位为色谱图的面积％)，特好为85～100％，尤其好为90～100％。
另外，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的PC-SOD(A)的比例相对于PC-SOD的总量优选80％以上(单位为色谱图的面积％)，特好为85～100％。
HPLC和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的测定条件可采用后述的实施例中记载的条件。
将PC-SOD(A)的比例控制为前述特定比例的情况下，通常能够获得酶活性的稳定性和生物体内的稳定性良好的PC-SOD组合物。另外，利用该分析方法的控制更有效。此外，所得PC-SOD组合物的稳定性更好，所以也易于制剂化。
本发明的PC-SOD组合物中，所包含的作为PC-SOD主成分的PC-SOD(A)最好为2分子m相同或不同的PC-SOD(A)缔合的二聚体的形式。这样充分显现PC-SOD组合物的酶活性。作为该二聚体，可例示由2分子的PC-SOD(a2)形成的二聚体、由1分子的PC-SOD(a1)和1分子的PC-SOD(a3)形成的二聚体等。
另外，PC-SOD中包含PC-SOD(B)时，也可由该PC-SOD(B)和PC-SOD(A)及/或PC-SOD(B)之间缔合形成二聚体。
本发明的PC-SOD组合物有时包含PC-SOD(A)和PC-SOD(B)以外的化合物(以下称为其它化合物)。
作为其它化合物，可例举下述通式(II)RCOOH……(II)表示的脂肪酸，R的含义与前述通式(I)中的R相同。
通式(II)表示的脂肪酸的量相对于PC-SOD总量每1mg优选0.01～0.15nmol。
作为PC-SOD组合物中的脂肪酸的定量法，可例举气相色谱法、HPLC、质谱分析等方法。此外，也可例举利用标记化试剂进行标记化，用HPLC定量的方法。PC-SOD组合物中的脂肪酸浓度较低时，优选采用标记化试剂的方法。
此外，作为其它化合物，还可例举来自人的SOD的1个以上的氨基被选自前述(IV)、(V)或(VI)表示的基团的至少1种取代而卵磷脂残基(I)未取代的化合物。
本发明的PC-SOD组合物包含其它化合物时的量，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的比例计，优选20％以下，特好为0～15％(单位为色谱图的面积％)。
本发明的PC-SOD组合物具有作为超氧化物歧化酶的活性(SOD活性)。SOD活性最好作为以未被PC化的SOD、即来自人的SOD为基准的单位活性值求得。
作为PC-SOD组合物的单位活性值的测定方法，已知细胞色素C法、氮蓝四唑法、肾上腺素法、亚硝酸法等，优选采用细胞色素C法来测定单位活性值。利用细胞色素C法进行的测定可按照Y.Oyanagi(SOD和活性氧调节剂，p.95(1989))、J.M.McCord(J.Biol.Chem.，Vol.224，p.6049(1969))、K.Asada(Agr.Biol.Chem.，Vol.38，p.471(1974))等的文献记载的方法实施。
从制剂化的难易程度、在生物体内的稳定性和高效的药效显现的角度考虑，本发明的PC-SOD组合物的利用细胞色素C法测定的PC-SOD总量每1mg的单位活性值优选2000单位以上，特好为2300～7000单位。
实施使特定量的来自人的SOD和下述通式(III)表示的卵磷脂衍生物反应而获得未精制的PC-SOD的卵磷脂化工序后，实施利用离子交换柱色谱法对该未精制PC-SOD进行精制的精制工序，籍此可制得本发明的PC-SOD组合物。
通式(III)中，R、n与前述通式(I)的R、n相同。
Z表示羟基或从形成活性酯的基团除去了羰基而得的基团。作为后一种基团，例如可例举对硝基苯酚、1，3，5-三氯苯酚、五氟苯酚、2，4-二硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基哌啶、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二酰亚胺、8-羟基喹啉、2-羟基吡啶等含羟基的化合物除去了羟基的氢原子而得的基团。活性酯体的合成法可采用公知的方法(参照专利文献1及《肽合成的基础和实验》(泉屋等，1985年，丸善(株)发行)等)。
该工序最好通过在来自人的SOD溶于适当的溶剂而获得的SOD溶液中添加将前述通式(III)表示的卵磷脂衍生物溶于适当的溶剂而获得的卵磷脂衍生物溶液的方法实施。具体来讲，相对于1摩尔卵磷脂衍生物，使0.05～0.4倍摩尔、优选0.1～0.25倍摩尔的来自人的SOD与其反应，籍此可以高收率地获得本发明的PC-SOD组合物。
此时，通过调节添加速度、搅拌速度、反应温度、反应时间、反应压力等各种反应条件，能够以更高的收率获得本发明的PC-SOD组合物。
在SOD溶液中添加卵磷脂衍生物溶液的速度只要是卵磷脂衍生物可在短时间内分散于反应体系内的速度即可，通常较好为20～100mL/分钟，特好为40～80mL/分钟。
搅拌速度只要是卵磷脂衍生物可在短时间内分散于反应体系内的搅拌速度即可，通常较好为50～500rpm，特好为100～300rpm。
由于温度越高每1分子的SOD中的卵磷脂衍生物的导入数越多，所以反应温度的上限优选+20℃。反应温度的下限只要是反应液不会发生冻结的温度即可。反应温度优选0～+10℃。
反应时间优选0.5小时～72小时，特好为2～24小时。
反应压力优选0.05～0.2MPa，特好为大气压附近的压力。
为了以更好的收率和更佳的品质制备本发明的PC-SOD组合物，对于包含于SOD溶液中的来自人的SOD的浓度、卵磷脂衍生物溶液的添加方法等，最好设定更严密的条件。
具体来讲，最好以100～2000倍量的溶剂稀释来自人的SOD，调制SOD溶液后，在该溶液中加入用20～100倍量的有机溶剂稀释卵磷脂衍生物而得的卵磷脂衍生物溶液。
作为使SOD溶解的溶剂，可例举水或水和有机溶剂的混合溶剂。优选水和有机溶剂的混合溶剂。通过使用该混合溶剂，在添加卵磷脂衍生物溶液时可使反应体系均一化，防止沉淀物的产生。此外，最好使硼酸等溶于这些溶剂中而使其具备缓冲能力。
作为水，优选精制水、离子交换水、蒸馏水或注射用水(以下将它们总称为“水”)。作为有机溶剂，可例举异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4-二噁烷及甲醇等，优选异丙醇。
作为被用于卵磷脂衍生物的稀释的有机溶剂，可例示与被用于SOD溶液的调制的有机溶剂同样的溶剂，优选异丙醇。
以上获得的反应液(未精制PC-SOD)中，除了PC-SOD(A)以外，还共存有PC-SOD(B)、未反应的来自人的SOD、未反应的卵磷脂衍生物及其它成分。作为该其它成分，可例举来自被用于卵磷脂衍生物的合成的试剂的未反应物等。
然后，实施利用离子交换柱色谱法对前述卵磷脂化工序获得的未精制PC-SOD进行精制的精制工序。通过实施该精制工序，能够以高收率获得本发明的PC-SOD组合物。
精制工序可通过在填充有离子交换树脂的柱中加入前述未精制PC-SOD使其吸附后、用含缓冲液的溶剂使作为目标的PC-SOD组合物溶解析出的方法实施，前述缓冲液含无机盐。
作为离子交换树脂，可以任意使用阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。
