细胞－蛋白抗肿瘤制剂的制作方法
专利名称：细胞－蛋白抗肿瘤制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌药物，特别是涉及一种细胞-蛋白抗肿瘤制剂。
用蛋白或将蛋白与抗体连接作为治疗癌症的药物已有一些报道，如文献(Fosberg G；FosbergM；Jaki M et al:Identification of framework residuesin a secreted recombinant antibody fragmentthat control production level and localization in Escherichia coli J.Biol.Chem.272(19):12430-12436,1997)将大肠杆菌产生的超抗原连接在5T4单克隆抗体的Fab端，用这段蛋白进行非小细胞肺癌治疗试验。还有人把葡萄球菌肠毒素A(SEA)连接到C242单克隆抗体上，用这个蛋白抗体诱导人大肠癌的肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子和细胞程序性死亡(LittonMJ,DohlstenM,lando PA et al:Antibody-targeted superantigen therapy induces tumor-infiltratinglymphocytes,excessive cytokine production,and apoptosis in human colon carcinoma Eur J.Immuno.26(1):1-9,1996)。还有报道将高聚金葡菌素使用的金葡菌肠毒素的C型(SEC)直接用蛋白治疗癌症(高聚金葡素抗肿瘤化疗引起白细胞下降的临床观察，中国肿瘤临床1998年9月)。
上述工作存在问题是1)单纯使用蛋白注射治疗癌症，抑癌率只能达到40％左右。因为约有50％的正常人体中含有抗此类蛋白的天然抗体。而且C型毒素并不是蛋白家族中有效的蛋白。2)将蛋白与抗体连接虽可防止蛋白被抗体阻断，提高了治疗癌效果，但异源性的抗体蛋白会带来免疫系统的应答反应，造成疾病。
本发明的目的是制备一种新型抗肿瘤药物，将蛋白与T细胞受体连接，在提高治疗癌症效果的同时避免引起免疫系统的应答反应所造成的疾病。
本发明目的的实现制备一种将超抗原与T细胞受体结合的物质。已知超抗原能特异性地与CD4+T受体结合，使T细胞大量活化、增殖(Marrack,P.,and J.Kapper.1990.The staphylococcalenterotoxins and their relatives.Science 248:705,White,J.,A.Herman.A.M.Pullen.Et al.1989.The VB specific superantigen staphylococcal enterotoxin B:Stimulation ofmature T cells and clonal deletion in neonatal mice.Cell 56:27)。本发明利用这一特征制备了细胞蛋白制剂即Sup-Th，并对这一制剂的肿瘤杀伤功能进行了试验。
制备的具体操作方法是用小鼠脾细胞或者人外周血淋巴细胞与超抗原共同培养1-5天，使T细胞与超抗原自然结合，收集结合物。用细胞培养基MEM洗涤去除游离抗原，细胞恢复原浓度后在无任何抗原的细胞培养基中继续培养。继续生长的细胞被认定为蛋白与TCR连接的物质，即超抗原与T细胞结合物(代号为SUP-TH)，经动物试验确定此结合物具有抗肿瘤活性，且新鲜制备的结合物和低温冻存的结合物均有抗肿瘤活性。
上述超抗原包括SEA(葡萄球菌肠毒素A)和SEB(葡萄球菌肠毒素B)，T细胞包括人外周血淋巴细胞和小鼠脾细胞。
将上述新鲜制备的或冻存的SUP-TH与适当的药物辅剂制成注射剂，其浓度为1×105-2×107细胞数/ml。
