一种凝结芽孢杆菌检测引物组、试剂盒及其方法

xiaoxiao2020-6-24  18

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一种凝结芽孢杆菌检测引物组、试剂盒及其方法
【专利摘要】本发明涉及微生物检测【技术领域】,公开了凝结芽孢杆菌LAMP检测的引物组、检测试剂盒及其检测方法。本发明所建立的凝结芽孢杆菌LAMP检测方法特异、灵敏、简便快捷,1.5h内可完成,能用于样品的快速检测。
【专利说明】一种凝结芽孢杆菌检测引物组、试剂盒及其方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种凝结芽孢杆菌检测试剂盒,具体涉及尤其涉及用于凝结芽孢杆菌 LAMP检测的引物组、检测试剂盒及其检测方法,属于微生物检测【技术领域】。
[0002]

【背景技术】
[0003] 凝结芽孢杆菌(ifeciBiAs coagw/afls)呈杆状,两端钝圆,革兰氏阳性菌,过氧化氢 酶阳性,芽胞端生,无鞭毛。最适生长温度为45?50°C,最适pH值为6. 6?7.0。其能分 解糖类生成L-乳酸,为同型乳酸发酵菌。凝结芽孢杆菌是造成罐头食品平盖酸败和乳制 品变质主要微生物。传统的平板计数已经渐渐不适应食品生产车间的快速节奏,荧光定量 PCR被运用于食品厂中,检测凝结芽孢杆菌的存在。然而PCR法需要昂贵的PCR仪,并且操 作繁杂,在实际运用中很受限制。
[0004] 环介导等温扩增技术(LAMP)是2000年Notomi等人开发出来的一项新技术,利用 4条引物,并选择性地使用环引物,在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下,可使靶基因在 60 min内得到大量扩增。反应中,模板两端引物结合处循环出现环状单链结构,从而保证引 物可以在等温条件下顺利与模板结合,并进行链置换扩增反应。窦明理等基于SP00A基因 设计出了凝结芽孢杆菌的LAMP引物组,该引物组专一性不强,能同时检查多种耐热芽孢杆 菌,而且SP00A基因存在于很多微生物当中,不能针对性检测凝结芽孢杆菌。
[0005] 经过对现有技术的文献检索未发现特异检测凝结芽孢杆菌的LAMP检测的引物 组、检测试剂盒及其检测方法相关研究报道,因此研制凝结芽孢杆菌LAMP检测的引物组、 检测试剂盒及其检测方法十分必要。
[0006]


