固相肽合成的制作方法
专利名称：固相肽合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备式I肽衍生物的方法， 其中Tos意为对甲苯磺酰基。
本发明的方法基于固相合成。在固相合成过程中，当将原料与惰性固体载体键合时氨基酸就装配(即偶联)成了具有任意所需序列的肽。反应物以溶液形式加入，因为原料键合于固体上，所以源自原料的任何产物也仍然键合于固体上。一旦所需序列在载体上连接在一起，就将肽从载体上分离(即裂解)。
根据本发明制备的肽衍生物适合于定量检测EC 3.4.4类的某些蛋白水解酶，尤其是定量检测凝血酶(EC是国际生化联合会的″酶委员会″的缩写)。
这些相关肽的合成方法已经被描述，例如在美国专利第4′428′874号(1984)，第4′070′245号(1978)和第4′629′695号(1986)中。这些方法是基于使用不同氨基酸衍生物的溶液相合成。
然而，本领域描述的方法不能满足关于所需异构体的旋光纯度和关于纯化各种肽所需的努力的需求。
因此，本发明的目的是提供更加经济的、以良好的产率和高旋光纯度制备式I的肽衍生物的方法。
该目的已经采用权利要求1的本发明方法得以实现。
该方法包括
a)在偶联剂/添加剂系统的存在下，在固相载体上，将氨基酸精氨酸、脯氨酸和甘氨酸依次偶联，b)使甘氨酸部分的N-α-氨基进行甲苯磺酰化，c)从固相载体上裂解被甲苯磺酰化的肽或其氨基侧链被保护的衍生物，d)在偶联剂/添加剂系统的存在下，使式II的肽中间体或其氨基侧链被保护的衍生物
与式III的苯胺反应，R-NH2III其中R意为对氨基苯基，且其中一个氨基被氨基保护基保护。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中
应当进一步理解，氨基酸精氨酸和脯氨酸可以以它们的L-构型或它们的D-构型、作为外消旋物或以它们的异构体的各种混合物使用。优选氨基酸以它们的L-构型使用。
本发明步骤a)中的依次偶联包括在第一步中，将优选被保护的精氨酸附着到固相载体上。
精氨酸的α-氨基可以通过本领域技术人员已知的常规氨基保护基保护。Fmoc是精氨酸的优选的α-氨基保护基。
侧链，即精氨酸分子的胍部分，通常用本领域技术人员已知的精氨酸侧链保护基保护。优选的精氨酸侧链保护基是Pmc或Pbf，更优选Pbf。
原则上，已知对于固相肽合成有用的每一固相载体都可以用于本发明的合成，如在PeptidesChemistry and Biology，N.Sewald，H.-D.Jakubke，Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，2002和Fmoc-Solid Phase PeptideSynthesis-A practical approach，W.C.Chan，P.D.White，Oxford大学出版公司，纽约，2000中所述。
已发现2-氯三苯甲基氯-聚苯乙烯树脂(CTC-树脂)最适合作为本发明肽合成的固相载体。CTC树脂是商业上可获得的，例如获自MerckBioscience。
被保护的精氨酸优选溶于惰性溶剂如二氯甲烷中。
通常存在叔胺，例如Et3N、DIEA或均三甲基吡啶(sym-collidine)，优选DIEA或均三甲基吡啶。
对固相载体的附着通常在室温下进行。
依照本领域技术人员已知的技术进行装载树脂的后处理，包括用有机溶剂清洗树脂、过滤和最终在适当温度下干燥。
在第一个步骤的优选实施方案中，制备装载Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CTC-树脂。
在随后的步骤中，完成与被保护的脯氨酸的偶联，然后完成与被保护的甘氨酸的偶联。
在偶联可以发生前，精氨酸的α-氨基必须方便地被仲胺如吗啉、DBU或哌啶脱保护，优选被哌啶在适宜溶剂如DMF或NMP、优选NMP中的5-20％溶液脱保护。
脯氨酸和甘氨酸的α-氨基可以被本领域技术人员已知的常规氨基保护基保护。Fmoc是脯氨酸和甘氨酸的优选的α-氨基保护基。
