病毒纯化的制作方法

病毒纯化的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于生产反转录病毒或慢病毒载体制剂的方法，该方法包括过滤除菌步骤，其中该过滤除菌步骤不是纯化方法中的最后步骤。
【专利说明】病毒纯化
[0001]本申请为分案申请，原申请的申请号为200980132555.9，申请日为2009年6月18日，发明名称为“病毒纯化”。
发明领域
[0002]本发明涉及反转录病毒载体生产和纯化的改进方法。
[0003]发明背景
[0004]基因治疗技术的成功有赖于能够以对人体安全的方式实现转移的基因的充分表达。反转录病毒常常用作递送系统(或者称为递送介质或递送载体)，用来(尤其是)将某种目的核苷酸(NOI)或多种目的核苷酸转移到一个或多个目的位点。人们对慢病毒载体系统的开发也表现出极大的兴趣，因为慢病毒能够感染非分裂细胞(Lewis&Emerman(1993)J.Virol.68:510) 0另外，慢病毒载体使得目的基因能够得到非常稳定的长期表达。对于体内转导的大鼠神经元细胞来说，这已证实为至少一年(Bienemann等人.(2003)Mol.Ther.5:588)。
[0005]载体纯化过程是临床基因转移治疗中的一个重要步骤,就纯度和滴度而言与安全性和功效直接相关。在大多数小规模的实验应用中，可采用离心技术通过相对简单的方法来浓缩和纯化载体。但是，将纯化方法进行放大以便为临床使用进行大规模生产，这是一个重大挑战。具体地讲，当考虑生产人用载体时，必须采取诸如过滤除菌的额外步骤来确保载体制品的纯度和安全性。
[0006]载体制备方法一般包括从稳定或短暂产生载体的细胞获取载体和使用例如色谱法纯化病毒载体。在工业过程中，最后一个步骤是灭菌步骤，并且在灭菌步骤之前通常使用至少一个超滤步骤以浓缩病毒载体和/或交换保持病毒载体的缓冲液。
[0007]有几个出版物描述了从细胞纯化病毒，其中大多数讨论了使用特异性色谱基质来从细胞裂解物纯化病毒。例如，美国专利N0.6，261，823和美国专利N0.5，661，023公开了包括使用单独的阴离子交换树脂的方法，而美国专利5，837，520公开了阴离子交换接着是亲和色谱的这样一种相续组合。Yamada等人证实用阴离子交换HPLC纯化慢病毒载体能使基因转移得到改善(Yamada 等人.(2003) Biotechniques34 (5): 1074-8，1080)。
[0008]仍需要能产出纯产品而又能保持高滴度的大规模反转录病毒载体纯化方法。本发明解决了这个需求。
[0009]发明概沭
[0010] 我们证明了，出乎意料的是，当过滤除菌步骤不是生产过程中的最后步骤时，可实现生产反转录病毒和慢病毒载体制剂的改进方法。具体地讲，我们发现了在浓缩步骤(例如通过超滤)之后进行过滤除菌步骤会导致病毒载体滴度相当大的损失。这是出乎预料的，因为反转录病毒颗粒的直径在80-120nm的范围内，因此它们应当容易通过除菌过滤器的孔道；对于含有载体的细胞培养物上清液来说这的确如此，这种上清液进行常规过滤没有观察到功能滴度的损失。因此不清楚为什么一旦载体制品经过了加工就不再可能做到对制品进行过滤除菌而又不损失回收率。[0011]此外，我们出乎预料地发现，如果在过滤除菌步骤之后进行最后的浓缩步骤，可获得载体颗粒收率的增加。这与确立的病毒生产方法是相反的，在这些生产方法中浓缩步骤传统上是在过滤除菌步骤之前进行的。我们还发现了，在过滤除菌之前例如通过稀释载体颗粒制品来维持合适的载体颗粒浓度，也能改进载体颗粒收率。出乎预料的是，在该方法中的一些阶段中降低载体颗粒浓度可实际上最终导致产品收率提高。
[0012]应理解，可通过无菌稀释由本发明方法生产的制剂来生产较低剂量的制剂。本发明的生产方法优选是用于生产适合作为治疗剂给予人体的临床级制剂的大规模方法。
[0013]本文所述的反转录病毒和慢病毒载体制剂优选适合作为治疗剂给予人体。
[0014]本发明的第一方面提供包括过滤除菌步骤的反转录病毒或慢病毒载体制剂生产方法，其中该过滤除菌步骤不是该生产方法中的最后步骤。
[0015]优选地，反转录病毒载体是慢病毒载体。
[0016]优选地，过滤除菌步骤在浓缩步骤之前进行。
[0017]优选地，浓缩步骤是该方法中的最后步骤，而过滤除菌步骤是该方法中的倒数第二个步骤。
[0018]优选地，浓缩步骤用超滤、优选切向流过滤、更优选中空纤维超滤来进行。
[0019]优选地，过滤除菌步骤用最大孔径大小为约0.22 μ m的除菌过滤器进行。在另一个优选的实施方案中，最大孔径大小为0.2μπι。
