利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中静息细胞的制备方法
利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中静息细胞的制备方法
【专利摘要】本发明属于利用微生物将合成气厌氧发酵制取乙醇【技术领域】，具体涉及一种微生物利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法。该方法包括微生物菌种活化、厌氧条件下富集生长、离心、收集细胞沉淀、重悬浮培养等步骤。本发明所提供的制备方法，培养基经过特殊优化，克服了菌液培养过程中菌体生长本身引起的干扰，制备的厌氧微生物静息细胞生长期较为一致，可以使细胞更好的进行能量代谢，从而提高将合成气转换为乙醇的转化效率，促进利用合成气转化乙醇产业化的进行。
【专利说明】利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中静息细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于利用微生物将合成气厌氧发酵制取乙醇【技术领域】，具体涉及一种微生物利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]能源是人类生存和发展的重要物质基础，也是当今国际政治、经济、军事、外交关注的焦点。能源消耗对生态环境的影响日益突出，解决好能源问题，不仅要注重供求平衡，也要关注由此带来的生态环境问题。
[0003]乙醇是一种优质的液体燃料，可单独使用，也可加入到汽油中作为一种清洁能源使用。现有技术中，利用粮食原料采用发酵方法是获得乙醇的常用方法，但由于粮食原料成本较高，因而乙醇作为燃料使用一直受限于乙醇产量的限制。利用合成气厌氧制取乙醇是近年来一个新的研究热点，也是目前认为可行性较高的方法。
[0004]合成气是指一种主要成分为C0、C02、H2和N2等气体的混合气，由煤、石油、天然气、焦炉煤气、炼厂气、污泥和生物质等转化而得。自然环境中，一些微生物可以利用合成气作为唯一碳源和能源进行生长并代谢产生乙醇，这为合成气资源的能源化利用及生物乙醇的开发提供了理论基础。
[0005]现有研究认为，能够利用合成气生产乙醇的是一类特殊的厌氧微生物。这类微生物细胞利用合成气生产乙醇时既可以是处于生物量不断增长阶段，也可以是处于生物量稳定的静息细胞阶段。
[0006]静息细胞是指没有外源营养物质供应，靠消耗内源营养物质来维系菌体的能量代谢，不进行生长繁殖，处于饥饿状态、休眠状态的细胞。静息细胞中的各种酶能够发挥作用不停地进行能量代谢，并在适宜条件下可再恢复生长。
[0007]静息细胞发酵法即是以微生物的整体细胞作为反应催化剂，具有反应条件温和、选择性强、无污染、成本低、副产物少、微生物倍增时间短、生物量积累快，单位时间产生的酶量多、转化效率高、条件容易控制、分离纯化较容易等许多正常细胞发酵法不具备的优点。因而在合成气厌氧发酵制取乙醇过程中，静息细胞期的合理应用是提高乙醇产率的重要途径。而现有技术中，尚未见到较为合适的针对微生物利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中的微生物静息细胞的制备方法。
【发明内容】
[0008]本发明目的在于提供一种微生物利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，从而大量制备整体处于静息期的微生物细胞，此阶段的微生物细胞只进行能量代谢，利于将合成气转化为乙醇。
[0009]一种利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，包括以下步骤:
(I)将微生物菌种活化,厌氧条件下富集生长；所述微生物菌种为..Clostridium carboxidi vorans P7、Clostridium strain Pl 1、Clostridium.Ljungdahlii 5? Clostridium autoethanogenum DSM10061 ；
所述菌种活化采用活化培养基，活化培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NH4Cl 0.7~1.2g, NaCl 0.7~1.2g，MgCl2 0.2~0.5g, KH2PO4 0.5~0.9g, K2HPO41.0~2.0g，胰蛋白胨 I~3g,酵母膏 0.5~1.5g, FeCl3 2.0~3.0g,纤维二糖 0.5~1.5g, L-cys 0.5~0.9g,木糖 2~6g,矿质元素溶液0.5^1.5mL，余量为水；配制培养基时，纤维二糖在培养基灭菌后过滤加入；所述矿质元素溶液，以IL容量为例，配方如下=ZnCl2 0.05~0.lg, MnCl2 0.05~0.15g，H3BO3 0.004^0.008g, CoCl2 0.1-0.3g, CuCl2 0.001-0.003g, NiCl2 0.015^0.03g, Na2MoO4