脯氨酸可以以选自PG-Pro-OPfp、PG-Pro-OSu和PG-Pro-OBt的活化衍生物的形式应用，或者以PG-Pro-OH形式的未活化衍生物应用，其中PG意为氨基保护基。
优选脯氨酸以Fmoc-(L)-Pro-OH形式应用。
甘氨酸可以以PG-Gly-OPfp和PG-Gly-OSu的活化衍生物的形式应用，或作为PG-Gly-OH形式的未活化衍生物应用，其中PG意为氨基保护基。
优选甘氨酸以Fmoc-Gly-OH形式应用。
根据本发明，氨基酸的偶联采用选自DCC/HOBt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、HATU/HOAt、DEPBT/HOOBt、PyBoP/Cl-HOBt的偶联剂/添加剂系统进行。
优选的偶联剂/添加剂系统是DEPBT/HOOBt或HBTU/HOBt，其中HBTU/HOBt是最优选的。
偶联各自通常在叔胺如Et3N、DIEA或均三甲基吡啶的存在下进行，优选在DIEA或均三甲基吡啶中于适宜溶剂如NMP中进行。
偶联反应理想地在搅拌下在0℃到40℃温度下进行。
在与甘氨酸偶联前脯氨酸的脱保护和甘氨酸的最终脱保护可以方便地采用仲胺如吗啉、DBU或哌啶进行，优选采用哌啶在适宜溶剂如DMF或NMP、优选NMP中的5-20％溶液进行。
在该偶联反应优选的实施方案中，制备装载H2N-Gly-(L)-Pro-(D/L)Arg-(Pbf)-OH的CTC-树脂。
按照本发明方法的步骤b)进行的甘氨酸部分的N-α-氨基的甲苯磺酰化通常在叔胺如Et3N、DIEA或均三甲基吡啶的存在下、优选在DIEA中采用4-甲苯磺酰氯进行。
甲苯磺酰化通常在惰性溶剂如二氯甲烷的存在下在0℃到40℃的温度下完成。
从固相载体上的裂解可以通过本领域技术人员已知的方法完成。
优选所需的肽Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH通过用稀释的酸性溶液、优选用三氟乙酸在二氯甲烷中的0.1-5％溶液处理而从CTC-树脂上裂解下来。
如此获得的肽可用本领域已知的方法、优选使用液相色谱纯化技术进行进一步纯化。
根据步骤d)，被甲苯磺酰化的肽衍生物与式III的苯胺在偶联剂/添加剂系统的存在下偶联，R-NH2III其中，R意为对氨基苯基，其中一个氨基被α-氨基保护基保护。
偶联在选自DCC/HOBt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、HATU/HOAt、PyBOP/Cl-HOBt、DEPBT/HOOBt的偶联剂/添加剂系统的存在下、优选采用DEPBT/HOOBt在叔胺如Et3N、DIEA或均三甲基吡啶的存在下、优选在DIEA中进行。
反应优选在适宜溶剂如DMF中、在0℃到40℃的温度下、在搅拌下进行。
反应混合物的后处理遵循本领域技术人员的一般知识，可包括用烯酸如稀HCl进行萃取。
如此获得的肽可用本领域已知的方法、优选通过液相色谱纯化技术进行进一步纯化。
采用本发明的方法，可以以直至85％的极佳产率和直至96％的旋光纯度获得所需的肽异构体。
实施例1Fmoc-(L)-Arg(Pbf)-OH向CTC-树脂的附着将500g(0.77mol)Fmoc-(L)-Arg(Pbf)(Merck Biosciences Novobiochem)溶于5.5升二氯甲烷和812ml(4.77mol)DIEA的搅拌着的溶液中。加入1kgCTC-树脂(Merck Biosciences GmbH，100-200目，1％DVB，装载量0.8-1.6mmol/g树脂)，搅拌溶液约2分钟。将混合物在室温下静置3小时，分别在1小时后和2小时后搅拌混合物2分钟。3小时以后，将混合物冷却至5-10℃，加入300ml甲醇。在该温度下将混悬液静置1小时。然后在抽滤器上过滤混合物。
然后将树脂混悬在二氯甲烷/甲醇/DIEA(80∶15∶5)溶液中，搅拌5分钟，并静置30分钟。过滤后将树脂用5升DMF洗涤4次，用2.5升异丙醇洗涤4次，用2.5升异己烷洗涤3次。树脂必须过滤，树脂保持湿润。然后在30℃下，在真空干燥箱中干燥树脂40小时。