作为用于溶解析出的溶剂所含的缓冲液，只要是含无机盐的具有缓冲能力的溶液即可，无特别限定。但是，采用磷酸系缓冲液时，由于PC-SOD会不溶化，所以在使用前必须充分确认溶解性。从保持精制时的PC-SOD的稳定性考虑，缓冲液的pH优选6～9。
作为无机盐，可例举氯化钠、硫酸铵等。它们可单独使用，也可作为任意比例的混合物使用。
此外，为了提高PC-SOD的溶解性，用于溶解析出的溶剂最好含有有机溶剂。
作为有机溶剂，可例举异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4-二噁烷、甲醇等。其中，从PC-SOD的溶解性良好、精制效率高的角度考虑，优选甲醇。
该溶剂中所含的有机溶剂量以不会使PC-SOD不溶化、且不会妨碍PC-SOD对离子交换树脂的吸附的量为佳。相对于溶剂的总容量，有机溶剂的比例优选10～80容量％，特好为20～70容量％，尤其好为40～60容量％。
通过改变溶剂所含的缓冲液的无机盐浓度，可使作为目标的PC-SOD组合物溶解析出。
具体来讲，最好通过下述步骤实施，即，将未精制PC-SOD填入柱后，使未吸附的物质溶解析出。然后，采用下述溶剂(A)使未反应的SOD溶解析出，再用下述溶剂(B)使本发明的PC-SOD组合物析出。
溶剂(A)由无机盐浓度为5～100mM的pH6～9的缓冲液(a1)和甲醇形成，相对于溶剂(A)的该缓冲液(a1)量为20～90容量％，甲醇量为10～80容量％的溶剂。
溶剂(B)由无机盐浓度为150～400mM的pH6～9的缓冲液(b1)和甲醇形成，相对于溶剂(B)的该缓冲液(b1)量为20～90容量％，甲醇量为10～80容量％的溶剂。
利用前述制备方法获得的含有PC-SOD组合物的部分最好实施超滤以除去该部分所含的无机盐及有机溶剂等。通过实施超滤，可获得含PC-SOD组合物及水的PC-SOD组合物的水性溶液。还可对该水性溶液进行干燥，籍此精制PC-SOD组合物，由于PC-SOD组合物的制剂化通常情况下采用水性溶液实施，所以最好以水性溶液的形式获得。该水性溶液中的PC-SOD组合物的浓度优选0.1～300mg/mL，特好为1～50mg/mL。
本发明的PC-SOD组合物可作为医药品基质使用，通过添加各种添加剂、稀释等操作可制成制剂。
作为剂型形态，可例举注射剂(溶液、悬浊液、乳浊液、使用时再溶解的固体制剂等)、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、溶液剂、脂质体制剂、凝胶剂、外用散剂、喷雾剂、吸入散剂和栓剂等。
给药方法可采用注射(肌肉内、皮下、皮内、静脉内等)、口服、吸入等给药方法。给药量根据制剂的调制方法、剂型、疾病的种类、该制剂的给药方法、给药形态、使用目的、患者的体重等分别设定，例如成人1天0.5～200mg。
实施例以下，对本发明的实施例进行说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。
PC-SOD组合物的制备例在20L烧瓶中加入注射用蒸馏水(大塚制药株式会社制，商品名大琢蒸馏水，下同)(9000mL)，再依次添加硼酸(27.7g)、NaOH(3.6g)和KCl(33.7g)，溶解。然后，添加SOD水溶液(100g，SOD浓度113.6mg/mL)，以210rpm搅拌的同时，在层析室(chromato-chamber)内以33mL/分钟的速度滴加温度为8℃的异丙醇(2000mL)，调制SOD溶液。
将按照日本专利第3070980号公报记载的方法制得的下述卵磷脂衍生物(15.7g)溶于异丙醇(500mL)。然后，用疏水性滤器过滤除去不溶物。在滤液中添加异丙醇，使总容量达到8000mL，制成卵磷脂衍生物溶液。溶液温度为8℃。接着，以66mL/分钟的速度在前述SOD溶液中滴加该卵磷脂衍生物溶液(8000mL)，将于210rpm搅拌4小时而得的溶液作为反应液。
使反应液全部承载于填入了用硼酸缓冲液(50mmol/L，pH8.5±0.2)和甲醇的1∶1(容量比)混合溶液预先进行了平衡化处理的离子交换树脂(Cellulofinesf A-500)的柱。利用前述混合溶液溶解析出未吸附物质，获得含有N-羟基琥珀酰亚胺、1H-四唑和二环己基碳二亚胺的部分。
然后，采用溶有NaCl的50mmol/L硼酸缓冲液(pH8.5±0.2，NaCl浓度＝25mmol/L)和甲醇的1∶1(容量比)洗脱溶剂，使未修饰的SOD溶解析出。
接着，采用溶有NaCl的50mmol/L硼酸缓冲液(pH8.5±0.2，NaCl浓度＝200mmol/L)和甲醇的1∶1(容量比)洗脱溶剂，将溶解析出的部分作为PC-SOD组合物部分。
通过对PC-SOD组合物部分进行超滤，除去盐类和甲醇，用注射用蒸馏水置换，为了调整浓度而进行了浓缩。超滤膜采用ミリポア公司的PLGC0005(区分分子量10000，膜面积0.5cm2)。在超滤透过侧的电导率变得与注射用蒸馏水的电导率相同时结束过滤操作，再将溶液中的PC-SOD浓度调整为约40mg/mL，获得PC-SOD组合物的水性溶液(Lot.001)。到此为止的操作都在温度保持为4℃的层析室内边测液温边实施。
利用分离用HPLC，分离出与PC-SOD组合物中的PC-SOD的各峰对应的部分。HPLC的柱采用Phenyl 5PW-RP(75mm×4.6mm，东ソ一株式会社制)，作为流动相，由0.1％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液及0.075％三氟乙酸和90％乙腈的水溶液形成浓度梯度，以0.8mL/分钟的速度流动。检测器采用UV检测器(波长220nm)，柱温为室温。
对所得部分进行MALDI TOF-MS分析，测定PC-SOD的分子量和链段。求出与1分子的PC-SOD结合的卵磷脂衍生物的结合数(m)、与各结合数对应的PC-SOD的比例(摩尔％)、m的平均值及每个PC-SOD二聚体的m的平均值，结果示于下表1。
水性溶液(Lot.001)所含的PC-SOD结合了1～4分子的卵磷脂衍生物，m的平均值为2。
采用与例1同样的操作，获得PC-SOD组合物的水性溶液(Lot.002及003)。求出各水性溶液中的与1分子PC-SOD结合的卵磷脂衍生物的结合数(m)、与各结合数对应的PC-SOD的比例(摩尔％)、m的平均值及每个PC-SOD二聚体的m的平均值，结果汇总示于下表1。
表1 [例4]利用HPLC的纯度试验例(其1)在例1制得的水性溶液(Lot.001，500μL)中加入注射用蒸馏水，在PC-SOD的浓度达到30mg/mL的溶液(500μL)中加入注射用蒸馏水(2500μL)，获得分析用试样。对分析用试样进行HPLC分析的结果是，相对于PC-SOD总量的PC-SOD(A)的比例为96.7％(单位为色谱图的面积％)。
HPLC分析中，柱采用YMC A-502S-5 120A CN(150mm×4.6mm，YMC公司制)，作为流动相，由0.1％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液及0.075％三氟乙酸和90％乙腈的水溶液形成浓度梯度，以0.8mL/分钟的速度流动。检测器采用UV检测器(波长220nm)，柱温为室温。
