一种γ-亚麻酸产生菌及其应用的制作方法
一种γ-亚麻酸产生菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种γ-亚麻酸产生菌及其应用，其分类命名为雅致小克银汉霉（Cunningnamellaelegans）CLA-N2-V，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCM2014191，本发明以离子束诱变，摇瓶发酵筛选获γ-亚麻酸产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株CLA-N2-V，该菌株可较大幅度提高发酵产物中γ-亚麻酸组分并减少其他组分，且遗传稳定性良好。该菌株利用玉米淀粉为发酵碳源，在5L发酵罐中发酵产γ-亚麻酸产量可达2273μg/mL，可应用于工业生产并大幅度提高发酵单位，具有重大的经济应用价值。
【专利说明】-种γ-亚麻酸产生菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种亚麻酸产生菌及其应用。
【背景技术】
[0002] Υ -亚麻酸（Y-linolenic acid)是一系列多不饱和脂肪酸的一个重要分支。根 据脂肪酸碳链的长短不同，可分为长链脂肪酸，中链脂肪酸和短链脂肪酸，碳链长度为 18的γ -亚麻酸则属于长链脂肪酸的一种。根据饱和度来判断，又可将脂肪酸分为饱和 脂肪酸（Saturated fatty acid)、一价多不饱和脂肪酸（Monoursaturated fatty acid)、 多不饱和脂肪酸（Polysaturated fatty acid)三种。作为一种人体必不可少的脂肪酸， 它是人体中多个重要反应的中间产物，例如由亚油酸转化，可生成前列腺素和白细胞介 素等的前体物质。由于对于中老年人，它可以起到增强其身体抵抗力的功效。
[0003] Y -亚麻酸（Y -linolenic acid)是一种人体必需的对其产生多种生理功能的多 稀不饱和脂肪酸。它是参与人体多种生化反应，并与人体代谢和生长发育息息相关的一 种重要中间物质。具有广泛的医用实用价值。目前国际上常用的方法是从植物种子油中提 取Y -亚麻酸；另一种是通过丝状真菌发酵产生。而近些年，由于不受环境影响，成本相 对较低等特点，亚麻酸的发展方向越来越侧重于工业化发酵的研究。本专利以亚 麻酸（Y -linolenic acid)生产菌种小克银汉霉菌为研究 对象，从菌种诱变到菌种筛选，以及发酵工艺优化等方面对小克银汉霉菌 )进行多方面的研究。
[0004] 目前，国内外已有利用霉菌进行亚麻酸发酵的报道，如专利CN103484382A 公开了一种高产亚麻酸的突变株及制备方法和应用，利用深黄被孢霉进行发酵生产 亚麻酸。但这些方法大都产量不高，且发酵产物中杂酸偏多，不利于后道提取分离。因 此研究一种适于工业生产的Y-亚麻酸生产途径具有很好的研究意义和很大的发展空间。
【发明内容】
[0005] 为了解决目前的小克银汉霉菌亚麻酸产量低，无法满足工业化生产的问题， 本发明提供一种亚麻酸产生菌及其应用。
[0006] 本发明采用的技术方案如下： 一种亚麻酸产生菌，其分类命名为雅致小克银汉霉 CLA-N2-V已于2014年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO: Μ 2014191,地址：中国武汉武汉大学。
[0007] 本发明所述的亚麻酸产生菌雅致小克银汉霉 CLA-N2-V的诱变筛选方法是：将γ -亚麻酸出发菌株雅致小克银汉霉（ CLA-N2,经离子束诱变后，通过摇瓶发酵筛选获得γ -亚麻酸产量高的菌株作 为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出Y -亚麻酸产量高的目标菌株 雅致小克银汉霉CLA-N2-V，形态学及生理生化学特征如下： 菌落颜色：灰白色。
[0008] 需氧方式：好氧生长。
[0009] 菌落大小：6?8 mm η
[0010] 适宜生长温度：27°C。
[0011] 适宜生长 pH :6. 5。
[0012] 菌体形态：圆形菌落，无光泽。
[0013] 本发明所提供的亚麻酸产生菌的诱变方法，具体步骤如下： (a)、单孢子悬浮液制备：将出发菌株雅致小克银汉霉() CLA-N2孢子制成孢子悬液，镜检无细胞重叠。
[0014] (b)、低能氮离子注入诱变：取0. lmL的步骤（a)中单孢子悬液均匀涂布于无菌空 平皿上，以无菌风吹干，在l(Tl8KeV、注入剂量为40 X 1014?240 X 1014ions/cm2下，对雅致小 克银汉霉CLA-N2进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用lmL无菌水 洗脱，涂布到固体培养基上，在26?30°C下倒置培养24?48h。
[0015] (c)、诱变菌株的筛选： 筛选：将步骤（b)诱变得到的固体单菌落接入种子培养基，在培养温度26~30°C， 20(T220rpm摇床转速下扩大培养24~48h后，按5~15%(v/v)的接种量接入发酵培养基。在 26?30°C、20(T220rpm摇床转速下培养192h下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高 速离心lOmin，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混勻器上震荡30min ;3500rpm高速离心 lOmin，取上清液测定发酵液中γ -亚麻酸含量。取发酵液γ -亚麻酸含量最高的菌株作为 下次诱变的出发菌株，重复步骤（a) ~(c)，直至筛选出亚麻酸产量高的目标菌株雅致 小克傲汉霉 QCunningnamel laelegans) ClA-WZ-N。