0.02~0.04g，溶于1mL HCl的FeCl21.0~2.0g，余量为水；所述水优选为去离子水；配制时，先把FeCl2溶于HCl中，再用水稀释，然后加入其它盐，最终体积定容；
所述富集生长采用生长培养基，生长培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NaCl 1.(Tl.5g, NH4Cl 1.0~2.0g，KCl 0.10~0.30g, MgSO40.2~0.5g，CaCl2 0.04~0.08g, KH2PO4
0.20~0.50g，酵母膏0.2~0.6g，L-cys 0.1-0.3g，MES 4~8g，微量元素溶液10mL，维生素溶液10mL，余量为水，pH4.5~6.5 ;配制时，pH的调节在添加MES后立即进行；
所述微量元素溶液 ，以IL容量为例，配方如下=N(CH2COOH) 31.00^3.0Og, MgSO4
0.50~1.50g, (NH4)2SO4.FeSO4.6H20 0.5~1.0g, CoCl2.6H20 0.10~0.30g, ZnSO4.7H20
0.10-θ.30g, CuCl2.2H20 0.01-0.03g, NiCl2.6H20 0.01-0.03g, Na2MoO4.2H20 0.01-0.03g,Na2O4Se (硒酸钠)0.01-0.03g, Na2WO4.2H20 0.01-0.03g，余量为水；配制时，N(CH2COOH)3 最后加入，加入后立即用10.0moI/L的NaOH溶液调节pH至5.0~7.0 ；
所述维生素溶液，以IL容量为例，配方如下=VB6 8.00~12.00g，维生素BI 4.00~6.0Og,VB2 3.00~7.00g，泛酸钙 3.00~7.00g，硫辛酸 4.00~6.0Og, C9H11O2N (苯丙氨酸)4.00~6.0Og,VB3 4.00 -6.0Og, VB12 3.00~7.0Og,维生素 H 1.00~3.0Og,叶酸 1.00 ~3.0Og,余量为水；配制时，溶液配制完成后用0.22 μ m过滤器过滤除菌；
(2)将步骤(1)中生长稳定后的微生物菌液离心，收集细胞沉淀；
所述生长稳定为生物量稳定；即生物量测定时采用紫外分光光度计在OD6tltl波长下测定时，生物量处于稳定不变状态；
所述离心为rpm600(T10000离心l(T30min ;离心时优选采用NG3培养基进行洗涤，洗涤后再离心收集沉淀，此过程重复广3次，确保生长培养基不对后续培养造成影响，以及确保收集的微生物细胞生长期较为一致；所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分；
(3)将步骤(2)收集得到细胞沉淀悬浮于NG3培养基，悬浮时，以同等体积生长培养基中离心获得的细胞沉淀悬浮于同等体积的NG3培养基计；
所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分；
厌氧培养f 2d，至NG3培养基中微生物细胞生物量是生长培养基中微生物细胞生物量
1.(Tl.5倍时，结束培养，培养结束后所得菌液培养物即为静息期的微生物细胞。
[0010]所述利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法中，NG3培养基的制备包括以下步骤:
(I)按NG3配方制备培养基溶液；
所述培养基溶液采用厌氧瓶盛放；(2)将步骤(1)制备的NG3培养基溶液置于厌氧培养箱中，加入脱氧指示剂，脱氧2(T36h ；
所述脱氧指示剂为质量分数为0.1%的刃天青溶液,添加量为500uL/L ；
(3)将步骤(2)脱氧后的培养基充入高纯氮排空氧气，然后置于灭菌锅中，待灭菌锅中水沸腾后在厌氧瓶口插上无菌针头，封闭灭菌锅，115~125°C条件下，灭菌15~30min。
[0011]本发明所提供的细胞静息期厌氧微生物的制备方法，培养基经过特殊优化，克服了菌液培养过程中菌体生长本身引起的干扰，制备的厌氧微生物静息细胞生长期较为一致，可以使细胞更好地进行能量代谢，从而提高将合成气转换为乙醇的转化效率，促进利用合成气转化乙醇产业化的进行。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例
[0013]\^%'备 Clostridium autoethanogenum DSM10061 的静息期细胞为例，具体制备方法包括以下步骤:
(I)实脸奮取Clostridium autoethanogenum DSM10061购买自德国菌种保藏中心，将购买的菌株活化，在厌氧箱内厌氧条件下富集生长；富集生长过程中，每12h取样，样品用紫外分光光度计在OD6tltl波长下测定，待生长稳定后再进行下一步操作；富集培养约96h后，微生物细胞进入生长稳定期，生物量稳定不再增长；