本发明提供的抗肿瘤制剂SUP-TH经实验证明，得到如下结论(1)SUP-TH能够在体内抑制肿瘤的生长，且对肿瘤的识别能力和杀伤作用比CTL和NK强，抑癌率最高可达到96％；(2)新制备的SUP-TH能抑制肿瘤的生长，抑制率最高达到96％；(3)冻存后的SUP-TH也有抑制肺癌生长的功能；(4)与单纯蛋白注射和抗体连接的超抗原注射相比，SUP-TH诱发B细胞产生抗体的可能性小，比单纯注射超抗原的效果好；(5)SUP-TH进入体内一方面防止蛋白被体内游离抗体中和，另一方面T细胞是同源性物质，无异源性大分子蛋白进入体内，因此无排斥反应，排除了异源性蛋白造成的免疫应答，减少副作用。
实施例1用人外周血淋巴细胞与超抗原SEB制备细胞一蛋白制剂a．取人外周抗凝血10ml加10ml生理盐水做对倍稀释。
b．取淋巴细胞分离液(北京原平公司购入)(比重1∶1.077)3ml加5～8ml上述抗凝血。
c．在4℃,2000rpm/20分钟离心，取中间层淋巴细胞。
d．用含2％FCS(胎牛血清，56℃灭活)的MEM培养基洗涤三次后，用含10％FCS,RPMI标准细胞培养基将细胞制成悬浮液，用胎盼兰染色细胞并记录活细胞总数。
e．SUP-TH是淋巴细胞与超抗原共同培养3天，充分洗涤去除游离抗原后的活性物质。这些物质的活性是用RPMI重新悬浮至原细胞浓度继续在37℃,5％CO2孵箱中培养至6天，用MTT染色并测定细胞增殖状况。通常细胞在无抗原刺激下不再生长，而表7的结果显示了SUP-TH在洗净游离抗原后在新鲜培养基中仍然继续生长，说明它不是单一细胞而在TCR载有超抗原的细胞-蛋白物质(Marrack,P.,and J.Kapper.1990.The staphylococcal enterotoxins andtheir relatives.Science 248:705,White,J.,A.Herman.A.M.Pullen.Et al.1989.TheVB specific superantigen staphylococcal enterotoxin B:Stimulation of mature T cellsand clonal deletion in neonatal mice.Cell 56:27)。这种物质有杀伤肿瘤作用，为SUP-TH。
f．取1×106个细胞，用抗-CD8-PE抗体和抗CD4-FITC抗体染色(Serotec公司购置的标准荧光抗体)，用流式细胞仪测定0时外周血中CD4+T细胞数量。
g．其余的细胞以5×105个细胞与不同浓度的抗原即PHA(植物血凝素)，SEA和SEB(从军事医学科学院五所购入)在37℃、5％CO2孵箱中共同培养。用MTT(四甲基偶联氮唑盐)染色(将50mgMTT溶于10mlPBS)，然后用酶联测定仪测定不同时间的细胞生长状况。并在细胞生长的最适时间内测定活性细胞亚群和在体外对肿瘤细胞的杀伤活性。(表1-7)实施例2．用小鼠脾细胞与超抗原SEA制备细胞-蛋白制剂a．取C57/B6小鼠脾脏，经无菌玻片轻轻研碎后用300目尼龙网过滤，用10％FCS RPMI培养基5ml制成单细胞悬浮液，1000rpm/7分钟离心，弃上清，收集细胞。
b．在细胞中加入Tris-NH4Cl溶液1ml，室温静置1～5分钟，加入5mlRPMI培养基离心(1000rpm/7’)二次，获得脾细胞中的淋巴细胞。取1×106个淋巴细胞，用抗CD4-FITC抗体和抗CD8-PE抗体染色，用流式细胞仪测定0时脾细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量，剩余细胞分别以1×106细胞数量置于96孔板和24板中并加入不同100ng的SEA(从军事医学科学院五所购入)在37℃,5％CO2孵箱中培养3天和5天。
c．收集培养3天的细胞用生理盐水洗涤二次，调细胞浓度为1×105～2×107细胞数/ml，此时的活性细胞经下述鉴定为SUP-Th。新鲜的SUP-Th用于注射动物，治疗肿瘤。