利用HPLC的纯度试验例(其2)对于按照与例1同样的方法获得的含PC-SOD组合物的水性溶液(Lot.005)，实施与例4同样的HPLC测定，其结果是，相对于PC-SOD总量的PC-SOD(A)的比例为97.3％(单位为色谱图的面积％)。
利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的纯度测定例用水稀释例1制得的水性溶液(Lot.001，500μL)，在浓度达到30mg/mL的溶液(100μL)中加入水(2900μL)，形成试样溶液。
此外，将在试样溶液(100μL)中加入了水(900μL)而形成的溶液作为比较试样溶液。
在试样溶液及比较试样溶液各20μL中加入试样缓冲液(8μL)，于95℃加热3分钟。该试样缓冲液可按照以下步骤制得。即，将甘油(10g)、十二烷基硫酸钠(2g)、溴酚蓝(100mg)溶于Tris-HCl缓冲液(50mmol/L)，形成100mL溶液，再从该溶液中取出95μL，添加2-巯基乙醇(5μL)调制而得上述试样缓冲液。
对经过前述处理的试样溶液及比较试样溶液各4μL实施电泳。电泳结束后，马上将凝胶移入染色室实施染色。染色结束后，在保护液中浸渍30分钟，再将凝胶干燥。在甘油(20mL)中加水形成500mL的溶液，即为保护液。
对试样溶液的主谱带以外的谱带的大小和比较试样溶液的主谱带的大小进行比较，其结果是，包含于PC-SOD组合物的PC-SOD(A)的比例为90％(单位为色谱图的面积％)。
单位活性值的测定例采用细胞色素C法测定单位活性值。测定方法可按照Y.Oyanagi(SOD和活性酶调节剂，p.95(1989))、J.M.McCord(J.Biol.Chem.，Vol.224，p.6049(1969))及K.Asada(Agr.Biol.Chem.，Vol.38，p.471(1974))等的文献记载的方法实施。将单位活性值在4500～5500范围内的来自人的SOD作为标准品使用。
在前述例获得的PC-SOD组合物的浓度不同的试样中加入黄嘌呤氧化酶溶液，测定对紫外光(550nm)的吸光度。由浓度和吸光度的数据，利用最小二乘方法获得校正曲线，由每1分钟的吸光度增加率求得试样的单位活性值，其结果是，Lot.001中的PC-SOD组合物的单位活性值(U/mg-SOD)为3400。单位活性值的单位“U/mg-SOD”表示相对于SOD的总量(1mg)的值。
脂肪酸的定量例将棕榈酸(256mg)溶于乙醇形成20mL溶液，将该20mL溶液作为50mmol/L标准原液。用乙醇稀释该标准原液，分别调制出0.1mmol/L、0.05mmol/L及0.01mmol/L的棕榈酸标准试样。此外，将(棕榈酸的称量值)/(棕榈酸分子量＝256.43)值作为因子(FP)。
另外，将十七烷酸(27mg)溶于乙醇形成200mL溶液，将该200mL溶液作为0.5mmol/L内标溶液。
在棕榈酸标准试样(各100μL)、例1获得的水性溶液(Lot.001)、通过与例1同样的方法获得的水性溶液(Lot.005，Lot.008)(100μL)中分别加入前述内标溶液(100μL)。采用乙醇(100μL)作为空白。
在各溶液中加入由A液～C液形成的长链·短链脂肪酸标记化试剂(YMC公司制)的A液及B液，在60℃的恒温槽中搅拌20分钟。再加入C液(200μL)，在60℃的恒温槽中搅拌15分钟，将所得溶液作为HPLC测定试样。
HPLC的测定中，柱采用YMC A-512S-5 120A CN(150mm×6.0mm，YMC公司制)。流动相采用0.01％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液，使0.01％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液的浓度发生变化的同时以1mL/分钟的速度流动。检测器采用UV检测器(波长230nm)，柱温为室温。
由所得的HPLC色谱图求出棕榈酸的面积％，再利用内标溶液的测定值进行换算，求得棕榈酸含量。Lot.001的相对于PC-SOD总量的棕榈酸浓度为0.074nmol/mg，Lot.005的该浓度为0.094nmol/mg，Lot.008的该浓度为0.067nmol/mg。
产业上利用的可能性本发明的PC-SOD组合物是酶活性的稳定性和在生物体内的稳定性良好、也易于制剂化的优良组合物。因此，可有效地用于抗风湿药物、自身免疫性疾病治疗剂等各种治疗剂。
这里，引用2004年10月12日提出申请的日本专利申请2004-297519号的说明书、权利要求书及摘要的全部内容作为本发明的说明书的揭示。
权利要求
1.卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，包含铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶的1个以上的氨基被下述通式(I) 表示的卵磷脂残基取代的卵磷脂化超氧化物歧化酶，该卵磷脂化超氧化物歧化酶以m个前述氨基被前述卵磷脂残基取代的卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)为主成分，其中，m为1～4的整数，m的平均值为1.5～2.4，该卵磷脂化的超氧化物歧化酶(A)由25～40摩尔％m＝1的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a1)、35～50摩尔％m＝2的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a2)、10～20摩尔％m＝3的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a3)和5～15摩尔％m＝4的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a4)形成，通式(I)中的R为碳数8～30的烷基，n为2～10的整数。
2.如权利要求1所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，含有超氧化物歧化酶的5个以上的氨基被前述通式(I)表示的卵磷脂残基取代的卵磷脂化超氧化物歧化酶(B)。
3.如权利要求1或2所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，利用高效液相色谱法测定的卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)的比例相对于卵磷脂化超氧化物歧化酶的总量在85％以上，其单位为色谱图的面积％。
4.如权利要求1～3中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)的比例相对于卵磷脂化超氧化物歧化酶的总量在80％以上，其单位为色谱图的面积％。
5.如权利要求1～4中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，利用细胞色素C法测定的卵磷脂化超氧化物歧化酶总量每1mg的单位活性值在2000单位以上。
6.如权利要求1～5中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，卵磷脂化超氧化物歧化酶总量每1mg中含有0.01～0.15nmol的下述通式(II)RCOOH……(II)表示的脂肪酸，式中，R为碳数8～30的烷基。