所述菌种活化采用活化培养基，活化培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NH4Cl 0.7~1.2g, NaCl 0.7~1.2g，MgCl2 0.2~0.5g, KH2PO4 0.5~0.9g, K2HPO41.0~2.0g，胰蛋白胨 I~3g,酵母膏 0.5~1.5g, FeCl3 2.0~3.0g,纤维二糖 0.5~1.5g, L-cys 0.5~0.9g,木糖 2~6g,矿质元素溶液0.5^1.5mL，余量为水；配制培养基时，纤维二糖在培养基灭菌后过滤加入；所述矿质元素溶液，以IL容量为例，配方如下=ZnCl2 0.05~0.lg, MnCl2 0.05~0.15g，H3BO3 0.004^0.008g, CoCl2 0.1~0.3g, CuCl2 0.001~0 .003g, NiCl2 0.015^0.03g, Na2MoO4
0.02~0.04g，溶于1mL HCl的FeCl21.0~2.0g，余量为水；所述水优选为去离子水；配制时，先把FeCl2溶于HCl中，再用水稀释，然后加入其它盐，最终体积定容；
所述富集生长采用生长培养基，生长培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NaCl 1.(Tl.5g, NH4Cl 1.0~2.0g，KCl 0.10~0.30g, MgSO40.2~0.5g，CaCl2 0.04~0.08g, KH2PO4
0.20~0.50g，酵母膏0.2~0.6g，L-cys 0.1~θ.3g，MES 4~8g，微量元素溶液10mL，维生素溶液10mL，余量为水，pH4.5~6.5 ;配制时，pH的调节在添加MES后立即进行；
所述微量元素溶液，以IL容量为例，配方如下=N(CH2COOH) 31.00^3.00g, MgSO4
0.50~1.50g, (NH4)2SO4.FeSO4.6H20 0.5~1.0g, CoCl2.6H20 0.10~0.30g, ZnSO4.7H200.10-θ.30g, CuCl2.2H20 0.01~0.03g, NiCl2.6H20 0.01~0.03g, Na2MoO4.2H20 0.01~0.03g,Na2O4Se 0.01`0.03g, Na2WO4.2Η20 0.01~0.03g，余量为水；配制时，N(CH2COOH) 3 最后加入，加入后立即用10.0moI/L的NaOH溶液调节pH至5.0~7.0 ；
所述维生素溶液，以IL容量为例，配方如下=VB6 8.00~12.00g，维生素BI 4.00~6.0Og,VB2 3.00~7.0Og,泛酸钙 3.00~7.0Og,硫辛酸 4.00~6.00g, C9H11O2N 4.00~6.00g, VB3 4.00-6.0Og, VB12 3.00~7.0Og,维生素H 1.00~3.0Og,叶酸1.00~3.0Og,余量为水；配制时，溶液配制完成后用0.22 μ m过滤器过滤除囷；
(2)将步骤(1)中生长稳定后的微生物菌液离心，收集细胞沉淀；
所述生长稳定为生物量稳定；生物量测定时采用紫外分光光度计在OD6tltl波长下测定；所述离心为rpm600(T10000离心l(T30min ;离心时优选采用NG3培养基进行洗涤，洗涤后再离心收集沉淀，此过程重复广3次，确保生长培养基不对后续培养造成影响，以及确保收集的微生物细胞生长期较为一致；所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分；
(3)将步骤(2)收集得到细胞沉淀悬浮于NG3培养基，悬浮时，按一瓶(80mL/瓶)生长培养基离心沉淀获得的细胞悬浮于一瓶(80mL/瓶)NG3培养基计，
所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分；
厌氧培养f 2d，至NG3培养基中微生物细胞生物量是生长培养基中微生物细胞生物量
1.(Tl.5倍时，结束培养，培养结束后所得菌液培养物即为静息期的微生物细胞。
[0014]需要说明的是，配制NG3培养基时，按以下步骤配制:
(1)按NG3配方制备培养基溶液；
所述培养基溶液 采用厌氧瓶盛放；
(2)将步骤(1)制备的NG3培养基溶液置于厌氧培养箱中，加入脱氧指示剂，脱氧2(T36h ；
所述脱氧指示剂为质量分数为0.1%的刃天青溶液,添加量为500uL/L ；
(3)将步骤(2)脱氧后的培养基充入高纯氮排空氧气，然后置于灭菌锅中，待灭菌锅中水沸腾后在厌氧瓶口插上无菌针头，封闭灭菌锅，115~125°C条件下，灭菌15~30min。