[0020]在优选的实施方案中，为使EIAV颗粒的回收率达到最佳，在过滤除菌之前载体浓度应小于或等于约4.6χ10η个RNA基因组拷贝/ml制品。该适当浓度水平可通过使用例如稀释步骤(如果适当的话)控制载体浓度来实现。因此，在一个实施方案中，在过滤除菌之前将反转录病毒载体制品进行稀释。因此，如果技术人员碰到载体颗粒回收率低于预期的情况，他应考虑在过滤除菌之前先降低载体颗粒的浓度。实现最佳回收率的适当滴度水平可用下文(具体而言实施例部分)描述的技术来确定。
[0021]本发明的第二方面提供生产反转录病毒载体制剂的方法，该方法按时间顺序包括以下步骤⑴至(vi):
[0022](i)培养能产生反转录病毒载体的细胞；
[0023](ii)收获含有反转录病毒载体的上清液；
[0024](iii)任选澄清上清液；
[0025](iv)纯化反转录病毒载体以得到反转录病毒载体制品；
[0026](V)对反转录病毒载体制品进行过滤除菌；和
[0027](vi)浓缩反转录病毒载体制品以生产出最终的批量产品。
[0028]在一个实施方案中，该方法不包括澄清步骤(iii)。
[0029]在另一个实施方案中，该方法确实包括澄清步骤(iii)。
[0030]优选地，步骤(vi)用超滤、或切向流过滤、更优选中空纤维超滤来进行。
[0031]优选地，步骤(iv)中的纯化方法是离子交换色谱，更优选是阴离子交换色谱。
[0032]优选地,步骤(V)中的过滤除菌用0.22 μ m或0.2 μ m除菌过滤器进行。
[0033]优选地，步骤(iii)通过过滤澄清来进行。
[0034] 优选地，步骤(iv)用选自色谱、超滤/渗滤或离心的方法或这些方法的组合来进行。[0035]优选地，色谱方法或方法组合选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、反相色谱和固定化金属离子亲和色谱。
[0036]优选地，离心方法选自区带离心、等密度离心和粒化离心(pelletingcentrifugation)。
[0037]优选地，超滤/渗滤方法选自切向流渗滤、搅拌池渗滤(stirred celldiafiltration)和透析。
[0038]优选地，在本发明方法中包括至少一个用以降解核酸以改善纯化的步骤。
[0039]优选地，所述步骤是核酸酶处理。
[0040]优选地，所述核酸酶是Benzonase?核酸酶。
[0041]优选地，(一个或多个)核酸降解步骤在本发明方法中的到步骤(iv)为止(包括步骤(iv)在内)的任何(一个或多个)时间点进行。
[0042]优选地，该方法的纯化步骤(iv)包括缓冲液交换步骤。
[0043]优选地，该方法的纯化步骤(Vi)用超滤进行。
[0044]优选地，超滤包括切向流过滤。
[0045]优选地，超滤包括中空纤维超滤。
[0046]优选地，该方法的步骤(V)中的过滤除菌用最大孔径大小为约0.22 μ m的除菌过
滤器进行。
[0047]优选地，缓冲液交换包括以制剂缓冲液交换前面的步骤所用的缓冲液。
[0048]优选地，制剂缓冲液是含有糖类的pH缓冲的盐溶液。
[0049]优选地，缓冲液是基于TRIS的缓冲液。
[0050]在一个实施方案中，在进行过滤除菌之前先稀释载体颗粒浓度。
[0051]优选地，反转录病毒载体是慢病毒载体。
[0052]更优选地，慢病毒载体是非灵长类动物慢病毒载体。
[0053]更优选地，慢病毒载体衍自EIAV。当慢病毒载体衍自EIAV时，过滤除菌之前载体颗粒制品中的EIAV颗粒的载体浓度小于或等于4.6χ10η个RNA基因组拷贝/ml。
[0054]优选地，反转录病毒载体包含目的核苷酸。
[0055]优选地，本发明的生产方法用于生产反转录病毒载体制剂，其中该反转录病毒载体制剂适合给予患者。患者可以是人或动物。在一个实施方案中，反转录病毒载体制剂适合给予患者的眼睛。在另一个实施方案中，反转录病毒载体制剂适合给予患者的大脑。
[0056]在一些实施方案中，所述生产方法用于生产反转录病毒载体制剂，其中该反转录病毒载体制剂适合通过注射给予患者。在一个实施方案中，反转录病毒载体制剂适合直接注射到视网膜下，任选在人或动物的眼睛的玻璃体切除术之后注射。在另一个实施方案中，反转录病毒载体制剂适合直接注射到人或动物的大脑的纹状体中。
[0057]在一些实施方案中，所述生产方法用于生产反转录病毒载体制剂，其中该反转录病毒载体制剂适合离体给予。
[0058]在其他实施方案中，所述生产方法用于生产反转录病毒载体制剂，其中该反转录病毒载体制剂适合给予可从患者获取的细胞。
[0059]本发明的第四方面提供可通过本发明的方法获得的反转录病毒载体制剂。在一些实施方案中，反转录病毒载体制剂供用于基因治疗。还提供了反转录病毒载体制剂在制备基因治疗用药物中的用途。