7.如权利要求1～6中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)以2分子m相同或不同的卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)缔合的二聚体的形式被包含。
8.卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，实施相对于1摩尔的下述通式(III) 表示的卵磷脂衍生物，使0.05～0.4倍摩尔的铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶与其反应，获得未精制的卵磷脂化超氧化物歧化酶的卵磷脂化工序后，通过利用离子交换柱色谱法对该未精制的卵磷脂化超氧化物歧化酶进行精制的精制工序，制造权利要求1～7中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，通式(III)中，R为碳数8～30的烷基，Z为羟基或从形成活性酯的基团除去了羰基而得的基团，n为2～10的整数。
9.如权利要求8所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，使卵磷脂化工序所得的未精制的卵磷脂化超氧化物歧化酶吸附于离子交换树脂后，采用下述溶剂(A)使未反应的卵磷脂化超氧化物歧化酶溶解析出，再采用下述溶剂(B)使权利要求1～7中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物溶解析出，籍此实施精制工序；溶剂(A)由无机盐浓度为5～100mM的pH6～9的缓冲液(a1)和甲醇形成，相对于溶剂(A)的该缓冲液(a1)量为20～90容量％，甲醇量为10～80容量％的溶剂；溶剂(B)由无机盐浓度为150～400mM的pH6～9的缓冲液(b1)和甲醇形成，相对于溶剂(B)的该缓冲液(b1)量为20～90容量％，甲醇量为10～80容量％的溶剂。
全文摘要
本发明提供可作为医药品基质使用的卵磷脂化超氧化物歧化酶(PC－SOD)组合物及其制备方法。该组合物包含特定SOD的1个以上的氨基被上述通式(I)，表示的卵磷脂残基取代的PC－SOD，该PC－SOD以m个前述氨基被前述卵磷脂残基取代的PC－SOD(A)为主成分，其中，m为1～4的整数，且m的平均值为1.5～2.4，该PC－SOD(A)由m＝1的PC－SOD(a1)、m＝2的PC－SOD(a2)、m＝3的PC－SOD(a3)和m＝4的PC－SOD(a4)形成。
文档编号A61P9/10GK101035891SQ200580034389
公开日2007年9月12日 申请日期2005年10月5日 优先权日2004年10月12日
发明者野本英男, 中山利明, 村桥麻纪, 森泽义富 申请人:日本株式会社Ltt生物医药
技术领域：
本发明涉及卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物及其制备方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(以下简称为SOD)是广泛地分布在动物、植物、微生物等生物体内的酶。SOD具有非均化分解作为富于反应性的游离活性氧的超氧化物阴离子自由基的活性。期待可以将SOD用于抗风湿药物、自身免疫性疾病治疗剂、心肌梗塞治疗剂和脏器移植，以及用于除去脑梗塞后的抗血栓剂的使用时在生物体内产生的自由基，还可期待将其用于各种炎症等(参照非专利文献1)。
对于SOD，提出了各种衍生物。例如，提出了使用将特定SOD卵磷脂化而获得的卵磷脂化超氧化物歧化酶(以下，将卵磷脂化超氧化物歧化酶简称为PC-SOD)的制剂，该制剂在作为目标的患部的集结性和在生物体内的稳定性等有了大幅提高(参照专利文献1)。
专利文献1日本专利第3070980号公报非专利文献1谷口直之编，《活性酶在临床方面的展望》，医药杂志社，东京61-111页(1994年)发明的揭示但是，该PC-SOD作为医药品使用时在实际使用方面存在一些问题。例如，该PC-SOD通过使特定SOD和卵磷脂衍生物反应的方法制得。但是，通过现有方法制得的PC-SOD存在酶活性不一定稳定的问题，且可能会对制剂化工序及制剂产生影响。另外，现有方法的收率也不够高。
本发明的目的是提供可用作医药品基质(base)、且稳定性良好的PC-SOD组合物及其制备方法。
本发明者进行认真研究后发现，以特定SOD的1～4个氨基被卵磷脂残基取代的PC-SOD(A)(以下称为PC-SOD(A))为主成分的PC-SOD组合物可解决前述课题。对制备该PC-SOD组合物的条件进行探讨后发现，通过使卵磷脂衍生物和特定SOD以特定比例反应，采用特定的精制方法进行精制，可以高收率地获得该PC-SOD组合物。
即，本发明的PC-SOD组合物的特征在于，包含铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶的1个以上的氨基被下述通式(I) 表示的卵磷脂残基取代的PC-SOD，该PC-SOD以前述m个氨基被前述卵磷脂残基取代的前述PC-SOD(A)为主成分，其中，m为1～4的整数，m的平均值为1.5～2.4，该PC-SOD(A)由25～40摩尔％m＝1的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a1)、35～50摩尔％m＝2的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a2)、10～20摩尔％m＝3的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a3)和5～15摩尔％m＝4的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a4)形成，通式(I)中的R为碳数8～30的烷基，n为2～10的整数。
此外，本发明还涉及PC-SOD组合物的制备方法，该方法的特征在于，实施相对于1摩尔的下述通式(III) 表示的卵磷脂衍生物，使0.05～0.4倍摩尔的铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶与其反应，获得未精制的PC-SOD的卵磷脂化工序后，通过利用离子交换柱色谱法对该未精制PC-SOD进行精制的精制工序，制造权利要求1～7中任一项记载的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，通式(III)中，R为碳数8～30的烷基，Z为羟基或从形成活性酯的基团除去了羰基而得的基团，n为2～10的整数。
本发明的PC-SOD组合物是酶活性的稳定性及在生物体内的稳定性良好、易于制剂化的优良组合物，因此可作为医药品基质使用。此外，利用本发明的制备方法，能够以高收率地制备前述PC-SOD组合物。
实施发明的最佳方式本发明的PC-SOD组合物包含具备铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶(以下简称为来自人的SOD)的1个以上的氨基被下述通式(I)表示的卵磷脂残基取代的结构的PC-SOD。