[0015]将上述所制备的(DSM10061)的静息细胞与常规的利用Clostridium autoethanogenum (DSM10061)进行合成气厌氧发酵制取乙醇进行对比，发酵结果如下表。
【权利要求】
1.一种利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)将微生物菌种活化,厌氧条件下富集生长； 所述富集生长采用生长培养基，生长培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NaCl 1.(Tl.5g, NH4Cl 1.0~2.0g, KCl 0.10~0.30g，MgS040.2~0.5g, CaCl2 0.04~0.08g, KH2PO4.0.20~0.50g，酵母膏0.2~0.6g，L-cys 0.1-0.3g，MES 4~8g，微量元素溶液10mL，维生素溶液10mL，余量为水，ρΗ4.5~6.5 ； 所述微量元素溶液，以IL容量为例，配方如下=N(CH2COOH) 31.00^3.00g, MgSO4 .0.50~1.50g, (NH4)2SO4.FeSO4.6H20 0.5~1.0g, CoCl2.6H20 0.10~0.30g, ZnSO4.7H20.0.10-θ.30g, CuCl2.2H20 0.01-0.03g, NiCl2.6H20 0.01-0.03g, Na2MoO4.2H20 0.01-0.03g,Na2O4Se 0.01-0.03g, Na2WO4.2H20 0.01-0.03g，余量为水； 所述维生素溶液，以IL容量为例，配方如下=VB6 8.00~12.00g，维生素BI 4.00~6.0Og,VB2 3.00~7.0Og,泛酸钙 3.00~7.0Og,硫辛酸 4.00~6.00g, C9H11O2N 4.00~6.00g, VB3 4.00-6.00g, VB12 3.00~7.0Og,维生素 H 1.00~3.0Og,叶酸 1.00 ~3.0Og,余量为水； (2)将步骤(1)中生长稳定后的微生物菌液离心，收集细胞沉淀； 所述生长稳定为生物量稳定； 所述离心为rpm 6000~10000、10~30min ； (3)将步骤(2)收集得到细胞沉淀悬浮于NG3培养基，悬浮时，以同等体积生长培养基中离心获得的细胞沉淀悬浮于同等体积的NG3培养基计； 所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分； 厌氧培养f 2d，至NG3培养基中微生物细胞生物量是生长培养基中微生物细胞生物量.1.0-l.5倍时，结束培养，培养结束后所得菌液培养物即为静息期的微生物细胞。
2.如权利要求1所述利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述微生物菌种为-.Clostridium carboxidivorans P7、Cl os tri di um s train P11、Clos tri di um.L jungdahli i 或 Cl os tri di um au toe thanogenumDSM10061 ； 所述菌种活化采用活化培养基，活化培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NH4Cl 0.7~1.2g, NaCl 0.7~1.2g, MgCl2 0.2~0.5g, KH2PO4 0.5~0.9g, K2HPO41.0~2.0g，胰蛋白胨 I~3g,酵母膏 0.5~1.5g, FeCl3 2.0~3.0g,纤维二糖 0.5~1.5g, L-cys 0.5~0.9g,木糖 2~6g,矿质元素溶液0.5"?.5mL,余量为水； 所述矿质元素溶液，以IL容量为例，配方如下=ZnCl2 0.05~0.lg, MnCl2 0.05~0.15g，H3BO3 0.004^0.008g, CoCl2 0.1-0.3g, CuCl2 0.001-0.003g, NiCl2 0.015^0.03g, Na2MoO4.0.02~0.04g，溶于 1mLHCl 的 FeCl21.0-2.0g，余量为水。
3.如权利要求1所述利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中NG3培养基的制备包括以下步骤: (1)按NG3配方制备培养基溶液； 所述培养基溶液采用厌氧瓶盛放； (2)将步骤(1)中制备的NG3培养基溶液置于厌氧培养箱中，加入脱氧指示剂，脱氧2(T36h ；(3)将步骤(2)脱氧后的培养基充入高纯氮排空氧气，然后置于灭菌锅中，待灭菌锅中水沸腾后在厌氧 瓶口插上无菌针头，封闭灭菌锅，115~125°C条件下，灭菌15~30min。
【文档编号】C12N1/20GK104031861SQ201410243843