d．另一部分将超抗原刺激了3天的细胞洗涤收集后以1×108-1×107细胞量悬浮于0.5ml冻存液中(85％FCS和15％DMSO(二甲亚砜))置-80℃冻存。为冻存的SUP-TH。使用时立即恢复至37℃。用生理盐水洗2-3次去除DMSO后，悬浮至上述浓度，用于注射，治疗肿瘤。
e．平行实验中的细胞在96孔板中培养5-6天，MTT染色，490mu测定OD值，判断每批细胞活性。同时用CD4-FITC和CD8-PE抗体染色培养6天的细胞。用流式细胞仪测定活化细胞的类型，确定是否为CD4+T细胞。
实施例3人细胞-蛋白制剂的体外活性测定经下述方法鉴定，确定上述制备所得到细胞为CD4+T细胞，其T细胞受体上(TCR)自然联结了超抗原，证明所得物质为细胞-蛋白制剂即SUP-TH。
实施例1、2中T细胞与合适浓度的超抗原共同培养后，在第3天开始活化，在第5、6天达到培增殖高峰，见表1、2。
表1不同浓度的PHA(植物血凝素)，SEA SEB诱导外周血淋巴细胞的增殖(120hr)抗原剂量 490mu OD.mg/mlPHASEASEB10 0.52±0.05 0.58±0.05 0.63±0.0610.27±0.0040.49±0.06 0.49±0.050.1 0.28±0.03 0.46±0.03 0.53±0.030.01 0.21±0.0030.43±0.00010.60±0.070.0010.20±0.0010.35±0.03 0.58±0.030.0001 0.20±0.01 0.29±0.04 0.53±0.07
反向5′TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA3′IL-1I 正向5′ATGAACTGTGTTTGCCGCCTG3′反向5′GAGCTGTAGAGCTCCCAGTGC3′Flt3配体 正向5′TGGAGCCCAACAACCTATCTC3′反向5′GGGCTGAAAGOCACATTTGGT3′表3脂肪衍生的基质细胞LPS诱导后分泌的细胞因子的定量ELISA(pg/ml)
(表3中的数值为来自n=5-7个基质细胞供体的平均数±平均数标准误差。使用在暴露到100ng脂多糖/ml培养基指定时间之后未经稀释、经1∶25或1∶125稀释的条件培养基进行ELISA。IL-7ELISA在0.16-10pg/ml之间呈线性，星号表示在24小时和0小时时间点之间以单向ANOVA分析时*p＜0.01。缩写N.D.:未检出。)
表5超抗原SEB诱导活化的CD4+T细胞对K562细胞的杀伤率(％)靶细胞 杀伤率％ P值 n0天 6天K562 30.5±5.476.0±6.6≤0.0120表6超抗原诱导的CD4+T细胞对K562和HL-60细胞的非特异性杀伤率靶细胞 杀伤率％0天 6天 P nK56239.8±3.569.1±4.8≤0.015HL-60 31.2±2.651.1±6.9≤0.015表5,6，的结果证明了SEB诱导活化的CD4+T细胞在体外有杀伤肿瘤细胞的能力。这种杀伤能力是非特异性杀伤。
实施例6证明所制备的物质是SUP-TH而不是CD4+T细胞本身。
进一步的鉴定是证明实施例1中制备的细胞不是单纯活化的CD4+T细胞而是TCR上连结了蛋白的蛋白-细胞制剂即SUP-TH。超抗原能特异性地与TCR受体结合使T细胞增殖是已知的。把淋巴细胞与超抗原共同培养后，收集细胞并洗涤去除游离抗原。收集洗涤后细胞加入无任何抗原的细胞培养基继续培养。收集增殖物。因没有抗原存在细胞不能增殖，此时继续增殖的细胞是TCR上连接蛋白的SUP-TH，而不是细胞本身。表7中作为对照组的是无抗原刺激的细胞组和加入抗原的阳性对照组。
表7 SEB诱导的SUP-TH在无抗原刺激下的增殖实验组492muOD n=6细胞对照 0.42±0.05细胞+sAg 0.58±0.04SUP-TH 0.73±0.12
实施例7鼠SUP-TH制剂的体外活性鉴定实施例1、2中的超抗原SEA SEB均能导小鼠脾淋巴细胞增殖，增殖的细胞同样是CD4+T细胞而不是CD8+T细胞(表8,9)。