对用于该PC-SOD的制备的SOD获得方法无特别限定，可以是来自人的SOD也可以是其它来源的SOD。即，本发明的来自人的SOD只要是具有与来自人的SOD同样的结构的SOD，来源可以是任意的。
本发明中，PC-SOD由后述的PC-SOD(A)和来自人的SOD的5个以上的氨基被卵磷脂残基(I)取代的PC-SOD(B)(以下称为PC-SOD(B))形成，PC-SOD的总量是指PC-SOD(A)和PC-SOD(B)的合计量。
通式(I)表示的卵磷脂残基(以下称为卵磷脂残基(I))中，R为碳数8～30的烷基，优选碳数14～22的烷基。R优选直链结构或支链结构，特好为直链结构。R优选碳数13、15或17的直链烷基，特好为碳数15的直链烷基。
n为2～10的整数，优选2～6，特好为3。
本发明中，PC-SOD组合物中所包含的PC-SOD是来自人的SOD的1个以上的氨基被卵磷脂残基(I)取代的化合物的总称。由于来自人的SOD中存在12个氨基，所以PC-SOD中的卵磷脂残基(I)数为1～12。
“被卵磷脂残基(I)取代”是指氨基(-NH2)的1个氢原子被卵磷脂残基(I)取代。
本发明的PC-SOD组合物以该卵磷脂残基(I)数(m)为1～4的整数、且m的平均值为1.5～2.4的PC-SOD(A)为主成分。m是与存在于PC-SOD(A)中的氨基结合的卵磷脂残基(I)的结合数。
“以PC-SOD(A)为主成分”是指包含于PC-SOD组合物的PC-SOD的量比中，PC-SOD(A)的比例最大。相对于PC-SOD组合物所包含的PC-SOD总量的PC-SOD(A)的比例优选75质量％以上，特好为85～100质量％。
此外，本发明中的PC-SOD(A)分别以特定的比例包含m值为1、2、3、或4的4种PC-SOD。即，PC-SOD(A)由25～40摩尔％m＝1的PC-SOD(a1)、35～50摩尔％m＝2的PC-SOD(a2)、10～20摩尔％m＝3的PC-SOD(a3)和5～15摩尔％m＝4的PC-SOD(a4)组成。
m的平均值为1.5～2.4。m的平均值是作为摩尔平均值算得的值，可由相对于PC-SOD(a1)、(a2)、(a3)及(a4)的总量的各摩尔比算出。
PC-SOD的卵磷脂残基的结合数较多时，由于疏水性提高，所以与细胞的结合性提高，易于被吸收入脂肪组织等。此外，在生物体内的稳定性也提高。另一方面，PC-SOD的卵磷脂残基的结合数较少时，由于亲水性提高，所以易于在注射剂等水性制剂中的应用。另外，在生物体内的酶活性也提高，具有生物体内作为抗原被识别的可能性下降等优点。
PC-SOD作为医药品使用时，必须要取得生物体内的动态、稳定性、制剂化的难易程度等的平衡。考虑这些因素后，本发明者发现，PC-SOD中的卵磷脂残基(I)的结合数的平均值为1.5～2.4时最合适。另外，考虑本发明的PC-SOD组合物的稳定性后发现，并不仅仅是使PC-SOD中的卵磷脂残基(I)的结合数为1.5～2.4，而是使具有一定数量的卵磷脂残基(I)的PC-SOD和卵磷脂残基(I)的结合数较少的PC-SOD并存，可以在提高其作为医药品基质的稳定性的同时高效地制备医药品基质和制剂。
本发明的PC-SOD组合物除了PC-SOD(A)以外，还可含有PC-SOD(B)。
存在于PC-SOD(B)中的卵磷脂残基(I)数(r)为5～12。由于存在于PC-SOD中的立体结构内部的氨基不易被取代，所以通常情况下r优选5～8。
PC-SOD组合物中含PC-SOD(B)时的PC-SOD(B)的量较好是相对于PC-SOD组合物中所含的PC-SOD的总量不足25质量％，更好的是不足15质量％。该量如果在25质量％以上，则基于前述理由，可能会影响到本发明的效果。
本发明中，PC-SOD是来自人的SOD中的1个以上的氨基被卵磷脂残基(I)取代的化合物，该氨基的1个以上还可被卵磷脂残基(I)以外的基团取代。作为该基团，可例举卵磷脂残基(I)的一部分分解而生成的基团、或用于PC-SOD的合成时的卵磷脂衍生物中所含的卵磷脂衍生物的分解物对氨基取代而形成的基团等。
作为该卵磷脂残基(I)以外的基团的具体例，可例举下述基团。下式中的n的含义与卵磷脂残基(I)中的n的含义相同。
另一方面，PC-SOD中的氨基被不含卵磷脂残基(I)的前述基团(IV)～(VI)等卵磷脂残基(I)以外的基团取代的化合物不包括在本发明的PC-SOD的概念中。
本发明的PC-SOD组合物中所含的PC-SOD(A)的比例最好考虑各方面的因素来进行控制。
例如，利用高效液相色谱法(以下简称为HPLC)测定的PC-SOD(A)的比例相对于PC-SOD的总量优选85％以上(单位为色谱图的面积％)，特好为85～100％，尤其好为90～100％。
另外，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的PC-SOD(A)的比例相对于PC-SOD的总量优选80％以上(单位为色谱图的面积％)，特好为85～100％。
HPLC和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的测定条件可采用后述的实施例中记载的条件。
将PC-SOD(A)的比例控制为前述特定比例的情况下，通常能够获得酶活性的稳定性和生物体内的稳定性良好的PC-SOD组合物。另外，利用该分析方法的控制更有效。此外，所得PC-SOD组合物的稳定性更好，所以也易于制剂化。
本发明的PC-SOD组合物中，所包含的作为PC-SOD主成分的PC-SOD(A)最好为2分子m相同或不同的PC-SOD(A)缔合的二聚体的形式。这样充分显现PC-SOD组合物的酶活性。作为该二聚体，可例示由2分子的PC-SOD(a2)形成的二聚体、由1分子的PC-SOD(a1)和1分子的PC-SOD(a3)形成的二聚体等。
另外，PC-SOD中包含PC-SOD(B)时，也可由该PC-SOD(B)和PC-SOD(A)及/或PC-SOD(B)之间缔合形成二聚体。
本发明的PC-SOD组合物有时包含PC-SOD(A)和PC-SOD(B)以外的化合物(以下称为其它化合物)。
作为其它化合物，可例举下述通式(II)RCOOH……(II)表示的脂肪酸，R的含义与前述通式(I)中的R相同。
通式(II)表示的脂肪酸的量相对于PC-SOD总量每1mg优选0.01～0.15nmol。
作为PC-SOD组合物中的脂肪酸的定量法，可例举气相色谱法、HPLC、质谱分析等方法。此外，也可例举利用标记化试剂进行标记化，用HPLC定量的方法。PC-SOD组合物中的脂肪酸浓度较低时，优选采用标记化试剂的方法。
此外，作为其它化合物，还可例举来自人的SOD的1个以上的氨基被选自前述(IV)、(V)或(VI)表示的基团的至少1种取代而卵磷脂残基(I)未取代的化合物。
本发明的PC-SOD组合物包含其它化合物时的量，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的比例计，优选20％以下，特好为0～15％(单位为色谱图的面积％)。
本发明的PC-SOD组合物具有作为超氧化物歧化酶的活性(SOD活性)。SOD活性最好作为以未被PC化的SOD、即来自人的SOD为基准的单位活性值求得。