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】宋安东, 杨大娇, 王风芹, 谢慧, 张炎达 申请人:河南农业大学
【专利摘要】本发明属于利用微生物将合成气厌氧发酵制取乙醇【技术领域】，具体涉及一种微生物利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法。该方法包括微生物菌种活化、厌氧条件下富集生长、离心、收集细胞沉淀、重悬浮培养等步骤。本发明所提供的制备方法，培养基经过特殊优化，克服了菌液培养过程中菌体生长本身引起的干扰，制备的厌氧微生物静息细胞生长期较为一致，可以使细胞更好的进行能量代谢，从而提高将合成气转换为乙醇的转化效率，促进利用合成气转化乙醇产业化的进行。
【专利说明】利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中静息细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于利用微生物将合成气厌氧发酵制取乙醇【技术领域】，具体涉及一种微生物利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]能源是人类生存和发展的重要物质基础，也是当今国际政治、经济、军事、外交关注的焦点。能源消耗对生态环境的影响日益突出，解决好能源问题，不仅要注重供求平衡，也要关注由此带来的生态环境问题。
[0003]乙醇是一种优质的液体燃料，可单独使用，也可加入到汽油中作为一种清洁能源使用。现有技术中，利用粮食原料采用发酵方法是获得乙醇的常用方法，但由于粮食原料成本较高，因而乙醇作为燃料使用一直受限于乙醇产量的限制。利用合成气厌氧制取乙醇是近年来一个新的研究热点，也是目前认为可行性较高的方法。
[0004]合成气是指一种主要成分为C0、C02、H2和N2等气体的混合气，由煤、石油、天然气、焦炉煤气、炼厂气、污泥和生物质等转化而得。自然环境中，一些微生物可以利用合成气作为唯一碳源和能源进行生长并代谢产生乙醇，这为合成气资源的能源化利用及生物乙醇的开发提供了理论基础。
[0005]现有研究认为，能够利用合成气生产乙醇的是一类特殊的厌氧微生物。这类微生物细胞利用合成气生产乙醇时既可以是处于生物量不断增长阶段，也可以是处于生物量稳定的静息细胞阶段。
[0006]静息细胞是指没有外源营养物质供应，靠消耗内源营养物质来维系菌体的能量代谢，不进行生长繁殖，处于饥饿状态、休眠状态的细胞。静息细胞中的各种酶能够发挥作用不停地进行能量代谢，并在适宜条件下可再恢复生长。
[0007]静息细胞发酵法即是以微生物的整体细胞作为反应催化剂，具有反应条件温和、选择性强、无污染、成本低、副产物少、微生物倍增时间短、生物量积累快，单位时间产生的酶量多、转化效率高、条件容易控制、分离纯化较容易等许多正常细胞发酵法不具备的优点。因而在合成气厌氧发酵制取乙醇过程中，静息细胞期的合理应用是提高乙醇产率的重要途径。而现有技术中，尚未见到较为合适的针对微生物利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中的微生物静息细胞的制备方法。
【发明内容】
[0008]本发明目的在于提供一种微生物利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，从而大量制备整体处于静息期的微生物细胞，此阶段的微生物细胞只进行能量代谢，利于将合成气转化为乙醇。
[0009]一种利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，包括以下步骤:
(I)将微生物菌种活化,厌氧条件下富集生长；所述微生物菌种为..Clostridium carboxidi vorans P7、Clostridium strain Pl 1、Clostridium.Ljungdahlii 5? Clostridium autoethanogenum DSM10061 ；
所述菌种活化采用活化培养基，活化培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NH4Cl 0.7~1.2g, NaCl 0.7~1.2g，MgCl2 0.2~0.5g, KH2PO4 0.5~0.9g, K2HPO41.0~2.0g，胰蛋白胨 I~3g,酵母膏 0.5~1.5g, FeCl3 2.0~3.0g,纤维二糖 0.5~1.5g, L-cys 0.5~0.9g,木糖 2~6g,矿质元素溶液0.5^1.5mL，余量为水；配制培养基时，纤维二糖在培养基灭菌后过滤加入；所述矿质元素溶液，以IL容量为例，配方如下=ZnCl2 0.05~0.lg, MnCl2 0.05~0.15g，H3BO3 0.004^0.008g, CoCl2 0.1-0.3g, CuCl2 0.001-0.003g, NiCl2 0.015^0.03g, Na2MoO4