[0016] 步骤（b)中所用的固体培养基为葡萄糖2.0%，马铃薯2%，琼脂1.5%，pH 6. 5,其 余为水。
[0017] 步骤（b)中低能氮离子注入，优选诱变能量为16KeV，诱变剂量为160X1014ions/ cm2。
[0018] 步骤（c)中所用的种子培养基为：碳源4· 0%?6· 0%、氮源1 · 0%?3· 0%、无机盐 0. 1°/Γ〇. 6%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中的一种或两种的 混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐 中的一种或几种的混合。
[0019] 步骤（c)中所用的发酵培养基为：碳源8.09Γ10.0%、氮源L09T3.0%、无机盐 0. 19Π ). 6%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉中的一种或两种的混 合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中 的一种或几种的混合。
[0020] 上述筛选出的雅致小克银汉霉CLA-N2-V在发酵生产 亚麻酸中的应用， 具体步骤如下： 1) 、固体培养：将雅致小克银汉霉CLA-N2-V接种于固体培 养基上，培养温度为27°C，培养时间为48h ; 2) 、种子培养：将步骤1)固体培养的雅致小克银汉霉（) CLA-N2-V接种到种子培养基中，培养温度为27°C，200rpm转速下培养48h ; 3)、发酵培养：将步骤2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)， 培养温度为27°C，200rpm转速下发酵192h。
[0021] 步骤1)所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2. 09Γ4.0%、氮源 0. 59Γ1. 5%、琼脂1. 29Γ1. 8%、其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中 的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合。
[0022] 步骤2)所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4. 09Γ6.0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、无机盐0. 39Π ). 9%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉 中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐 为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
[0023] 步骤3)所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源8. 09Γ15. 0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、无机盐0. 39Γ1. 5%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉 中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐 为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1 :实施例2发酵液中Y -亚麻酸色谱图。
[0025] 有益效果 本发明采用离子束诱变，最终筛选获得一株亚麻酸产生菌雅致小克银汉霉 CLA-N2-V，可较大幅度提高发酵产物中γ-亚麻酸组分且遗传 稳定性好，菌株连续传代5次后效价并无明显变化。在5L发酵罐中，以廉价玉米淀粉为碳 源，发酵产亚麻酸产量达到2273 μ g/mL，相比原始出发菌株提高了 21. 9%，同时也超过 国内外目前有报道的发酵产量最高的菌株(产量在1800 μ g/mL左右)。本技术发明完全符 合工业化Y -亚麻酸生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大 的社会意义和经济价值。
【具体实施方式】
[0026] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0027] 实施例1 本实施例说明将雅致小克银汉霉CLA-N2 进行诱变的方法。
[0028] 以实验室保存的雅致小克银汉霉CLA-N2为出发菌 株，进行诱变，具体步骤如下： (a)、单孢子悬浮液制备：取26~30°C恒温固体培养24~48h的小克银汉霉菌加无菌水 10mL，刮洗下孢子倾于带有玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm)，打散孢子 链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。