[0060]附图简沭
[0061]图1是反转录病毒载体生产方法的示意图。
[0062]发明详沭
[0063]现将通过非限制性的例子描述本发明的各个优选特征和实施方案。
[0064]除非另有指明，否则本发明的实施将釆用到化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术在文献中有说明。参见例如 J.Sambrook, E.F.Fritsch 和 T.Maniatis (1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual，第二片反，第 1-3 册，Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Ausubel, F.M.等人.(1995 年和定期增补本)Current Protocols in Molecular Biology,第 9、13 和 16 章，John Wiley&Sons,纽约，纽约州;B.Roe，J.Crabtree 和 A.Kahn (1996)DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques，John Wiley&Sons ；J.M.Polak和 James 0’ D.McGee(1990) In Situ Hybridization:Principles and Practice，OxfordUniversity Press ；M.J.Gait (编辑)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach, IRL Press ；以及 D.M.J.Lilley 和 J.E.Dahlberg (1992)Methods of Enzymology:DNA Structure Part A !Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press.Roe, Simon(编辑)，Protein Purification Techniques.第 2 片反.牛津:Oxford University Press，2001 ;Sofer，Gail 和 Hagel，Lars.Handbook of ProcessChromatography:A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation.伦敦和圣迭哥:Academic Press，1997 ； Janson, Jan-Christer 和 Ryden，Lars (编辑).ProteinPurification:Principles, High Resolution Methods，and Applications.第 2 片反.组约:John Wiley&Sons, Inc.，1998 ；Masters, John R.W.(编辑).Animal Cell Culture:APractical Approach.第 3 版.牛津:0xford University Press，2000。这些通用教科书的每一个都通过引用并入本文。
[0065]多核苷酸
[0066]用于本发明的多核苷酸可包含DNA或RNA序列。它们可以是单链的或双链的。技术人员会理解，由于遗传密码的简并性，有许多不同的多核苷酸可编码同一多肽。另外，应理解，技术人员可使用常规技术作出不会影响用于本发明的多核苷酸所编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达多肽的任何具体宿主生物的密码子用法。多核苷酸可通过本领域可获得的任何方法进行修饰。可进行这类修饰以提高本发明的多核苷酸的体内活性或寿命。
[0067]多核苷酸如DNA多核苷酸可用重组法产生、合成法产生或本领域技术人员可获得的任何方法产生。它们还可通过标准的技术进行克隆。
[0068]通常将使用重组方法来产生较长的多核苷酸，例如使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这将 涉及到制备一对能侧接于需要克隆的序列区域的引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与从动物细胞或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在能引起该需要的区域的扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)和回收扩增的DNA。可将引物设计成含有合适的限制性内切核酸酶识别位点，使得扩增的DNA可被克隆到合适的克隆载体中。[0069]蛋白质