0.02~0.04g，溶于1mL HCl的FeCl21.0~2.0g，余量为水；所述水优选为去离子水；配制时，先把FeCl2溶于HCl中，再用水稀释，然后加入其它盐，最终体积定容；
所述富集生长采用生长培养基，生长培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NaCl 1.(Tl.5g, NH4Cl 1.0~2.0g，KCl 0.10~0.30g, MgSO40.2~0.5g，CaCl2 0.04~0.08g, KH2PO4
0.20~0.50g，酵母膏0.2~0.6g，L-cys 0.1-0.3g，MES 4~8g，微量元素溶液10mL，维生素溶液10mL，余量为水，pH4.5~6.5 ;配制时，pH的调节在添加MES后立即进行；
所述微量元素溶液 ，以IL容量为例，配方如下=N(CH2COOH) 31.00^3.0Og, MgSO4
0.50~1.50g, (NH4)2SO4.FeSO4.6H20 0.5~1.0g, CoCl2.6H20 0.10~0.30g, ZnSO4.7H20
0.10-θ.30g, CuCl2.2H20 0.01-0.03g, NiCl2.6H20 0.01-0.03g, Na2MoO4.2H20 0.01-0.03g,Na2O4Se (硒酸钠)0.01-0.03g, Na2WO4.2H20 0.01-0.03g，余量为水；配制时，N(CH2COOH)3 最后加入，加入后立即用10.0moI/L的NaOH溶液调节pH至5.0~7.0 ；
所述维生素溶液，以IL容量为例，配方如下=VB6 8.00~12.00g，维生素BI 4.00~6.0Og,VB2 3.00~7.00g，泛酸钙 3.00~7.00g，硫辛酸 4.00~6.0Og, C9H11O2N (苯丙氨酸)4.00~6.0Og,VB3 4.00 -6.0Og, VB12 3.00~7.0Og,维生素 H 1.00~3.0Og,叶酸 1.00 ~3.0Og,余量为水；配制时，溶液配制完成后用0.22 μ m过滤器过滤除菌；
(2)将步骤(1)中生长稳定后的微生物菌液离心，收集细胞沉淀；
所述生长稳定为生物量稳定；即生物量测定时采用紫外分光光度计在OD6tltl波长下测定时，生物量处于稳定不变状态；
所述离心为rpm600(T10000离心l(T30min ;离心时优选采用NG3培养基进行洗涤，洗涤后再离心收集沉淀，此过程重复广3次，确保生长培养基不对后续培养造成影响，以及确保收集的微生物细胞生长期较为一致；所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分；
(3)将步骤(2)收集得到细胞沉淀悬浮于NG3培养基，悬浮时，以同等体积生长培养基中离心获得的细胞沉淀悬浮于同等体积的NG3培养基计；
所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分；
厌氧培养f 2d，至NG3培养基中微生物细胞生物量是生长培养基中微生物细胞生物量
1.(Tl.5倍时，结束培养，培养结束后所得菌液培养物即为静息期的微生物细胞。
[0010]所述利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法中，NG3培养基的制备包括以下步骤:
(I)按NG3配方制备培养基溶液；
所述培养基溶液采用厌氧瓶盛放；(2)将步骤(1)制备的NG3培养基溶液置于厌氧培养箱中，加入脱氧指示剂，脱氧2(T36h ；
所述脱氧指示剂为质量分数为0.1%的刃天青溶液,添加量为500uL/L ；
(3)将步骤(2)脱氧后的培养基充入高纯氮排空氧气，然后置于灭菌锅中，待灭菌锅中水沸腾后在厌氧瓶口插上无菌针头，封闭灭菌锅，115~125°C条件下，灭菌15~30min。
[0011]本发明所提供的细胞静息期厌氧微生物的制备方法，培养基经过特殊优化，克服了菌液培养过程中菌体生长本身引起的干扰，制备的厌氧微生物静息细胞生长期较为一致，可以使细胞更好地进行能量代谢，从而提高将合成气转换为乙醇的转化效率，促进利用合成气转化乙醇产业化的进行。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例
[0013]\^%'备 Clostridium autoethanogenum DSM10061 的静息期细胞为例，具体制备方法包括以下步骤:
(I)实脸奮取Clostridium autoethanogenum DSM10061购买自德国菌种保藏中心，将购买的菌株活化，在厌氧箱内厌氧条件下富集生长；富集生长过程中，每12h取样，样品用紫外分光光度计在OD6tltl波长下测定，待生长稳定后再进行下一步操作；富集培养约96h后，微生物细胞进入生长稳定期，生物量稳定不再增长；