[0029] (b)、低能氮离子注入诱变：取0. lmL的步骤（a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空 平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入 机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下对小克银汉霉菌进行离子注入。注入剂量 分别为 40X 1014ions/cm2、80X 1014ions/cm2、120X 1014ions/cm2、160X 1014ions/cm2、 200X 1014ions /cm2、240X 1014ions/cm2。靶室真空度为 10_3Pa，以 5S 脉冲式注入，间隔 15s，靶室内放置不接受注入的对照样。确定诱变能量16KeV，诱变剂量160X1014ion S/cm2 为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用lml无菌水 洗脱，涂布到固体培养基上，在24?30°C下倒置培养36飞Oh。
[0030] (C)筛选：将步骤（b)诱变得到的固体单菌落接入种子培养基，在培养温度 26?30°C，20(T220rpm摇床转速下扩大培养24?48h后，按5?15%(v/v)的接种量接入发酵培 养基。在26~30°C、20(T220rpm摇床转速下培养192h下摇床，取3mL发酵液于离心管中， 3500rpm高速离心lOmin，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混勻器上震荡30min ;3500rpm 高速离心lOmin，取上清液测定发酵液中γ-亚麻酸含量。取发酵液γ-亚麻酸含量最高的 菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤（a) ~(c)，直至筛选出番茄红素产量高的目标菌 株雅致小克银汉霉)CLA_N2_V。
[0031] 步骤（b)中所用的固体培养基为葡萄糖2.0%，马铃薯2%，琼脂1.5%，pH 6. 5,其 余为水。
[0032] 步骤（c)中所用的种子培养基为：葡萄糖6. 0%，酵母粉1.0%，NaN03 0. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 3%, MgS04 · 7H20 0· 03%，pH 6· 5,其余为水。
[0033] 步骤（c)中所用的发酵培养基为：葡萄糖10. 0%，酵母粉1. 5%，NaN03 0. 5%， ΚΗ2Ρ04 0· 3%, MgS04 · 7H20 0· 03%，pH 6. 5,其余为水。
[0034] 实施例2本实施例说明高产菌株雅致小克银汉霉CLA-N2-V发酵生产γ -亚麻酸 的工艺。
[0035] 本实施例所用的培养基配方： 固体培养基为：葡萄糖2. 0%，马铃薯2%，琼脂1. 5%，pH 6. 5,其余为水； 种子培养基为：葡萄糖 6. 0%，酵母粉 1. 0%，NaN03 0. 5%, ΚΗ2Ρ04 0. 3%, MgS04 · 7H20 0.03%，pH 6.5,其余为水； 发酵培养基为：葡萄糖 10. 〇%，酵母粉 1. 5%，NaN03 0. 5%, ΚΗ2Ρ04 0. 3%, MgS04 · 7H20 0.03%，pH 6.5,其余为水； 将小克银汉霉菌CLA-N2-V接种于固体培养基上，培养温度为27°C，培养时间为48h ;将 固体培养的小克银汉霉菌CLA-N2-V培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为 30mL，培养温度为27°C，200rpm转速下培养48h ;将种子培养液接种到发酵培养基中，初始 pH为6. 5,接种量为10%(v/v)，500mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为27°C，200rpm摇 床转速下培养发酵168h。发酵产γ-亚麻酸产量为2097 μ g/mL，相对于原始出发菌株提高 了 18. 6%。
[0036] 实施例3本实施例说明突变株的形态学及生理生化学特征和传代稳定性 雅致小克银汉霉CLA-N2-V，形态学及生理生化学特征如下：菌落颜色：灰白色；需氧方 式：好氧生长；菌落大小：6~8mm ;适宜生长温度：27°C ;适宜生长pH :6. 5 ;菌体形态：圆形菌 落，无光泽。
[0037] 在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中（发酵培养条件同实施例2)，检测突变株小克 银汉CLA-N2-V产量，观察期传代稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示： 表1高产突变菌株小克银汉CLA-N2-V稳定性试验
【权利要求】
1. 一种γ-亚麻酸产生菌，其分类命名为雅致小克银汉霉 CLA-N2-V，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO: Μ 2014191。
2. 权利要求1所述的Υ-亚麻酸产生菌在发酵生产Υ-亚麻酸中的应用。