【发明内容】

[0007] 本发明提供一种凝结芽孢杆菌检测引物组、试剂盒及其方法,以克服现有技术所 存在的上述缺点和不足。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种凝结芽孢杆菌LAMP检测用引物组。本发明的第 二个目的是提供凝结芽孢杆菌LAMP检测试剂盒。本发明的第三个目的是提供凝结芽孢杆 菌LAMP检测方法。
[0009] 本发明的检测方法经过一次简单的恒温扩增,就可以达到快速检测凝结芽孢杆菌 的目的。采用该试剂盒和检测方法具有操作简单、灵敏度高的特点。
[0010] 本发明所需要解决的技术问题,可以通过以下技术方案来实现: 作为本发明的第一方面,一种凝结芽孢杆菌检测的引物组,其特征在于,所述引物组以 凝结芽孢杆菌CK基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物:内引物FIP/ BIP和外引物F3/B3,其核苷酸序列与SEQ ID N0. 1-4相同。 toon] 其中,所述两对引物分别为: 外引物 F3 :TTTTGGCTCACGGAAGAG (SEQ ID NO. 1), 外引物B3:TGAACTGGCAGTCATACG(SEQIDNO·2), 内引物 FIP :AGAACGCCTTCAAAATCGCACTT TTAGCTTGAATTATTACGGGAC (SEQ ID NO. 3), 内引物 BIP :AACTTTAATAAGGCACCGATTGT GGTTTTATCTCGGGGATTTTGTCG (SEQ ID NO. 4)〇
[0012] 作为本发明的第二方面,一种采用所述的引物组的凝结芽孢杆菌检测试剂盒,其 特征在于:所述试剂盒包含:引物组、阳性对照品、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和显色液。
[0013] 其中,所述引物组,包括内引物FIP/BIP和外引物F3/B3,其核苷酸序列与SEQ ID NO. 1-4相同,所述外引物和内引物添加的摩尔比为1 :4?8。
[0014] 其中,所述阳性对照品为含有凝结芽孢杆菌的基因组DNA。
[0015] 其中,所述 LAMP 反应液中含有 0· 6 ?1. 4mmol/L dNTP,5 ?10 mmol/L Mg2+, 0· 5 ?L 2mol/L Betaine,10XThermopol Buffer。
[0016] 其中,所述Bst DNA聚合酶和显色液为市售,显色液为GeneFinder。
[0017] 作为本发明的第三方面,一种凝结芽孢杆菌检测试剂盒的凝结芽孢杆菌检测方 法,其特征在于:包括以下的步骤: (1) 提供待测样品DNA ; (2) 在LAMP反应体系中加入所述引物组、LAMP反应液、BstDNA聚合酶,进行恒温扩增 反应后灭活; (3) 灭活后部分产物加入显色液,观察显色结果,并同时对比阳性对照品的显色结果, 若显色结果一致,说明待测样品中含有凝结芽孢杆菌,若显色结果不一致,则说明待测样品 中不含有凝结芽孢杆菌。
[0018] 步骤(2)中,所述恒温反应的温度范围为58°C,反应时间为80min。
[0019] 步骤(3)中,所述灭活的温度为80°C,灭活时间为10min。
[0020] 本发明的有益效果: 1、该凝结芽孢杆菌LAMP方法操作简单,具有良好的特异性。
[0021] 2、该快速反应试剂盒反应条件温和,所需仪器简单,扩增快速高效,不到1.5h可 完成,与PCR相比更快速、经济,适用面更广。
[0022]

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1为实施例1中凝结芽孢杆菌LAMP引物对种细菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。
[0024] Μ 泳道为标准 DNA marker 2000。
[0025] 1号泳道为凝结芽孢杆菌的扩增结果。
[0026] 2-6号泳道分别为含有枯草芽胞杆菌、蜡状芽孢 杆菌(ZfeciBws cerews)、巨大芽抱杆菌(ifeciBws 地衣芽抱杆菌 iBacilluslicheniformii)私欠[麗後取{Escherichia coli、。
[0027] 图2为实施例1中凝结芽孢杆菌LAMP引物对种细菌DNA扩增产物用GeneFinder 染色图。
[0028] 1号管为凝结芽孢杆菌的扩增结果。
[0029] 2-6号管分别为含有枯草芽胞杆菌、蜡状芽孢 杆菌(ZfeciBws cerews)、巨大芽抱杆菌(ifeciBws 地衣芽抱杆菌 、Bacilluslicheniformii)、卞施妖屬标樣取{Escherichia coli、。
[0030] 图3为实施例2中凝结芽孢杆菌LAMP引物对不同数量凝结芽孢杆菌的凝胶电泳 图。
[0031] Μ 泳道为标准 DNA marker 2000 1-5 号分别为 6cfu/体系、60 cfu/体系、600 cfu/体系、6000 cfu/体系、60000 cfu/ 体系。