所述菌种活化采用活化培养基，活化培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NH4Cl 0.7~1.2g, NaCl 0.7~1.2g，MgCl2 0.2~0.5g, KH2PO4 0.5~0.9g, K2HPO41.0~2.0g，胰蛋白胨 I~3g,酵母膏 0.5~1.5g, FeCl3 2.0~3.0g,纤维二糖 0.5~1.5g, L-cys 0.5~0.9g,木糖 2~6g,矿质元素溶液0.5^1.5mL，余量为水；配制培养基时，纤维二糖在培养基灭菌后过滤加入；所述矿质元素溶液，以IL容量为例，配方如下=ZnCl2 0.05~0.lg, MnCl2 0.05~0.15g，H3BO3 0.004^0.008g, CoCl2 0.1~0.3g, CuCl2 0.001~0 .003g, NiCl2 0.015^0.03g, Na2MoO4
0.02~0.04g，溶于1mL HCl的FeCl21.0~2.0g，余量为水；所述水优选为去离子水；配制时，先把FeCl2溶于HCl中，再用水稀释，然后加入其它盐，最终体积定容；
所述富集生长采用生长培养基，生长培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NaCl 1.(Tl.5g, NH4Cl 1.0~2.0g，KCl 0.10~0.30g, MgSO40.2~0.5g，CaCl2 0.04~0.08g, KH2PO4
0.20~0.50g，酵母膏0.2~0.6g，L-cys 0.1~θ.3g，MES 4~8g，微量元素溶液10mL，维生素溶液10mL，余量为水，pH4.5~6.5 ;配制时，pH的调节在添加MES后立即进行；
所述微量元素溶液，以IL容量为例，配方如下=N(CH2COOH) 31.00^3.00g, MgSO4
0.50~1.50g, (NH4)2SO4.FeSO4.6H20 0.5~1.0g, CoCl2.6H20 0.10~0.30g, ZnSO4.7H200.10-θ.30g, CuCl2.2H20 0.01~0.03g, NiCl2.6H20 0.01~0.03g, Na2MoO4.2H20 0.01~0.03g,Na2O4Se 0.01`0.03g, Na2WO4.2Η20 0.01~0.03g，余量为水；配制时，N(CH2COOH) 3 最后加入，加入后立即用10.0moI/L的NaOH溶液调节pH至5.0~7.0 ；
所述维生素溶液，以IL容量为例，配方如下=VB6 8.00~12.00g，维生素BI 4.00~6.0Og,VB2 3.00~7.0Og,泛酸钙 3.00~7.0Og,硫辛酸 4.00~6.00g, C9H11O2N 4.00~6.00g, VB3 4.00-6.0Og, VB12 3.00~7.0Og,维生素H 1.00~3.0Og,叶酸1.00~3.0Og,余量为水；配制时，溶液配制完成后用0.22 μ m过滤器过滤除囷；
(2)将步骤(1)中生长稳定后的微生物菌液离心，收集细胞沉淀；
所述生长稳定为生物量稳定；生物量测定时采用紫外分光光度计在OD6tltl波长下测定；所述离心为rpm600(T10000离心l(T30min ;离心时优选采用NG3培养基进行洗涤，洗涤后再离心收集沉淀，此过程重复广3次，确保生长培养基不对后续培养造成影响，以及确保收集的微生物细胞生长期较为一致；所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分；
(3)将步骤(2)收集得到细胞沉淀悬浮于NG3培养基，悬浮时，按一瓶(80mL/瓶)生长培养基离心沉淀获得的细胞悬浮于一瓶(80mL/瓶)NG3培养基计，
所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分；
厌氧培养f 2d，至NG3培养基中微生物细胞生物量是生长培养基中微生物细胞生物量
1.(Tl.5倍时，结束培养，培养结束后所得菌液培养物即为静息期的微生物细胞。
[0014]需要说明的是，配制NG3培养基时，按以下步骤配制:
(1)按NG3配方制备培养基溶液；
所述培养基溶液 采用厌氧瓶盛放；
(2)将步骤(1)制备的NG3培养基溶液置于厌氧培养箱中，加入脱氧指示剂，脱氧2(T36h ；
所述脱氧指示剂为质量分数为0.1%的刃天青溶液,添加量为500uL/L ；
(3)将步骤(2)脱氧后的培养基充入高纯氮排空氧气，然后置于灭菌锅中，待灭菌锅中水沸腾后在厌氧瓶口插上无菌针头，封闭灭菌锅，115~125°C条件下，灭菌15~30min。
[0015]将上述所制备的(DSM10061)的静息细胞与常规的利用Clostridium autoethanogenum (DSM10061)进行合成气厌氧发酵制取乙醇进行对比，发酵结果如下表。
【权利要求】