3. 根据权利要求2所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在 于包含如下步骤： 1) 、固体培养：将雅致小克银汉霉CLA-N2-V接种于固体培 养基上，培养温度为27°C，培养时间为48h ; 2) 、种子培养：将步骤1)固体培养的雅致小克银汉霉（ CLA-N2-V接种到种子培养基中，培养温度为27°C，200rpm转速下培养48h ; 3) 、发酵培养：将步骤2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)， 培养温度为27°C，200rpm转速下发酵168?192h。
4. 根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在 于：步骤1)所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2. 09Γ4. 0%、氮源0. 59Γ1. 5%、 琼脂1. 29Γ1. 8%、其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和马铃薯中的一种或两种 的混合；所述氮源为马铃薯、麦芽浸粉和酵母膏中的至少一种。
5. 根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在 于：步骤2)所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4. 09Γ6. 0%、氮源1. 09Γ3. 0%、 无机盐0. 39Π ). 9%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中的一种 或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾 盐、镁盐中的一种或几种的混合。
6. 根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特 征在于：步骤3)所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源8. 09Γ15. 0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、无机盐0. 39Γ1. 5%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉 中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐 为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
【文档编号】C12R1/645GK104195049SQ201410243977
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】虞龙, 张旭琛, 黄思思, 陈晓双 申请人:南京工业大学
【专利摘要】本发明公开了一种γ-亚麻酸产生菌及其应用，其分类命名为雅致小克银汉霉（Cunningnamellaelegans）CLA-N2-V，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCM2014191，本发明以离子束诱变，摇瓶发酵筛选获γ-亚麻酸产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株CLA-N2-V，该菌株可较大幅度提高发酵产物中γ-亚麻酸组分并减少其他组分，且遗传稳定性良好。该菌株利用玉米淀粉为发酵碳源，在5L发酵罐中发酵产γ-亚麻酸产量可达2273μg/mL，可应用于工业生产并大幅度提高发酵单位，具有重大的经济应用价值。
【专利说明】-种γ-亚麻酸产生菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种亚麻酸产生菌及其应用。
【背景技术】
[0002] Υ -亚麻酸（Y-linolenic acid)是一系列多不饱和脂肪酸的一个重要分支。根 据脂肪酸碳链的长短不同，可分为长链脂肪酸，中链脂肪酸和短链脂肪酸，碳链长度为 18的γ -亚麻酸则属于长链脂肪酸的一种。根据饱和度来判断，又可将脂肪酸分为饱和 脂肪酸（Saturated fatty acid)、一价多不饱和脂肪酸（Monoursaturated fatty acid)、 多不饱和脂肪酸（Polysaturated fatty acid)三种。作为一种人体必不可少的脂肪酸， 它是人体中多个重要反应的中间产物，例如由亚油酸转化，可生成前列腺素和白细胞介 素等的前体物质。由于对于中老年人，它可以起到增强其身体抵抗力的功效。
[0003] Y -亚麻酸（Y -linolenic acid)是一种人体必需的对其产生多种生理功能的多 稀不饱和脂肪酸。它是参与人体多种生化反应，并与人体代谢和生长发育息息相关的一 种重要中间物质。具有广泛的医用实用价值。目前国际上常用的方法是从植物种子油中提 取Y -亚麻酸；另一种是通过丝状真菌发酵产生。而近些年，由于不受环境影响，成本相 对较低等特点，亚麻酸的发展方向越来越侧重于工业化发酵的研究。本专利以亚 麻酸（Y -linolenic acid)生产菌种小克银汉霉菌为研究 对象，从菌种诱变到菌种筛选，以及发酵工艺优化等方面对小克银汉霉菌 )进行多方面的研究。
[0004] 目前，国内外已有利用霉菌进行亚麻酸发酵的报道，如专利CN103484382A 公开了一种高产亚麻酸的突变株及制备方法和应用，利用深黄被孢霉进行发酵生产 亚麻酸。但这些方法大都产量不高，且发酵产物中杂酸偏多，不利于后道提取分离。因 此研究一种适于工业生产的Y-亚麻酸生产途径具有很好的研究意义和很大的发展空间。