表8 SEA,SEB均能诱导小鼠淋巴细胞增殖
表9超抗原SEA诱导CD4+T细胞的增殖抗原刺激 T细胞亚群％天数 CD4+TCD+8T08.6414.895 68.69 23.32SEA诱导小鼠CD4+T细胞明显增殖，对CD8+T细胞无显著性作用。
实施例8鼠SUP-TH在体内的抗肿瘤功能把按实施例2-c的方法获得新鲜制备的SUP-TH注射给预先接种了肿瘤细胞的菏瘤鼠。这些鼠被随机分成3个实验组(表10)和5个实验组(表12)。将新鲜和在液氮中-80℃冻存的SUP-TH分别制成浓度为1×107细胞数/ml及1×106细胞数/ml的生理盐水注射剂，给肺癌荷瘤鼠注射，用量为0.2ml。注射途径有一次注射和两次注射两种方式。21天后处死小鼠，测定体内肿瘤大小并计算出抑制率。体内实验重复3次，使用动物54只。
表10新鲜SUP-TH的体内治疗肺癌的平均效果实验组 肿瘤大小(g)抑制率(％)荷瘤组4.2±0.20.00荷瘤+SUP-TH(1次) 2.4±0.142.86荷瘤+SUP-TH(2次) 1.134±0.9 73.80
表11新鲜SUP-TH治疗的最佳效果实验组 肿瘤大小(g)抑制率(％)瘤荷组 4.40.00荷瘤+SUP-TH(1次)2.543.18荷瘤+SUP-TH(2次)0.16 96.36表12新鲜SUP-TH与超抗SEA的体内抑癌效果比较实验组肿瘤大小(g)抑制率％荷瘤组 4.00.00荷瘤+SUP-TH(1次)2.342.5荷瘤+SUP-TH(2次)2.147.5荷瘤+sAg(2次) 2.93 26.75表12的结果显示一次注射SUP-TH抑癌率为42.5％；两次注射SUP-TH抑癌率为47.5％。只注射超抗原(sAg)SEA的动物，其肿瘤抑制率为26.75％。明显低于SUP-TH的效果。
为了保证新鲜SUP-TH的生物活性，每批制剂必须做平行体外活性测定。实验制做了3批SUP-TH。在注射给动物之前在体外培养6天。MTT染色，测定OD值，判定体外活性。
表13新鲜SUP-TH的体外活性测定490muOD n=3实验次数细胞对照组 SUP-TH组1 0.39±0.020.51±0.042 0.32±0.030.82±0.043 0.27±0.040.97±0.07平均值 0.33±0.050.77+0.19实施例9液氮中-80℃冻存的SUP-TH体内抑癌效果将实施例2中获得SUP-TH冻存后以1×106的浓度给肺癌荷瘤鼠注射，并观察肿瘤大小，计算抑癌率。(表14)表14冻存SUP-TH的体内抑癌效果实验组 肿瘤大小(g)抑制率％荷瘤组3.36 0.00荷瘤+SUP-TH(1次) 2.83 15.7权利要求
1．一种抗肿瘤药物，其特征是所述药物的活性成份是细胞与蛋白的结合物，即把超抗原与T细胞受体结合，所得到的结合物；所述的超抗原包括葡萄球菌肠毒素A(SEA)，和葡萄球菌肠毒素B(SEB)，所述的T细胞包括人外周血淋巴细胞和小鼠脾细胞。
2．权利要求1所述的抗肿瘤药物，其中所述的细胞与蛋白的结合物是新鲜制备的或者制备后经冷冻保存的。
3．权利要求1所述的抗肿瘤药物，其中所述的细胞与蛋白的结合物的含量是1×105-2×107细胞数/ml。
全文摘要
本发明提供了一种新型抗肿瘤制剂。本发明将超抗原与T细胞受体结合获得了一种细胞－蛋白结合物质SUP－TH。本发明的制剂在体内给药后,不仅能够防止蛋白被体内游离抗体中和,而且因T细胞是同源性物质,无异源性大分子蛋白进入体内,排除了异源性蛋白造成的免疫应答,减少了副作用。与单纯蛋白注射和抗体连接的超抗原注射相比,SUP－TH对肿瘤的识别能力和杀伤作用强,抑癌率最高可达到96%。新鲜SUP－TH和冻存后的SUP－TH都有抑制癌生长的功能。
文档编号A61P35/00GK1308966SQ01100528
公开日2001年8月22日 申请日期2001年1月11日 优先权日2001年1月11日