用HPLC进行装载分析0.405mmol/g Fmoc-Arg(Pbf)-CTCHPLC法柱Keystone Beta Basic C18；流动相AH2O+0.1％TFA，流动相B乙腈+0.075％TFA，T＝30℃，t＝22分钟，Rt＝12.2分钟。
实施例2Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH
向肽反应器中装入5g Fmoc-(L)-Arg(Pbf)-CTC-树脂(装载量0.405mmol/g；2.075mmol)。加入87.5ml二氯甲烷。当树脂在二氯甲烷中溶胀了至少30分钟时，溶剂变为NMP。这样，用87.5ml NMP(3次)洗涤树脂已经完成了。在30分钟内在哌啶在NMP中的5％溶液中进行脱保护。随后，用62.5ml NMP洗涤树脂6次。
通过制备1.05g(3.11mmol)Fmoc-(L)-Pro-OH、0.477g(3.11mmol)HOBt和1.09ml(6.22mmol)DIEA在8.75ml NMP中的溶液，并在5分钟后加入1.18g(3.11mmol)HBTU在7.5ml NMP中的溶液，进行偶联操作。经过10分钟预活化后，将所述溶液加入树脂中，并在30℃下小心搅拌混悬液2小时。偶联之后用NMP充分洗涤。
在30分钟内，在哌啶在NMP中的5％溶液中进行氨基的脱保护。随后用NMP充分洗涤树脂。通过制备0.925g(3.11mmol)Fmoc-Gly-OH溶液进行偶联操作。
5分钟后，0.477g(3.11mmol)HOBt和1.09ml(6.22mmol)7.5ml NMP。经过10分钟预活化以后，将所述溶液加入树脂中，在30℃下小心搅拌混悬液2小时。偶联之后用NMP充分洗涤。
在30分钟内再次在哌啶在NMP中的5％溶液中进行氨基的最后一次脱保护，接着用NMP和用二氯甲烷(3次)充分洗涤。然后将树脂混悬在75ml二氯甲烷中，加入0.475g(2.49mmol)4-甲苯磺酰氯(Tos-Cl)和0.43ml(2,49mmol)DIEA。用1％TFA的DCM溶液进行肽的最终裂解。用甲苯稀释滤液，并真空蒸发。
得到1.7g肽粗品(Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH)。
HPLC柱Keystone Beta Basic C18；流动相AH2O+0.1％TFA，流动相B乙腈+0.1％TFA，T＝30℃，t＝34min，Rt＝13.9分钟，A％89.6％，NMR1H，13C相应ESI-MSMH+735.3，MNa+757.3；[M-H]-733.3
实施例3N-(Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf))-p-Boc-氨基-苯胺 在反应器中装入0.61g(0.83mmol)Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH在9ml DMF中的溶液，并加入0.135g(0.83mmol)HOOBt和0.29ml(1.66mmol)DIEA。搅拌预活化的混合物5分钟，然后加入0.248g(0.83mmol)DEPBT和0.156g(0.75mmol)N-Boc-对苯二胺。室温搅拌5小时以后，真空蒸馏溶剂。用HCl水溶液萃取剩余物。用硅石进行色谱纯化以后，得到0.39g(85％)产物。
HPLC，方法1柱Keystone Beta Basic C18；150×4.6mm；梯度法流动相AH2O+0.1％TFA，流动相B乙腈+0.1％TFA，T＝30℃，t＝34分钟，Rt＝16.11分钟，A％91.13％，HPLC，方法2柱Chirobiotic T；10m，250×4.6mm；等浓度法流动相((乙腈∶MeOH；1∶4)+0.2％Et3N+0.2％AcOH)，T＝30℃，t＝30min，Rt＝4.53分钟，A％95.4％，NMR1H和13C相应ESI-MSMH+925.2，MNa+947.2，[M-H]-923.权利要求