【发明内容】
[0005] 为了解决目前的小克银汉霉菌亚麻酸产量低，无法满足工业化生产的问题， 本发明提供一种亚麻酸产生菌及其应用。
[0006] 本发明采用的技术方案如下： 一种亚麻酸产生菌，其分类命名为雅致小克银汉霉 CLA-N2-V已于2014年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO: Μ 2014191,地址：中国武汉武汉大学。
[0007] 本发明所述的亚麻酸产生菌雅致小克银汉霉 CLA-N2-V的诱变筛选方法是：将γ -亚麻酸出发菌株雅致小克银汉霉（ CLA-N2,经离子束诱变后，通过摇瓶发酵筛选获得γ -亚麻酸产量高的菌株作 为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出Y -亚麻酸产量高的目标菌株 雅致小克银汉霉CLA-N2-V，形态学及生理生化学特征如下： 菌落颜色：灰白色。
[0008] 需氧方式：好氧生长。
[0009] 菌落大小：6?8 mm η
[0010] 适宜生长温度：27°C。
[0011] 适宜生长 pH :6. 5。
[0012] 菌体形态：圆形菌落，无光泽。
[0013] 本发明所提供的亚麻酸产生菌的诱变方法，具体步骤如下： (a)、单孢子悬浮液制备：将出发菌株雅致小克银汉霉() CLA-N2孢子制成孢子悬液，镜检无细胞重叠。
[0014] (b)、低能氮离子注入诱变：取0. lmL的步骤（a)中单孢子悬液均匀涂布于无菌空 平皿上，以无菌风吹干，在l(Tl8KeV、注入剂量为40 X 1014?240 X 1014ions/cm2下，对雅致小 克银汉霉CLA-N2进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用lmL无菌水 洗脱，涂布到固体培养基上，在26?30°C下倒置培养24?48h。
[0015] (c)、诱变菌株的筛选： 筛选：将步骤（b)诱变得到的固体单菌落接入种子培养基，在培养温度26~30°C， 20(T220rpm摇床转速下扩大培养24~48h后，按5~15%(v/v)的接种量接入发酵培养基。在 26?30°C、20(T220rpm摇床转速下培养192h下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高 速离心lOmin，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混勻器上震荡30min ;3500rpm高速离心 lOmin，取上清液测定发酵液中γ -亚麻酸含量。取发酵液γ -亚麻酸含量最高的菌株作为 下次诱变的出发菌株，重复步骤（a) ~(c)，直至筛选出亚麻酸产量高的目标菌株雅致 小克傲汉霉 QCunningnamel laelegans) ClA-WZ-N。
[0016] 步骤（b)中所用的固体培养基为葡萄糖2.0%，马铃薯2%，琼脂1.5%，pH 6. 5,其 余为水。
[0017] 步骤（b)中低能氮离子注入，优选诱变能量为16KeV，诱变剂量为160X1014ions/ cm2。
[0018] 步骤（c)中所用的种子培养基为：碳源4· 0%?6· 0%、氮源1 · 0%?3· 0%、无机盐 0. 1°/Γ〇. 6%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中的一种或两种的 混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐 中的一种或几种的混合。
[0019] 步骤（c)中所用的发酵培养基为：碳源8.09Γ10.0%、氮源L09T3.0%、无机盐 0. 19Π ). 6%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉中的一种或两种的混 合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中 的一种或几种的混合。
[0020] 上述筛选出的雅致小克银汉霉CLA-N2-V在发酵生产 亚麻酸中的应用， 具体步骤如下： 1) 、固体培养：将雅致小克银汉霉CLA-N2-V接种于固体培 养基上，培养温度为27°C，培养时间为48h ; 2) 、种子培养：将步骤1)固体培养的雅致小克银汉霉（) CLA-N2-V接种到种子培养基中，培养温度为27°C，200rpm转速下培养48h ; 3)、发酵培养：将步骤2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)， 培养温度为27°C，200rpm转速下发酵192h。
[0021] 步骤1)所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2. 09Γ4.0%、氮源 0. 59Γ1. 5%、琼脂1. 29Γ1. 8%、其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中 的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合。