发明者陈钰 申请人:陈钰
技术领域：
本发明涉及一种抗癌药物，特别是涉及一种细胞-蛋白抗肿瘤制剂。
用蛋白或将蛋白与抗体连接作为治疗癌症的药物已有一些报道，如文献(Fosberg G；FosbergM；Jaki M et al:Identification of framework residuesin a secreted recombinant antibody fragmentthat control production level and localization in Escherichia coli J.Biol.Chem.272(19):12430-12436,1997)将大肠杆菌产生的超抗原连接在5T4单克隆抗体的Fab端，用这段蛋白进行非小细胞肺癌治疗试验。还有人把葡萄球菌肠毒素A(SEA)连接到C242单克隆抗体上，用这个蛋白抗体诱导人大肠癌的肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子和细胞程序性死亡(LittonMJ,DohlstenM,lando PA et al:Antibody-targeted superantigen therapy induces tumor-infiltratinglymphocytes,excessive cytokine production,and apoptosis in human colon carcinoma Eur J.Immuno.26(1):1-9,1996)。还有报道将高聚金葡菌素使用的金葡菌肠毒素的C型(SEC)直接用蛋白治疗癌症(高聚金葡素抗肿瘤化疗引起白细胞下降的临床观察，中国肿瘤临床1998年9月)。
上述工作存在问题是1)单纯使用蛋白注射治疗癌症，抑癌率只能达到40％左右。因为约有50％的正常人体中含有抗此类蛋白的天然抗体。而且C型毒素并不是蛋白家族中有效的蛋白。2)将蛋白与抗体连接虽可防止蛋白被抗体阻断，提高了治疗癌效果，但异源性的抗体蛋白会带来免疫系统的应答反应，造成疾病。
本发明的目的是制备一种新型抗肿瘤药物，将蛋白与T细胞受体连接，在提高治疗癌症效果的同时避免引起免疫系统的应答反应所造成的疾病。
本发明目的的实现制备一种将超抗原与T细胞受体结合的物质。已知超抗原能特异性地与CD4+T受体结合，使T细胞大量活化、增殖(Marrack,P.,and J.Kapper.1990.The staphylococcalenterotoxins and their relatives.Science 248:705,White,J.,A.Herman.A.M.Pullen.Et al.1989.The VB specific superantigen staphylococcal enterotoxin B:Stimulation ofmature T cells and clonal deletion in neonatal mice.Cell 56:27)。本发明利用这一特征制备了细胞蛋白制剂即Sup-Th，并对这一制剂的肿瘤杀伤功能进行了试验。
制备的具体操作方法是用小鼠脾细胞或者人外周血淋巴细胞与超抗原共同培养1-5天，使T细胞与超抗原自然结合，收集结合物。用细胞培养基MEM洗涤去除游离抗原，细胞恢复原浓度后在无任何抗原的细胞培养基中继续培养。继续生长的细胞被认定为蛋白与TCR连接的物质，即超抗原与T细胞结合物(代号为SUP-TH)，经动物试验确定此结合物具有抗肿瘤活性，且新鲜制备的结合物和低温冻存的结合物均有抗肿瘤活性。
上述超抗原包括SEA(葡萄球菌肠毒素A)和SEB(葡萄球菌肠毒素B)，T细胞包括人外周血淋巴细胞和小鼠脾细胞。
将上述新鲜制备的或冻存的SUP-TH与适当的药物辅剂制成注射剂，其浓度为1×105-2×107细胞数/ml。