1.制备式I的肽衍生物或其盐的方法， 其中Tos意为对甲苯磺酰基，该方法包括a)在偶联剂/添加剂系统的存在下，在固相载体上，将氨基酸精氨酸、脯氨酸和甘氨酸依次偶联，b)使甘氨酸部分的N-α-氨基进行甲苯磺酰化，c)从固相载体上裂解被甲苯磺酰化的肽或其氨基侧链被保护的衍生物，d)在偶联剂/添加剂系统的存在下，使式II的肽中间体或其氨基侧链被保护的衍生物 与式III的苯胺反应，R-NH2III其中R意为对氨基苯基，且其中一个氨基被氨基保护基保护。
2.权利要求1的方法，其特征在于固相载体是2-氯三苯甲基氯-聚苯乙烯树脂。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于精氨酸的侧链被Pbf或Pmc保护基所保护。
4.根据权利要求1到3的方法，其特征在于脯氨酸以选自PG-Pro-OPfp、PG-Pro-OSu和PG-Pro-OBt的活化衍生物的形式应用，或者以未活化的PG-Pro-OH形式应用，其中PG意为氨基保护基。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于脯氨酸以Fmoc-(L)-Pro-OH的形式应用。
6.根据权利要求1到4的方法，其特征在于甘氨酸以选自PG-Gly-OPfp、PG-Gly-OSu和PG-Gly-OBt的活化衍生物的形式应用，或者以未活化的PG-Gly-OH形式应用，其中PG意为氨基保护基。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于甘氨酸以Fmoc-Gly-OH形式应用。
8.根据权利要求5和7的方法，其特征在于Fmoc保护基通过用哌啶处理来除去。
9.根据权利要求1到8的方法，其特征在于在步骤a)中用于依次偶联氨基酸的偶联剂/添加剂系统选自DCC/HOBt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、HATU/HOAt、DEPBT/HOOBt、PyBoP/Cl-HOBt。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于偶联剂/添加剂系统是HBTU/HOBt。
11.根据权利要求1到10的方法，其特征在于用于式II肽中间体与式III苯胺的反应的偶联剂/添加剂系统选自DCC/HOBt、HATU/HOAt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、PyBOP/Cl-HOBt和DEPBT/HOOBt。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于偶联剂/添加剂系统是DEPBT/HOOBt。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于甲苯磺酰化采用4-甲苯磺酰氯进行。
14.根据权利要求1的方法，其特征在于从固相载体的裂解采用三氟乙酸完成。
15.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤d)中与式III苯胺的反应采用Tos-Gly-Pro-Arg(Pbf)-OH作为式II肽中间体的氨基侧链被保护的衍生物进行。
16.可通过权利要求1到15的方法获得的式I的肽衍生物或其盐。
17.根据权利要求1到15的方法制备的式I肽衍生物在定量检测蛋白水解酶中的用途。
18.根据权利要求17的用途，用于定量检测毛细血管血中的凝血酶。
19.如上所定义的发明。
全文摘要
本发明包括通过在CTC树脂上的固相合成方式制备式(I)肽衍生物或其盐的方法。
文档编号A61K38/06GK101039954SQ200580034655
公开日2007年9月19日 申请日期2005年10月4日 优先权日2004年10月12日
发明者T·斯克里普柯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