【具体实施方式】
[0032] 结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、 条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识, 本发明没有特别限制内容。
[0033] 实施例1 试验步骤 1、提取凝结芽抱杆菌枯草芽胞杆菌 錯状芽抱杆菌cereiAs)、地衣芽抱杆菌(^3<^7/〇57/<^61/7//〇/--/>5)、巨大芽抱杆 菌和大肠杆菌标准株C&cAericAia co/i)的DNA,上述菌种来源 见表1。
[0034] 2、以步骤1中的细菌DNA为模板,用凝结芽孢杆菌LAMP引物组进行扩增。
[0035] 扩增体系为:25μ 1 由 2· 5μ 1 10XBuffer、9y ldNTP (2. 5mmol/L)、2y 1 FIP (20 mmol/L)、2μ 1 BIP (20 mmol/L)、0· 25 μ 1 F3 (20 mmol/L)、0· 25 μ 1 B3 (20 mmol/L)、 1 μ lBst DNA Polymerase (8υ/μ1)>2μ1 MgS04 (100 mmol/L) >4 μ IBetaine (5mol/L)> 2 μ 1 DNA 模板。
[0036] 扩增条件为:58°C 80min进行恒温扩增反应,80°C灭活时间为10min,4°C保存。
[0037] 3、取5ul灭活产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,剩余液体产物加入显色液,观察显色 结果。
[0038] 实验结果 检测结果如图1所示,从图1中可以看出本实施方式用扩增凝结芽孢杆菌的特异LAMP 引物能够从凝结芽孢杆菌DNA中扩增出大量的梯度大小核酸片段,而未能从其他属细菌 DNA中扩增出核酸片段。
[0039] 如图2所示,凝结芽孢杆菌DNA用凝结芽孢杆菌的特异LAMP引物进行LAMP扩增 的液体产物加 GeneFinder后呈草绿色,而其他属细菌DNA用凝结芽孢杆菌的特异LAMP引 物进行LAMP扩增的液体产物加 GeneFinder后呈橙黄色。
[0040] 图1和图2显示结果一致,都说明了凝结芽孢杆菌的特异LAMP引物特异性好。
[0041] 表1菌种来源表

【权利要求】
1. 一种凝结芽孢杆菌检测的引物组,其特征在于,所述引物组以凝结芽孢杆菌CK基因 为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物:内引物FIP/BIP和外引物F3/B3,其 核苷酸序列与SEQ ID NO. 1-4相同。
2. 根据权利要求1所述的引物,其特征在于,所述两对引物分别为: 外引物 F3 :ITTTGGCTCACGGAAGAG, 外引物 B3 :TGAACTGGCAGTCATACG, 内引物 FIP :AGAACGCCTTCAAAATCGCACTT TTAGCTTGAATTATTACGGGAC, 内引物 BIP :AACTTTAATAAGGCACCGATTGT GGTTTTATCTCGGGGATTTTGTCG。
3. -种采用如权利要求1所述的引物组的凝结芽孢杆菌检测试剂盒,其特征在于:所 述试剂盒包含:引物组、阳性对照品、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和显色液。
4. 根据权利要求3所述的凝结芽孢杆菌检测试剂盒,其特征在于:所述引物组,包括内 引物FIP/BIP和外引物F3/B3,其核苷酸序列与SEQ ID NO. 1-4相同,所述外引物和内引物 添加的摩尔比为1 :4?8。
5. 根据权利要求3所述的凝结芽孢杆菌检测试剂盒,其特征在于:所述阳性对照品为 含有凝结芽孢杆菌的基因组DNA。
6. 根据权利要求3所述的凝结芽孢杆菌检测试剂盒,其特征在于:所述LAMP反 应液中含有 〇· 6 ?1. 4mmol/L dNTP,5 ?10 mmol /T, Mg2+,0· 5 ?1. 2mol/L Betaine, 10XThermopol Buffer。
7. 根据权利要求3所述的凝结芽孢杆菌检测试剂盒,其特征在于:所述Bst DNA聚合 酶和显色液为市售,显色液为GeneFinder。
8. -种如权利要求3所述凝结芽孢杆菌检测试剂盒的凝结芽孢杆菌检测方法,其特征 在于:包括以下的步骤: (1) 提供待测样品DNA ; (2) 在LAMP反应体系中加入所述引物组、LAMP反应液、BstDNA聚合酶,进行恒温扩增 反应后灭活; (3) 灭活后部分产物加入显色液,观察显色结果,并同时对比阳性对照品的显色结果, 若显色结果一致,说明待测样品中含有凝结芽孢杆菌,若显色结果不一致,则说明待测样品 中不含有凝结芽孢杆菌。
9. 根据权利要求8所述的凝结芽孢杆菌检测方法,其特征在于:步骤(2)中,所述恒温 反应的温度范围为58°C,反应时间为80min。
10. 根据权利要求8所述的凝结芽孢杆菌检测方法,其特征在于:步骤(3)中,所述灭活 的温度为80°C,灭活时间为lOmin。
【文档编号】C12Q1/04GK104152543SQ201410243762
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】符雷, 郗洪生, 施腾鑫, 陆亚怡 申请人:江苏恒丰强生物技术有限公司

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