本发明提供的抗肿瘤制剂SUP-TH经实验证明，得到如下结论(1)SUP-TH能够在体内抑制肿瘤的生长，且对肿瘤的识别能力和杀伤作用比CTL和NK强，抑癌率最高可达到96％；(2)新制备的SUP-TH能抑制肿瘤的生长，抑制率最高达到96％；(3)冻存后的SUP-TH也有抑制肺癌生长的功能；(4)与单纯蛋白注射和抗体连接的超抗原注射相比，SUP-TH诱发B细胞产生抗体的可能性小，比单纯注射超抗原的效果好；(5)SUP-TH进入体内一方面防止蛋白被体内游离抗体中和，另一方面T细胞是同源性物质，无异源性大分子蛋白进入体内，因此无排斥反应，排除了异源性蛋白造成的免疫应答，减少副作用。
实施例1用人外周血淋巴细胞与超抗原SEB制备细胞一蛋白制剂a．取人外周抗凝血10ml加10ml生理盐水做对倍稀释。
b．取淋巴细胞分离液(北京原平公司购入)(比重1∶1.077)3ml加5～8ml上述抗凝血。
c．在4℃,2000rpm/20分钟离心，取中间层淋巴细胞。
d．用含2％FCS(胎牛血清，56℃灭活)的MEM培养基洗涤三次后，用含10％FCS,RPMI标准细胞培养基将细胞制成悬浮液，用胎盼兰染色细胞并记录活细胞总数。
e．SUP-TH是淋巴细胞与超抗原共同培养3天，充分洗涤去除游离抗原后的活性物质。这些物质的活性是用RPMI重新悬浮至原细胞浓度继续在37℃,5％CO2孵箱中培养至6天，用MTT染色并测定细胞增殖状况。通常细胞在无抗原刺激下不再生长，而表7的结果显示了SUP-TH在洗净游离抗原后在新鲜培养基中仍然继续生长，说明它不是单一细胞而在TCR载有超抗原的细胞-蛋白物质(Marrack,P.,and J.Kapper.1990.The staphylococcal enterotoxins andtheir relatives.Science 248:705,White,J.,A.Herman.A.M.Pullen.Et al.1989.TheVB specific superantigen staphylococcal enterotoxin B:Stimulation of mature T cellsand clonal deletion in neonatal mice.Cell 56:27)。这种物质有杀伤肿瘤作用，为SUP-TH。
f．取1×106个细胞，用抗-CD8-PE抗体和抗CD4-FITC抗体染色(Serotec公司购置的标准荧光抗体)，用流式细胞仪测定0时外周血中CD4+T细胞数量。
g．其余的细胞以5×105个细胞与不同浓度的抗原即PHA(植物血凝素)，SEA和SEB(从军事医学科学院五所购入)在37℃、5％CO2孵箱中共同培养。用MTT(四甲基偶联氮唑盐)染色(将50mgMTT溶于10mlPBS)，然后用酶联测定仪测定不同时间的细胞生长状况。并在细胞生长的最适时间内测定活性细胞亚群和在体外对肿瘤细胞的杀伤活性。(表1-7)实施例2．用小鼠脾细胞与超抗原SEA制备细胞-蛋白制剂a．取C57/B6小鼠脾脏，经无菌玻片轻轻研碎后用300目尼龙网过滤，用10％FCS RPMI培养基5ml制成单细胞悬浮液，1000rpm/7分钟离心，弃上清，收集细胞。
b．在细胞中加入Tris-NH4Cl溶液1ml，室温静置1～5分钟，加入5mlRPMI培养基离心(1000rpm/7’)二次，获得脾细胞中的淋巴细胞。取1×106个淋巴细胞，用抗CD4-FITC抗体和抗CD8-PE抗体染色，用流式细胞仪测定0时脾细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量，剩余细胞分别以1×106细胞数量置于96孔板和24板中并加入不同100ng的SEA(从军事医学科学院五所购入)在37℃,5％CO2孵箱中培养3天和5天。
c．收集培养3天的细胞用生理盐水洗涤二次，调细胞浓度为1×105～2×107细胞数/ml，此时的活性细胞经下述鉴定为SUP-Th。新鲜的SUP-Th用于注射动物，治疗肿瘤。