技术领域：
本发明涉及制备式I肽衍生物的方法， 其中Tos意为对甲苯磺酰基。
本发明的方法基于固相合成。在固相合成过程中，当将原料与惰性固体载体键合时氨基酸就装配(即偶联)成了具有任意所需序列的肽。反应物以溶液形式加入，因为原料键合于固体上，所以源自原料的任何产物也仍然键合于固体上。一旦所需序列在载体上连接在一起，就将肽从载体上分离(即裂解)。
根据本发明制备的肽衍生物适合于定量检测EC 3.4.4类的某些蛋白水解酶，尤其是定量检测凝血酶(EC是国际生化联合会的″酶委员会″的缩写)。
这些相关肽的合成方法已经被描述，例如在美国专利第4′428′874号(1984)，第4′070′245号(1978)和第4′629′695号(1986)中。这些方法是基于使用不同氨基酸衍生物的溶液相合成。
然而，本领域描述的方法不能满足关于所需异构体的旋光纯度和关于纯化各种肽所需的努力的需求。
因此，本发明的目的是提供更加经济的、以良好的产率和高旋光纯度制备式I的肽衍生物的方法。
该目的已经采用权利要求1的本发明方法得以实现。
该方法包括
a)在偶联剂/添加剂系统的存在下，在固相载体上，将氨基酸精氨酸、脯氨酸和甘氨酸依次偶联，b)使甘氨酸部分的N-α-氨基进行甲苯磺酰化，c)从固相载体上裂解被甲苯磺酰化的肽或其氨基侧链被保护的衍生物，d)在偶联剂/添加剂系统的存在下，使式II的肽中间体或其氨基侧链被保护的衍生物
与式III的苯胺反应，R-NH2III其中R意为对氨基苯基，且其中一个氨基被氨基保护基保护。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中
应当进一步理解，氨基酸精氨酸和脯氨酸可以以它们的L-构型或它们的D-构型、作为外消旋物或以它们的异构体的各种混合物使用。优选氨基酸以它们的L-构型使用。
本发明步骤a)中的依次偶联包括在第一步中，将优选被保护的精氨酸附着到固相载体上。
精氨酸的α-氨基可以通过本领域技术人员已知的常规氨基保护基保护。Fmoc是精氨酸的优选的α-氨基保护基。
侧链，即精氨酸分子的胍部分，通常用本领域技术人员已知的精氨酸侧链保护基保护。优选的精氨酸侧链保护基是Pmc或Pbf，更优选Pbf。
原则上，已知对于固相肽合成有用的每一固相载体都可以用于本发明的合成，如在PeptidesChemistry and Biology，N.Sewald，H.-D.Jakubke，Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，2002和Fmoc-Solid Phase PeptideSynthesis-A practical approach，W.C.Chan，P.D.White，Oxford大学出版公司，纽约，2000中所述。
已发现2-氯三苯甲基氯-聚苯乙烯树脂(CTC-树脂)最适合作为本发明肽合成的固相载体。CTC树脂是商业上可获得的，例如获自MerckBioscience。
被保护的精氨酸优选溶于惰性溶剂如二氯甲烷中。
通常存在叔胺，例如Et3N、DIEA或均三甲基吡啶(sym-collidine)，优选DIEA或均三甲基吡啶。
对固相载体的附着通常在室温下进行。
依照本领域技术人员已知的技术进行装载树脂的后处理，包括用有机溶剂清洗树脂、过滤和最终在适当温度下干燥。
在第一个步骤的优选实施方案中，制备装载Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CTC-树脂。
在随后的步骤中，完成与被保护的脯氨酸的偶联，然后完成与被保护的甘氨酸的偶联。
在偶联可以发生前，精氨酸的α-氨基必须方便地被仲胺如吗啉、DBU或哌啶脱保护，优选被哌啶在适宜溶剂如DMF或NMP、优选NMP中的5-20％溶液脱保护。
脯氨酸和甘氨酸的α-氨基可以被本领域技术人员已知的常规氨基保护基保护。Fmoc是脯氨酸和甘氨酸的优选的α-氨基保护基。
脯氨酸可以以选自PG-Pro-OPfp、PG-Pro-OSu和PG-Pro-OBt的活化衍生物的形式应用，或者以PG-Pro-OH形式的未活化衍生物应用，其中PG意为氨基保护基。