作为PC-SOD组合物的单位活性值的测定方法，已知细胞色素C法、氮蓝四唑法、肾上腺素法、亚硝酸法等，优选采用细胞色素C法来测定单位活性值。利用细胞色素C法进行的测定可按照Y.Oyanagi(SOD和活性氧调节剂，p.95(1989))、J.M.McCord(J.Biol.Chem.，Vol.224，p.6049(1969))、K.Asada(Agr.Biol.Chem.，Vol.38，p.471(1974))等的文献记载的方法实施。
从制剂化的难易程度、在生物体内的稳定性和高效的药效显现的角度考虑，本发明的PC-SOD组合物的利用细胞色素C法测定的PC-SOD总量每1mg的单位活性值优选2000单位以上，特好为2300～7000单位。
实施使特定量的来自人的SOD和下述通式(III)表示的卵磷脂衍生物反应而获得未精制的PC-SOD的卵磷脂化工序后，实施利用离子交换柱色谱法对该未精制PC-SOD进行精制的精制工序，籍此可制得本发明的PC-SOD组合物。
通式(III)中，R、n与前述通式(I)的R、n相同。
Z表示羟基或从形成活性酯的基团除去了羰基而得的基团。作为后一种基团，例如可例举对硝基苯酚、1，3，5-三氯苯酚、五氟苯酚、2，4-二硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基哌啶、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二酰亚胺、8-羟基喹啉、2-羟基吡啶等含羟基的化合物除去了羟基的氢原子而得的基团。活性酯体的合成法可采用公知的方法(参照专利文献1及《肽合成的基础和实验》(泉屋等，1985年，丸善(株)发行)等)。
该工序最好通过在来自人的SOD溶于适当的溶剂而获得的SOD溶液中添加将前述通式(III)表示的卵磷脂衍生物溶于适当的溶剂而获得的卵磷脂衍生物溶液的方法实施。具体来讲，相对于1摩尔卵磷脂衍生物，使0.05～0.4倍摩尔、优选0.1～0.25倍摩尔的来自人的SOD与其反应，籍此可以高收率地获得本发明的PC-SOD组合物。
此时，通过调节添加速度、搅拌速度、反应温度、反应时间、反应压力等各种反应条件，能够以更高的收率获得本发明的PC-SOD组合物。
在SOD溶液中添加卵磷脂衍生物溶液的速度只要是卵磷脂衍生物可在短时间内分散于反应体系内的速度即可，通常较好为20～100mL/分钟，特好为40～80mL/分钟。
搅拌速度只要是卵磷脂衍生物可在短时间内分散于反应体系内的搅拌速度即可，通常较好为50～500rpm，特好为100～300rpm。
由于温度越高每1分子的SOD中的卵磷脂衍生物的导入数越多，所以反应温度的上限优选+20℃。反应温度的下限只要是反应液不会发生冻结的温度即可。反应温度优选0～+10℃。
反应时间优选0.5小时～72小时，特好为2～24小时。
反应压力优选0.05～0.2MPa，特好为大气压附近的压力。
为了以更好的收率和更佳的品质制备本发明的PC-SOD组合物，对于包含于SOD溶液中的来自人的SOD的浓度、卵磷脂衍生物溶液的添加方法等，最好设定更严密的条件。
具体来讲，最好以100～2000倍量的溶剂稀释来自人的SOD，调制SOD溶液后，在该溶液中加入用20～100倍量的有机溶剂稀释卵磷脂衍生物而得的卵磷脂衍生物溶液。
作为使SOD溶解的溶剂，可例举水或水和有机溶剂的混合溶剂。优选水和有机溶剂的混合溶剂。通过使用该混合溶剂，在添加卵磷脂衍生物溶液时可使反应体系均一化，防止沉淀物的产生。此外，最好使硼酸等溶于这些溶剂中而使其具备缓冲能力。
作为水，优选精制水、离子交换水、蒸馏水或注射用水(以下将它们总称为“水”)。作为有机溶剂，可例举异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4-二噁烷及甲醇等，优选异丙醇。
作为被用于卵磷脂衍生物的稀释的有机溶剂，可例示与被用于SOD溶液的调制的有机溶剂同样的溶剂，优选异丙醇。
以上获得的反应液(未精制PC-SOD)中，除了PC-SOD(A)以外，还共存有PC-SOD(B)、未反应的来自人的SOD、未反应的卵磷脂衍生物及其它成分。作为该其它成分，可例举来自被用于卵磷脂衍生物的合成的试剂的未反应物等。
然后，实施利用离子交换柱色谱法对前述卵磷脂化工序获得的未精制PC-SOD进行精制的精制工序。通过实施该精制工序，能够以高收率获得本发明的PC-SOD组合物。
精制工序可通过在填充有离子交换树脂的柱中加入前述未精制PC-SOD使其吸附后、用含缓冲液的溶剂使作为目标的PC-SOD组合物溶解析出的方法实施，前述缓冲液含无机盐。
作为离子交换树脂，可以任意使用阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。
作为用于溶解析出的溶剂所含的缓冲液，只要是含无机盐的具有缓冲能力的溶液即可，无特别限定。但是，采用磷酸系缓冲液时，由于PC-SOD会不溶化，所以在使用前必须充分确认溶解性。从保持精制时的PC-SOD的稳定性考虑，缓冲液的pH优选6～9。
作为无机盐，可例举氯化钠、硫酸铵等。它们可单独使用，也可作为任意比例的混合物使用。
此外，为了提高PC-SOD的溶解性，用于溶解析出的溶剂最好含有有机溶剂。
作为有机溶剂，可例举异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4-二噁烷、甲醇等。其中，从PC-SOD的溶解性良好、精制效率高的角度考虑，优选甲醇。
该溶剂中所含的有机溶剂量以不会使PC-SOD不溶化、且不会妨碍PC-SOD对离子交换树脂的吸附的量为佳。相对于溶剂的总容量，有机溶剂的比例优选10～80容量％，特好为20～70容量％，尤其好为40～60容量％。
通过改变溶剂所含的缓冲液的无机盐浓度，可使作为目标的PC-SOD组合物溶解析出。
具体来讲，最好通过下述步骤实施，即，将未精制PC-SOD填入柱后，使未吸附的物质溶解析出。然后，采用下述溶剂(A)使未反应的SOD溶解析出，再用下述溶剂(B)使本发明的PC-SOD组合物析出。
溶剂(A)由无机盐浓度为5～100mM的pH6～9的缓冲液(a1)和甲醇形成，相对于溶剂(A)的该缓冲液(a1)量为20～90容量％，甲醇量为10～80容量％的溶剂。
溶剂(B)由无机盐浓度为150～400mM的pH6～9的缓冲液(b1)和甲醇形成，相对于溶剂(B)的该缓冲液(b1)量为20～90容量％，甲醇量为10～80容量％的溶剂。
利用前述制备方法获得的含有PC-SOD组合物的部分最好实施超滤以除去该部分所含的无机盐及有机溶剂等。通过实施超滤，可获得含PC-SOD组合物及水的PC-SOD组合物的水性溶液。还可对该水性溶液进行干燥，籍此精制PC-SOD组合物，由于PC-SOD组合物的制剂化通常情况下采用水性溶液实施，所以最好以水性溶液的形式获得。该水性溶液中的PC-SOD组合物的浓度优选0.1～300mg/mL，特好为1～50mg/mL。
本发明的PC-SOD组合物可作为医药品基质使用，通过添加各种添加剂、稀释等操作可制成制剂。
作为剂型形态，可例举注射剂(溶液、悬浊液、乳浊液、使用时再溶解的固体制剂等)、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、溶液剂、脂质体制剂、凝胶剂、外用散剂、喷雾剂、吸入散剂和栓剂等。
给药方法可采用注射(肌肉内、皮下、皮内、静脉内等)、口服、吸入等给药方法。给药量根据制剂的调制方法、剂型、疾病的种类、该制剂的给药方法、给药形态、使用目的、患者的体重等分别设定，例如成人1天0.5～200mg。