d．另一部分将超抗原刺激了3天的细胞洗涤收集后以1×108-1×107细胞量悬浮于0.5ml冻存液中(85％FCS和15％DMSO(二甲亚砜))置-80℃冻存。为冻存的SUP-TH。使用时立即恢复至37℃。用生理盐水洗2-3次去除DMSO后，悬浮至上述浓度，用于注射，治疗肿瘤。
e．平行实验中的细胞在96孔板中培养5-6天，MTT染色，490mu测定OD值，判断每批细胞活性。同时用CD4-FITC和CD8-PE抗体染色培养6天的细胞。用流式细胞仪测定活化细胞的类型，确定是否为CD4+T细胞。
实施例3人细胞-蛋白制剂的体外活性测定经下述方法鉴定，确定上述制备所得到细胞为CD4+T细胞，其T细胞受体上(TCR)自然联结了超抗原，证明所得物质为细胞-蛋白制剂即SUP-TH。
实施例1、2中T细胞与合适浓度的超抗原共同培养后，在第3天开始活化，在第5、6天达到培增殖高峰，见表1、2。
表1不同浓度的PHA(植物血凝素)，SEA SEB诱导外周血淋巴细胞的增殖(120hr)抗原剂量 490mu OD.mg/mlPHASEASEB10 0.52±0.05 0.58±0.05 0.63±0.0610.27±0.0040.49±0.06 0.49±0.050.1 0.28±0.03 0.46±0.03 0.53±0.030.01 0.21±0.0030.43±0.00010.60±0.070.0010.20±0.0010.35±0.03 0.58±0.030.0001 0.20±0.01 0.29±0.04 0.53±0.07
反向5′TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA3′IL-1I 正向5′ATGAACTGTGTTTGCCGCCTG3′反向5′GAGCTGTAGAGCTCCCAGTGC3′Flt3配体 正向5′TGGAGCCCAACAACCTATCTC3′反向5′GGGCTGAAAGOCACATTTGGT3′表3脂肪衍生的基质细胞LPS诱导后分泌的细胞因子的定量ELISA(pg/ml)
(表3中的数值为来自n=5-7个基质细胞供体的平均数±平均数标准误差。使用在暴露到100ng脂多糖/ml培养基指定时间之后未经稀释、经1∶25或1∶125稀释的条件培养基进行ELISA。IL-7ELISA在0.16-10pg/ml之间呈线性，星号表示在24小时和0小时时间点之间以单向ANOVA分析时*p＜0.01。缩写N.D.:未检出。)
表5超抗原SEB诱导活化的CD4+T细胞对K562细胞的杀伤率(％)靶细胞 杀伤率％ P值 n0天 6天K562 30.5±5.476.0±6.6≤0.0120表6超抗原诱导的CD4+T细胞对K562和HL-60细胞的非特异性杀伤率靶细胞 杀伤率％0天 6天 P nK56239.8±3.569.1±4.8≤0.015HL-60 31.2±2.651.1±6.9≤0.015表5,6，的结果证明了SEB诱导活化的CD4+T细胞在体外有杀伤肿瘤细胞的能力。这种杀伤能力是非特异性杀伤。
实施例6证明所制备的物质是SUP-TH而不是CD4+T细胞本身。
进一步的鉴定是证明实施例1中制备的细胞不是单纯活化的CD4+T细胞而是TCR上连结了蛋白的蛋白-细胞制剂即SUP-TH。超抗原能特异性地与TCR受体结合使T细胞增殖是已知的。把淋巴细胞与超抗原共同培养后，收集细胞并洗涤去除游离抗原。收集洗涤后细胞加入无任何抗原的细胞培养基继续培养。收集增殖物。因没有抗原存在细胞不能增殖，此时继续增殖的细胞是TCR上连接蛋白的SUP-TH，而不是细胞本身。表7中作为对照组的是无抗原刺激的细胞组和加入抗原的阳性对照组。
表7 SEB诱导的SUP-TH在无抗原刺激下的增殖实验组492muOD n=6细胞对照 0.42±0.05细胞+sAg 0.58±0.04SUP-TH 0.73±0.12
实施例7鼠SUP-TH制剂的体外活性鉴定实施例1、2中的超抗原SEA SEB均能导小鼠脾淋巴细胞增殖，增殖的细胞同样是CD4+T细胞而不是CD8+T细胞(表8,9)。
表8 SEA,SEB均能诱导小鼠淋巴细胞增殖