优选脯氨酸以Fmoc-(L)-Pro-OH形式应用。
甘氨酸可以以PG-Gly-OPfp和PG-Gly-OSu的活化衍生物的形式应用，或作为PG-Gly-OH形式的未活化衍生物应用，其中PG意为氨基保护基。
优选甘氨酸以Fmoc-Gly-OH形式应用。
根据本发明，氨基酸的偶联采用选自DCC/HOBt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、HATU/HOAt、DEPBT/HOOBt、PyBoP/Cl-HOBt的偶联剂/添加剂系统进行。
优选的偶联剂/添加剂系统是DEPBT/HOOBt或HBTU/HOBt，其中HBTU/HOBt是最优选的。
偶联各自通常在叔胺如Et3N、DIEA或均三甲基吡啶的存在下进行，优选在DIEA或均三甲基吡啶中于适宜溶剂如NMP中进行。
偶联反应理想地在搅拌下在0℃到40℃温度下进行。
在与甘氨酸偶联前脯氨酸的脱保护和甘氨酸的最终脱保护可以方便地采用仲胺如吗啉、DBU或哌啶进行，优选采用哌啶在适宜溶剂如DMF或NMP、优选NMP中的5-20％溶液进行。
在该偶联反应优选的实施方案中，制备装载H2N-Gly-(L)-Pro-(D/L)Arg-(Pbf)-OH的CTC-树脂。
按照本发明方法的步骤b)进行的甘氨酸部分的N-α-氨基的甲苯磺酰化通常在叔胺如Et3N、DIEA或均三甲基吡啶的存在下、优选在DIEA中采用4-甲苯磺酰氯进行。
甲苯磺酰化通常在惰性溶剂如二氯甲烷的存在下在0℃到40℃的温度下完成。
从固相载体上的裂解可以通过本领域技术人员已知的方法完成。
优选所需的肽Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH通过用稀释的酸性溶液、优选用三氟乙酸在二氯甲烷中的0.1-5％溶液处理而从CTC-树脂上裂解下来。
如此获得的肽可用本领域已知的方法、优选使用液相色谱纯化技术进行进一步纯化。
根据步骤d)，被甲苯磺酰化的肽衍生物与式III的苯胺在偶联剂/添加剂系统的存在下偶联，R-NH2III其中，R意为对氨基苯基，其中一个氨基被α-氨基保护基保护。
偶联在选自DCC/HOBt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、HATU/HOAt、PyBOP/Cl-HOBt、DEPBT/HOOBt的偶联剂/添加剂系统的存在下、优选采用DEPBT/HOOBt在叔胺如Et3N、DIEA或均三甲基吡啶的存在下、优选在DIEA中进行。
反应优选在适宜溶剂如DMF中、在0℃到40℃的温度下、在搅拌下进行。
反应混合物的后处理遵循本领域技术人员的一般知识，可包括用烯酸如稀HCl进行萃取。
如此获得的肽可用本领域已知的方法、优选通过液相色谱纯化技术进行进一步纯化。
采用本发明的方法，可以以直至85％的极佳产率和直至96％的旋光纯度获得所需的肽异构体。
实施例1Fmoc-(L)-Arg(Pbf)-OH向CTC-树脂的附着将500g(0.77mol)Fmoc-(L)-Arg(Pbf)(Merck Biosciences Novobiochem)溶于5.5升二氯甲烷和812ml(4.77mol)DIEA的搅拌着的溶液中。加入1kgCTC-树脂(Merck Biosciences GmbH，100-200目，1％DVB，装载量0.8-1.6mmol/g树脂)，搅拌溶液约2分钟。将混合物在室温下静置3小时，分别在1小时后和2小时后搅拌混合物2分钟。3小时以后，将混合物冷却至5-10℃，加入300ml甲醇。在该温度下将混悬液静置1小时。然后在抽滤器上过滤混合物。
然后将树脂混悬在二氯甲烷/甲醇/DIEA(80∶15∶5)溶液中，搅拌5分钟，并静置30分钟。过滤后将树脂用5升DMF洗涤4次，用2.5升异丙醇洗涤4次，用2.5升异己烷洗涤3次。树脂必须过滤，树脂保持湿润。然后在30℃下，在真空干燥箱中干燥树脂40小时。