实施例以下，对本发明的实施例进行说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。
PC-SOD组合物的制备例在20L烧瓶中加入注射用蒸馏水(大塚制药株式会社制，商品名大琢蒸馏水，下同)(9000mL)，再依次添加硼酸(27.7g)、NaOH(3.6g)和KCl(33.7g)，溶解。然后，添加SOD水溶液(100g，SOD浓度113.6mg/mL)，以210rpm搅拌的同时，在层析室(chromato-chamber)内以33mL/分钟的速度滴加温度为8℃的异丙醇(2000mL)，调制SOD溶液。
将按照日本专利第3070980号公报记载的方法制得的下述卵磷脂衍生物(15.7g)溶于异丙醇(500mL)。然后，用疏水性滤器过滤除去不溶物。在滤液中添加异丙醇，使总容量达到8000mL，制成卵磷脂衍生物溶液。溶液温度为8℃。接着，以66mL/分钟的速度在前述SOD溶液中滴加该卵磷脂衍生物溶液(8000mL)，将于210rpm搅拌4小时而得的溶液作为反应液。
使反应液全部承载于填入了用硼酸缓冲液(50mmol/L，pH8.5±0.2)和甲醇的1∶1(容量比)混合溶液预先进行了平衡化处理的离子交换树脂(Cellulofinesf A-500)的柱。利用前述混合溶液溶解析出未吸附物质，获得含有N-羟基琥珀酰亚胺、1H-四唑和二环己基碳二亚胺的部分。
然后，采用溶有NaCl的50mmol/L硼酸缓冲液(pH8.5±0.2，NaCl浓度＝25mmol/L)和甲醇的1∶1(容量比)洗脱溶剂，使未修饰的SOD溶解析出。
接着，采用溶有NaCl的50mmol/L硼酸缓冲液(pH8.5±0.2，NaCl浓度＝200mmol/L)和甲醇的1∶1(容量比)洗脱溶剂，将溶解析出的部分作为PC-SOD组合物部分。
通过对PC-SOD组合物部分进行超滤，除去盐类和甲醇，用注射用蒸馏水置换，为了调整浓度而进行了浓缩。超滤膜采用ミリポア公司的PLGC0005(区分分子量10000，膜面积0.5cm2)。在超滤透过侧的电导率变得与注射用蒸馏水的电导率相同时结束过滤操作，再将溶液中的PC-SOD浓度调整为约40mg/mL，获得PC-SOD组合物的水性溶液(Lot.001)。到此为止的操作都在温度保持为4℃的层析室内边测液温边实施。
利用分离用HPLC，分离出与PC-SOD组合物中的PC-SOD的各峰对应的部分。HPLC的柱采用Phenyl 5PW-RP(75mm×4.6mm，东ソ一株式会社制)，作为流动相，由0.1％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液及0.075％三氟乙酸和90％乙腈的水溶液形成浓度梯度，以0.8mL/分钟的速度流动。检测器采用UV检测器(波长220nm)，柱温为室温。
对所得部分进行MALDI TOF-MS分析，测定PC-SOD的分子量和链段。求出与1分子的PC-SOD结合的卵磷脂衍生物的结合数(m)、与各结合数对应的PC-SOD的比例(摩尔％)、m的平均值及每个PC-SOD二聚体的m的平均值，结果示于下表1。
水性溶液(Lot.001)所含的PC-SOD结合了1～4分子的卵磷脂衍生物，m的平均值为2。
采用与例1同样的操作，获得PC-SOD组合物的水性溶液(Lot.002及003)。求出各水性溶液中的与1分子PC-SOD结合的卵磷脂衍生物的结合数(m)、与各结合数对应的PC-SOD的比例(摩尔％)、m的平均值及每个PC-SOD二聚体的m的平均值，结果汇总示于下表1。
表1 [例4]利用HPLC的纯度试验例(其1)在例1制得的水性溶液(Lot.001，500μL)中加入注射用蒸馏水，在PC-SOD的浓度达到30mg/mL的溶液(500μL)中加入注射用蒸馏水(2500μL)，获得分析用试样。对分析用试样进行HPLC分析的结果是，相对于PC-SOD总量的PC-SOD(A)的比例为96.7％(单位为色谱图的面积％)。
HPLC分析中，柱采用YMC A-502S-5 120A CN(150mm×4.6mm，YMC公司制)，作为流动相，由0.1％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液及0.075％三氟乙酸和90％乙腈的水溶液形成浓度梯度，以0.8mL/分钟的速度流动。检测器采用UV检测器(波长220nm)，柱温为室温。
利用HPLC的纯度试验例(其2)对于按照与例1同样的方法获得的含PC-SOD组合物的水性溶液(Lot.005)，实施与例4同样的HPLC测定，其结果是，相对于PC-SOD总量的PC-SOD(A)的比例为97.3％(单位为色谱图的面积％)。
利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的纯度测定例用水稀释例1制得的水性溶液(Lot.001，500μL)，在浓度达到30mg/mL的溶液(100μL)中加入水(2900μL)，形成试样溶液。
此外，将在试样溶液(100μL)中加入了水(900μL)而形成的溶液作为比较试样溶液。
在试样溶液及比较试样溶液各20μL中加入试样缓冲液(8μL)，于95℃加热3分钟。该试样缓冲液可按照以下步骤制得。即，将甘油(10g)、十二烷基硫酸钠(2g)、溴酚蓝(100mg)溶于Tris-HCl缓冲液(50mmol/L)，形成100mL溶液，再从该溶液中取出95μL，添加2-巯基乙醇(5μL)调制而得上述试样缓冲液。
对经过前述处理的试样溶液及比较试样溶液各4μL实施电泳。电泳结束后，马上将凝胶移入染色室实施染色。染色结束后，在保护液中浸渍30分钟，再将凝胶干燥。在甘油(20mL)中加水形成500mL的溶液，即为保护液。
对试样溶液的主谱带以外的谱带的大小和比较试样溶液的主谱带的大小进行比较，其结果是，包含于PC-SOD组合物的PC-SOD(A)的比例为90％(单位为色谱图的面积％)。
单位活性值的测定例采用细胞色素C法测定单位活性值。测定方法可按照Y.Oyanagi(SOD和活性酶调节剂，p.95(1989))、J.M.McCord(J.Biol.Chem.，Vol.224，p.6049(1969))及K.Asada(Agr.Biol.Chem.，Vol.38，p.471(1974))等的文献记载的方法实施。将单位活性值在4500～5500范围内的来自人的SOD作为标准品使用。
在前述例获得的PC-SOD组合物的浓度不同的试样中加入黄嘌呤氧化酶溶液，测定对紫外光(550nm)的吸光度。由浓度和吸光度的数据，利用最小二乘方法获得校正曲线，由每1分钟的吸光度增加率求得试样的单位活性值，其结果是，Lot.001中的PC-SOD组合物的单位活性值(U/mg-SOD)为3400。单位活性值的单位“U/mg-SOD”表示相对于SOD的总量(1mg)的值。
脂肪酸的定量例将棕榈酸(256mg)溶于乙醇形成20mL溶液，将该20mL溶液作为50mmol/L标准原液。用乙醇稀释该标准原液，分别调制出0.1mmol/L、0.05mmol/L及0.01mmol/L的棕榈酸标准试样。此外，将(棕榈酸的称量值)/(棕榈酸分子量＝256.43)值作为因子(FP)。
另外，将十七烷酸(27mg)溶于乙醇形成200mL溶液，将该200mL溶液作为0.5mmol/L内标溶液。