表9超抗原SEA诱导CD4+T细胞的增殖抗原刺激 T细胞亚群％天数 CD4+TCD+8T08.6414.895 68.69 23.32SEA诱导小鼠CD4+T细胞明显增殖，对CD8+T细胞无显著性作用。
实施例8鼠SUP-TH在体内的抗肿瘤功能把按实施例2-c的方法获得新鲜制备的SUP-TH注射给预先接种了肿瘤细胞的菏瘤鼠。这些鼠被随机分成3个实验组(表10)和5个实验组(表12)。将新鲜和在液氮中-80℃冻存的SUP-TH分别制成浓度为1×107细胞数/ml及1×106细胞数/ml的生理盐水注射剂，给肺癌荷瘤鼠注射，用量为0.2ml。注射途径有一次注射和两次注射两种方式。21天后处死小鼠，测定体内肿瘤大小并计算出抑制率。体内实验重复3次，使用动物54只。
表10新鲜SUP-TH的体内治疗肺癌的平均效果实验组 肿瘤大小(g)抑制率(％)荷瘤组4.2±0.20.00荷瘤+SUP-TH(1次) 2.4±0.142.86荷瘤+SUP-TH(2次) 1.134±0.9 73.80
表11新鲜SUP-TH治疗的最佳效果实验组 肿瘤大小(g)抑制率(％)瘤荷组 4.40.00荷瘤+SUP-TH(1次)2.543.18荷瘤+SUP-TH(2次)0.16 96.36表12新鲜SUP-TH与超抗SEA的体内抑癌效果比较实验组肿瘤大小(g)抑制率％荷瘤组 4.00.00荷瘤+SUP-TH(1次)2.342.5荷瘤+SUP-TH(2次)2.147.5荷瘤+sAg(2次) 2.93 26.75表12的结果显示一次注射SUP-TH抑癌率为42.5％；两次注射SUP-TH抑癌率为47.5％。只注射超抗原(sAg)SEA的动物，其肿瘤抑制率为26.75％。明显低于SUP-TH的效果。
为了保证新鲜SUP-TH的生物活性，每批制剂必须做平行体外活性测定。实验制做了3批SUP-TH。在注射给动物之前在体外培养6天。MTT染色，测定OD值，判定体外活性。
表13新鲜SUP-TH的体外活性测定490muOD n=3实验次数细胞对照组 SUP-TH组1 0.39±0.020.51±0.042 0.32±0.030.82±0.043 0.27±0.040.97±0.07平均值 0.33±0.050.77+0.19实施例9液氮中-80℃冻存的SUP-TH体内抑癌效果将实施例2中获得SUP-TH冻存后以1×106的浓度给肺癌荷瘤鼠注射，并观察肿瘤大小，计算抑癌率。(表14)表14冻存SUP-TH的体内抑癌效果实验组 肿瘤大小(g)抑制率％荷瘤组3.36 0.00荷瘤+SUP-TH(1次) 2.83 15.7权利要求
1．一种抗肿瘤药物，其特征是所述药物的活性成份是细胞与蛋白的结合物，即把超抗原与T细胞受体结合，所得到的结合物；所述的超抗原包括葡萄球菌肠毒素A(SEA)，和葡萄球菌肠毒素B(SEB)，所述的T细胞包括人外周血淋巴细胞和小鼠脾细胞。
2．权利要求1所述的抗肿瘤药物，其中所述的细胞与蛋白的结合物是新鲜制备的或者制备后经冷冻保存的。
3．权利要求1所述的抗肿瘤药物，其中所述的细胞与蛋白的结合物的含量是1×105-2×107细胞数/ml。
全文摘要
本发明提供了一种新型抗肿瘤制剂。本发明将超抗原与T细胞受体结合获得了一种细胞－蛋白结合物质SUP－TH。本发明的制剂在体内给药后,不仅能够防止蛋白被体内游离抗体中和,而且因T细胞是同源性物质,无异源性大分子蛋白进入体内,排除了异源性蛋白造成的免疫应答,减少了副作用。与单纯蛋白注射和抗体连接的超抗原注射相比,SUP－TH对肿瘤的识别能力和杀伤作用强,抑癌率最高可达到96%。新鲜SUP－TH和冻存后的SUP－TH都有抑制癌生长的功能。
文档编号A61P35/00GK1308966SQ01100528
公开日2001年8月22日 申请日期2001年1月11日 优先权日2001年1月11日
发明者陈钰 申请人:陈钰
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