用HPLC进行装载分析0.405mmol/g Fmoc-Arg(Pbf)-CTCHPLC法柱Keystone Beta Basic C18；流动相AH2O+0.1％TFA，流动相B乙腈+0.075％TFA，T＝30℃，t＝22分钟，Rt＝12.2分钟。
实施例2Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH
向肽反应器中装入5g Fmoc-(L)-Arg(Pbf)-CTC-树脂(装载量0.405mmol/g；2.075mmol)。加入87.5ml二氯甲烷。当树脂在二氯甲烷中溶胀了至少30分钟时，溶剂变为NMP。这样，用87.5ml NMP(3次)洗涤树脂已经完成了。在30分钟内在哌啶在NMP中的5％溶液中进行脱保护。随后，用62.5ml NMP洗涤树脂6次。
通过制备1.05g(3.11mmol)Fmoc-(L)-Pro-OH、0.477g(3.11mmol)HOBt和1.09ml(6.22mmol)DIEA在8.75ml NMP中的溶液，并在5分钟后加入1.18g(3.11mmol)HBTU在7.5ml NMP中的溶液，进行偶联操作。经过10分钟预活化后，将所述溶液加入树脂中，并在30℃下小心搅拌混悬液2小时。偶联之后用NMP充分洗涤。
在30分钟内，在哌啶在NMP中的5％溶液中进行氨基的脱保护。随后用NMP充分洗涤树脂。通过制备0.925g(3.11mmol)Fmoc-Gly-OH溶液进行偶联操作。
5分钟后，0.477g(3.11mmol)HOBt和1.09ml(6.22mmol)7.5ml NMP。经过10分钟预活化以后，将所述溶液加入树脂中，在30℃下小心搅拌混悬液2小时。偶联之后用NMP充分洗涤。
在30分钟内再次在哌啶在NMP中的5％溶液中进行氨基的最后一次脱保护，接着用NMP和用二氯甲烷(3次)充分洗涤。然后将树脂混悬在75ml二氯甲烷中，加入0.475g(2.49mmol)4-甲苯磺酰氯(Tos-Cl)和0.43ml(2,49mmol)DIEA。用1％TFA的DCM溶液进行肽的最终裂解。用甲苯稀释滤液，并真空蒸发。
得到1.7g肽粗品(Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH)。
HPLC柱Keystone Beta Basic C18；流动相AH2O+0.1％TFA，流动相B乙腈+0.1％TFA，T＝30℃，t＝34min，Rt＝13.9分钟，A％89.6％，NMR1H，13C相应ESI-MSMH+735.3，MNa+757.3；[M-H]-733.3
实施例3N-(Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf))-p-Boc-氨基-苯胺 在反应器中装入0.61g(0.83mmol)Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH在9ml DMF中的溶液，并加入0.135g(0.83mmol)HOOBt和0.29ml(1.66mmol)DIEA。搅拌预活化的混合物5分钟，然后加入0.248g(0.83mmol)DEPBT和0.156g(0.75mmol)N-Boc-对苯二胺。室温搅拌5小时以后，真空蒸馏溶剂。用HCl水溶液萃取剩余物。用硅石进行色谱纯化以后，得到0.39g(85％)产物。
HPLC，方法1柱Keystone Beta Basic C18；150×4.6mm；梯度法流动相AH2O+0.1％TFA，流动相B乙腈+0.1％TFA，T＝30℃，t＝34分钟，Rt＝16.11分钟，A％91.13％，HPLC，方法2柱Chirobiotic T；10m，250×4.6mm；等浓度法流动相((乙腈∶MeOH；1∶4)+0.2％Et3N+0.2％AcOH)，T＝30℃，t＝30min，Rt＝4.53分钟，A％95.4％，NMR1H和13C相应ESI-MSMH+925.2，MNa+947.2，[M-H]-923.权利要求