[0022] 步骤2)所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4. 09Γ6.0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、无机盐0. 39Π ). 9%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉 中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐 为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
[0023] 步骤3)所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源8. 09Γ15. 0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、无机盐0. 39Γ1. 5%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉 中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐 为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1 :实施例2发酵液中Y -亚麻酸色谱图。
[0025] 有益效果 本发明采用离子束诱变，最终筛选获得一株亚麻酸产生菌雅致小克银汉霉 CLA-N2-V，可较大幅度提高发酵产物中γ-亚麻酸组分且遗传 稳定性好，菌株连续传代5次后效价并无明显变化。在5L发酵罐中，以廉价玉米淀粉为碳 源，发酵产亚麻酸产量达到2273 μ g/mL，相比原始出发菌株提高了 21. 9%，同时也超过 国内外目前有报道的发酵产量最高的菌株(产量在1800 μ g/mL左右)。本技术发明完全符 合工业化Y -亚麻酸生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大 的社会意义和经济价值。
【具体实施方式】
[0026] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0027] 实施例1 本实施例说明将雅致小克银汉霉CLA-N2 进行诱变的方法。
[0028] 以实验室保存的雅致小克银汉霉CLA-N2为出发菌 株，进行诱变，具体步骤如下： (a)、单孢子悬浮液制备：取26~30°C恒温固体培养24~48h的小克银汉霉菌加无菌水 10mL，刮洗下孢子倾于带有玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm)，打散孢子 链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。
[0029] (b)、低能氮离子注入诱变：取0. lmL的步骤（a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空 平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入 机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下对小克银汉霉菌进行离子注入。注入剂量 分别为 40X 1014ions/cm2、80X 1014ions/cm2、120X 1014ions/cm2、160X 1014ions/cm2、 200X 1014ions /cm2、240X 1014ions/cm2。靶室真空度为 10_3Pa，以 5S 脉冲式注入，间隔 15s，靶室内放置不接受注入的对照样。确定诱变能量16KeV，诱变剂量160X1014ion S/cm2 为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用lml无菌水 洗脱，涂布到固体培养基上，在24?30°C下倒置培养36飞Oh。
[0030] (C)筛选：将步骤（b)诱变得到的固体单菌落接入种子培养基，在培养温度 26?30°C，20(T220rpm摇床转速下扩大培养24?48h后，按5?15%(v/v)的接种量接入发酵培 养基。在26~30°C、20(T220rpm摇床转速下培养192h下摇床，取3mL发酵液于离心管中， 3500rpm高速离心lOmin，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混勻器上震荡30min ;3500rpm 高速离心lOmin，取上清液测定发酵液中γ-亚麻酸含量。取发酵液γ-亚麻酸含量最高的 菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤（a) ~(c)，直至筛选出番茄红素产量高的目标菌 株雅致小克银汉霉)CLA_N2_V。
[0031] 步骤（b)中所用的固体培养基为葡萄糖2.0%，马铃薯2%，琼脂1.5%，pH 6. 5,其 余为水。
[0032] 步骤（c)中所用的种子培养基为：葡萄糖6. 0%，酵母粉1.0%，NaN03 0. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 3%, MgS04 · 7H20 0· 03%，pH 6· 5,其余为水。
[0033] 步骤（c)中所用的发酵培养基为：葡萄糖10. 0%，酵母粉1. 5%，NaN03 0. 5%， ΚΗ2Ρ04 0· 3%, MgS04 · 7H20 0· 03%，pH 6. 5,其余为水。
[0034] 实施例2本实施例说明高产菌株雅致小克银汉霉CLA-N2-V发酵生产γ -亚麻酸 的工艺。