在棕榈酸标准试样(各100μL)、例1获得的水性溶液(Lot.001)、通过与例1同样的方法获得的水性溶液(Lot.005，Lot.008)(100μL)中分别加入前述内标溶液(100μL)。采用乙醇(100μL)作为空白。
在各溶液中加入由A液～C液形成的长链·短链脂肪酸标记化试剂(YMC公司制)的A液及B液，在60℃的恒温槽中搅拌20分钟。再加入C液(200μL)，在60℃的恒温槽中搅拌15分钟，将所得溶液作为HPLC测定试样。
HPLC的测定中，柱采用YMC A-512S-5 120A CN(150mm×6.0mm，YMC公司制)。流动相采用0.01％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液，使0.01％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液的浓度发生变化的同时以1mL/分钟的速度流动。检测器采用UV检测器(波长230nm)，柱温为室温。
由所得的HPLC色谱图求出棕榈酸的面积％，再利用内标溶液的测定值进行换算，求得棕榈酸含量。Lot.001的相对于PC-SOD总量的棕榈酸浓度为0.074nmol/mg，Lot.005的该浓度为0.094nmol/mg，Lot.008的该浓度为0.067nmol/mg。
产业上利用的可能性本发明的PC-SOD组合物是酶活性的稳定性和在生物体内的稳定性良好、也易于制剂化的优良组合物。因此，可有效地用于抗风湿药物、自身免疫性疾病治疗剂等各种治疗剂。
这里，引用2004年10月12日提出申请的日本专利申请2004-297519号的说明书、权利要求书及摘要的全部内容作为本发明的说明书的揭示。
权利要求
1.卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，包含铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶的1个以上的氨基被下述通式(I) 表示的卵磷脂残基取代的卵磷脂化超氧化物歧化酶，该卵磷脂化超氧化物歧化酶以m个前述氨基被前述卵磷脂残基取代的卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)为主成分，其中，m为1～4的整数，m的平均值为1.5～2.4，该卵磷脂化的超氧化物歧化酶(A)由25～40摩尔％m＝1的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a1)、35～50摩尔％m＝2的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a2)、10～20摩尔％m＝3的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a3)和5～15摩尔％m＝4的卵磷脂化超氧化物歧化酶(a4)形成，通式(I)中的R为碳数8～30的烷基，n为2～10的整数。
2.如权利要求1所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，含有超氧化物歧化酶的5个以上的氨基被前述通式(I)表示的卵磷脂残基取代的卵磷脂化超氧化物歧化酶(B)。
3.如权利要求1或2所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，利用高效液相色谱法测定的卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)的比例相对于卵磷脂化超氧化物歧化酶的总量在85％以上，其单位为色谱图的面积％。
4.如权利要求1～3中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)的比例相对于卵磷脂化超氧化物歧化酶的总量在80％以上，其单位为色谱图的面积％。
5.如权利要求1～4中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，利用细胞色素C法测定的卵磷脂化超氧化物歧化酶总量每1mg的单位活性值在2000单位以上。
6.如权利要求1～5中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，卵磷脂化超氧化物歧化酶总量每1mg中含有0.01～0.15nmol的下述通式(II)RCOOH……(II)表示的脂肪酸，式中，R为碳数8～30的烷基。
7.如权利要求1～6中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)以2分子m相同或不同的卵磷脂化超氧化物歧化酶(A)缔合的二聚体的形式被包含。
8.卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，实施相对于1摩尔的下述通式(III) 表示的卵磷脂衍生物，使0.05～0.4倍摩尔的铜及/或锌配位的、111位半胱氨酸的巯基被羟乙基硫化的来自人的超氧化物歧化酶与其反应，获得未精制的卵磷脂化超氧化物歧化酶的卵磷脂化工序后，通过利用离子交换柱色谱法对该未精制的卵磷脂化超氧化物歧化酶进行精制的精制工序，制造权利要求1～7中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物，通式(III)中，R为碳数8～30的烷基，Z为羟基或从形成活性酯的基团除去了羰基而得的基团，n为2～10的整数。
9.如权利要求8所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，使卵磷脂化工序所得的未精制的卵磷脂化超氧化物歧化酶吸附于离子交换树脂后，采用下述溶剂(A)使未反应的卵磷脂化超氧化物歧化酶溶解析出，再采用下述溶剂(B)使权利要求1～7中任一项所述的卵磷脂化超氧化物歧化酶组合物溶解析出，籍此实施精制工序；溶剂(A)由无机盐浓度为5～100mM的pH6～9的缓冲液(a1)和甲醇形成，相对于溶剂(A)的该缓冲液(a1)量为20～90容量％，甲醇量为10～80容量％的溶剂；溶剂(B)由无机盐浓度为150～400mM的pH6～9的缓冲液(b1)和甲醇形成，相对于溶剂(B)的该缓冲液(b1)量为20～90容量％，甲醇量为10～80容量％的溶剂。
全文摘要
本发明提供可作为医药品基质使用的卵磷脂化超氧化物歧化酶(PC－SOD)组合物及其制备方法。该组合物包含特定SOD的1个以上的氨基被上述通式(I)，表示的卵磷脂残基取代的PC－SOD，该PC－SOD以m个前述氨基被前述卵磷脂残基取代的PC－SOD(A)为主成分，其中，m为1～4的整数，且m的平均值为1.5～2.4，该PC－SOD(A)由m＝1的PC－SOD(a1)、m＝2的PC－SOD(a2)、m＝3的PC－SOD(a3)和m＝4的PC－SOD(a4)形成。
文档编号A61P9/10GK101035891SQ200580034389
公开日2007年9月12日 申请日期2005年10月5日 优先权日2004年10月12日
发明者野本英男, 中山利明, 村桥麻纪, 森泽义富 申请人:日本株式会社Ltt生物医药
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