1.制备式I的肽衍生物或其盐的方法， 其中Tos意为对甲苯磺酰基，该方法包括a)在偶联剂/添加剂系统的存在下，在固相载体上，将氨基酸精氨酸、脯氨酸和甘氨酸依次偶联，b)使甘氨酸部分的N-α-氨基进行甲苯磺酰化，c)从固相载体上裂解被甲苯磺酰化的肽或其氨基侧链被保护的衍生物，d)在偶联剂/添加剂系统的存在下，使式II的肽中间体或其氨基侧链被保护的衍生物 与式III的苯胺反应，R-NH2III其中R意为对氨基苯基，且其中一个氨基被氨基保护基保护。
2.权利要求1的方法，其特征在于固相载体是2-氯三苯甲基氯-聚苯乙烯树脂。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于精氨酸的侧链被Pbf或Pmc保护基所保护。
4.根据权利要求1到3的方法，其特征在于脯氨酸以选自PG-Pro-OPfp、PG-Pro-OSu和PG-Pro-OBt的活化衍生物的形式应用，或者以未活化的PG-Pro-OH形式应用，其中PG意为氨基保护基。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于脯氨酸以Fmoc-(L)-Pro-OH的形式应用。
6.根据权利要求1到4的方法，其特征在于甘氨酸以选自PG-Gly-OPfp、PG-Gly-OSu和PG-Gly-OBt的活化衍生物的形式应用，或者以未活化的PG-Gly-OH形式应用，其中PG意为氨基保护基。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于甘氨酸以Fmoc-Gly-OH形式应用。
8.根据权利要求5和7的方法，其特征在于Fmoc保护基通过用哌啶处理来除去。
9.根据权利要求1到8的方法，其特征在于在步骤a)中用于依次偶联氨基酸的偶联剂/添加剂系统选自DCC/HOBt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、HATU/HOAt、DEPBT/HOOBt、PyBoP/Cl-HOBt。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于偶联剂/添加剂系统是HBTU/HOBt。
11.根据权利要求1到10的方法，其特征在于用于式II肽中间体与式III苯胺的反应的偶联剂/添加剂系统选自DCC/HOBt、HATU/HOAt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、PyBOP/Cl-HOBt和DEPBT/HOOBt。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于偶联剂/添加剂系统是DEPBT/HOOBt。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于甲苯磺酰化采用4-甲苯磺酰氯进行。
14.根据权利要求1的方法，其特征在于从固相载体的裂解采用三氟乙酸完成。
15.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤d)中与式III苯胺的反应采用Tos-Gly-Pro-Arg(Pbf)-OH作为式II肽中间体的氨基侧链被保护的衍生物进行。
16.可通过权利要求1到15的方法获得的式I的肽衍生物或其盐。
17.根据权利要求1到15的方法制备的式I肽衍生物在定量检测蛋白水解酶中的用途。
18.根据权利要求17的用途，用于定量检测毛细血管血中的凝血酶。
19.如上所定义的发明。
全文摘要
本发明包括通过在CTC树脂上的固相合成方式制备式(I)肽衍生物或其盐的方法。
文档编号A61K38/06GK101039954SQ200580034655
公开日2007年9月19日 申请日期2005年10月4日 优先权日2004年10月12日
发明者T·斯克里普柯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
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