[0035] 本实施例所用的培养基配方： 固体培养基为：葡萄糖2. 0%，马铃薯2%，琼脂1. 5%，pH 6. 5,其余为水； 种子培养基为：葡萄糖 6. 0%，酵母粉 1. 0%，NaN03 0. 5%, ΚΗ2Ρ04 0. 3%, MgS04 · 7H20 0.03%，pH 6.5,其余为水； 发酵培养基为：葡萄糖 10. 〇%，酵母粉 1. 5%，NaN03 0. 5%, ΚΗ2Ρ04 0. 3%, MgS04 · 7H20 0.03%，pH 6.5,其余为水； 将小克银汉霉菌CLA-N2-V接种于固体培养基上，培养温度为27°C，培养时间为48h ;将 固体培养的小克银汉霉菌CLA-N2-V培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为 30mL，培养温度为27°C，200rpm转速下培养48h ;将种子培养液接种到发酵培养基中，初始 pH为6. 5,接种量为10%(v/v)，500mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为27°C，200rpm摇 床转速下培养发酵168h。发酵产γ-亚麻酸产量为2097 μ g/mL，相对于原始出发菌株提高 了 18. 6%。
[0036] 实施例3本实施例说明突变株的形态学及生理生化学特征和传代稳定性 雅致小克银汉霉CLA-N2-V，形态学及生理生化学特征如下：菌落颜色：灰白色；需氧方 式：好氧生长；菌落大小：6~8mm ;适宜生长温度：27°C ;适宜生长pH :6. 5 ;菌体形态：圆形菌 落，无光泽。
[0037] 在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中（发酵培养条件同实施例2)，检测突变株小克 银汉CLA-N2-V产量，观察期传代稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示： 表1高产突变菌株小克银汉CLA-N2-V稳定性试验
【权利要求】
1. 一种γ-亚麻酸产生菌，其分类命名为雅致小克银汉霉 CLA-N2-V，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO: Μ 2014191。
2. 权利要求1所述的Υ-亚麻酸产生菌在发酵生产Υ-亚麻酸中的应用。
3. 根据权利要求2所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在 于包含如下步骤： 1) 、固体培养：将雅致小克银汉霉CLA-N2-V接种于固体培 养基上，培养温度为27°C，培养时间为48h ; 2) 、种子培养：将步骤1)固体培养的雅致小克银汉霉（ CLA-N2-V接种到种子培养基中，培养温度为27°C，200rpm转速下培养48h ; 3) 、发酵培养：将步骤2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)， 培养温度为27°C，200rpm转速下发酵168?192h。
4. 根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在 于：步骤1)所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2. 09Γ4. 0%、氮源0. 59Γ1. 5%、 琼脂1. 29Γ1. 8%、其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和马铃薯中的一种或两种 的混合；所述氮源为马铃薯、麦芽浸粉和酵母膏中的至少一种。
5. 根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在 于：步骤2)所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4. 09Γ6. 0%、氮源1. 09Γ3. 0%、 无机盐0. 39Π ). 9%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中的一种 或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾 盐、镁盐中的一种或几种的混合。
6. 根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特 征在于：步骤3)所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源8. 09Γ15. 0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、无机盐0. 39Γ1. 5%，其余为水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉 中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐 为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
【文档编号】C12R1/645GK104195049SQ201410243977
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】虞龙, 张旭琛, 黄思思, 陈晓双 申请人:南京工业大学
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