1.一种利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)将微生物菌种活化,厌氧条件下富集生长； 所述富集生长采用生长培养基，生长培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NaCl 1.(Tl.5g, NH4Cl 1.0~2.0g, KCl 0.10~0.30g，MgS040.2~0.5g, CaCl2 0.04~0.08g, KH2PO4.0.20~0.50g，酵母膏0.2~0.6g，L-cys 0.1-0.3g，MES 4~8g，微量元素溶液10mL，维生素溶液10mL，余量为水，ρΗ4.5~6.5 ； 所述微量元素溶液，以IL容量为例，配方如下=N(CH2COOH) 31.00^3.00g, MgSO4 .0.50~1.50g, (NH4)2SO4.FeSO4.6H20 0.5~1.0g, CoCl2.6H20 0.10~0.30g, ZnSO4.7H20.0.10-θ.30g, CuCl2.2H20 0.01-0.03g, NiCl2.6H20 0.01-0.03g, Na2MoO4.2H20 0.01-0.03g,Na2O4Se 0.01-0.03g, Na2WO4.2H20 0.01-0.03g，余量为水； 所述维生素溶液，以IL容量为例，配方如下=VB6 8.00~12.00g，维生素BI 4.00~6.0Og,VB2 3.00~7.0Og,泛酸钙 3.00~7.0Og,硫辛酸 4.00~6.00g, C9H11O2N 4.00~6.00g, VB3 4.00-6.00g, VB12 3.00~7.0Og,维生素 H 1.00~3.0Og,叶酸 1.00 ~3.0Og,余量为水； (2)将步骤(1)中生长稳定后的微生物菌液离心，收集细胞沉淀； 所述生长稳定为生物量稳定； 所述离心为rpm 6000~10000、10~30min ； (3)将步骤(2)收集得到细胞沉淀悬浮于NG3培养基，悬浮时，以同等体积生长培养基中离心获得的细胞沉淀悬浮于同等体积的NG3培养基计； 所述NG3培养基与生长培养基相比，缺少CaCl2和酵母膏成分； 厌氧培养f 2d，至NG3培养基中微生物细胞生物量是生长培养基中微生物细胞生物量.1.0-l.5倍时，结束培养，培养结束后所得菌液培养物即为静息期的微生物细胞。
2.如权利要求1所述利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述微生物菌种为-.Clostridium carboxidivorans P7、Cl os tri di um s train P11、Clos tri di um.L jungdahli i 或 Cl os tri di um au toe thanogenumDSM10061 ； 所述菌种活化采用活化培养基，活化培养基为液体培养基，以IL容量为例，配方如下:NH4Cl 0.7~1.2g, NaCl 0.7~1.2g, MgCl2 0.2~0.5g, KH2PO4 0.5~0.9g, K2HPO41.0~2.0g，胰蛋白胨 I~3g,酵母膏 0.5~1.5g, FeCl3 2.0~3.0g,纤维二糖 0.5~1.5g, L-cys 0.5~0.9g,木糖 2~6g,矿质元素溶液0.5"?.5mL,余量为水； 所述矿质元素溶液，以IL容量为例，配方如下=ZnCl2 0.05~0.lg, MnCl2 0.05~0.15g，H3BO3 0.004^0.008g, CoCl2 0.1-0.3g, CuCl2 0.001-0.003g, NiCl2 0.015^0.03g, Na2MoO4.0.02~0.04g，溶于 1mLHCl 的 FeCl21.0-2.0g，余量为水。
3.如权利要求1所述利用合成气厌氧发酵制取乙醇过程中微生物静息细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中NG3培养基的制备包括以下步骤: (1)按NG3配方制备培养基溶液； 所述培养基溶液采用厌氧瓶盛放； (2)将步骤(1)中制备的NG3培养基溶液置于厌氧培养箱中，加入脱氧指示剂，脱氧2(T36h ；(3)将步骤(2)脱氧后的培养基充入高纯氮排空氧气，然后置于灭菌锅中，待灭菌锅中水沸腾后在厌氧 瓶口插上无菌针头，封闭灭菌锅，115~125°C条件下，灭菌15~30min。
【文档编号】C12N1/20GK104031861SQ201410243843
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】宋安东, 杨大娇, 王风芹, 谢慧, 张炎达 申请人:河南农业大学
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