[0070]本文所用的术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物，在所述复合物中各个组成多肽通过共价方式或非共价方式连接。本文所用的术语“多肽”和“肽”指其中单体为氨基酸并通过肽键或二硫键连接在一起的聚合物。
[0071]变体、衍生物、类似物、同源物和片段
[0072]除了本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖变体、衍生物、类似物、同源物和它们的片段的使用。
[0073]在本发明的情况中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中各残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的具体序列已在所涉及的多肽或多核苷酸能保持其内源功能中的至少一种的前提下进行过改变。可通过对天然蛋白质中存在的至少一个残基进行添加、缺失、取代、修饰、替代和/或变异，来获得变体序列。
[0074]与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用术语“衍生物”包括对序列的一个(或多个)氨基酸残基进行的任何取代、变异、修饰、替代、缺失和/或添加，只要所产生的蛋白质或多肽能保持其内源功能中的至少一种。
[0075]与多肽或多核苷酸相关的本文所用术语“类似物”包括任何模拟物，即这样的化合物，它具有其所模拟的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种。
[0076]通常，可例如从1、2或3至10或20个取代作出氨基酸取代，只要被修饰的序列能保持所需的活性或能力。氨基酸取代可包括非天然类似物的使用。
[0077]用于本发明的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或取代，即缺失、插入或取代能产生不活跃的变化而导致功能上等同的蛋白质。还可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性的基础上作出谨慎的氨基酸取代，只要转运或调控功能得以保持。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；含具有相似亲水性值的无电荷极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
[0078]保守取代可例如按下表作出。第二列同一格中的氨基酸、优选地第三列同一行中的氨基酸可互相取代:
【权利要求】
1.一种生产反转录病毒载体制剂的方法，所述方法包括过滤除菌步骤，其中所述过滤除菌步骤不是该生产方法中的最终步骤，其中所述过滤除菌步骤在浓缩步骤之前进行，其中所述浓缩步骤是该方法中的最后步骤，所述过滤除菌步骤是该方法中的倒数第二个步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述浓缩步骤用超滤来进行。
3.权利要求2的方法，其中所述超滤包括切向流过滤。
4.权利要求2或3的方法，其中所述超滤包括中空纤维超滤。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述过滤除菌步骤用最大孔径大小最多为或等于约0.22 μ m的除菌过滤器进行。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中将包含反转录病毒载体的制品先稀释再进行过滤除菌步骤。
7.一种用于生产反转录病毒载体制剂的方法，该方法按时间顺序包括以下步骤(i)至(vi): 培养能产生反转录病毒载体的细胞； 收获含有反转录病毒载体的上清液； 任选澄清上清液； 纯化反转录病毒载体以得到反转录病毒载体制品； 对反转录病毒载体制品进行过滤除菌；和 浓缩反转录病毒载体制品以生产出最终的批量产品。
8.权利要求7的方法，其中步骤(iv)用选自色谱法、超滤/渗滤或离心的方法或方法组合来进行。
9.权利要求8的方法，其中所述色谱方法选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱和反相色谱、固定化金属离子亲和色谱。
10.权利要求8的方法，其中所述离心方法选自区带离心、等密度离心和粒化离心。
【文档编号】C12N15/867GK103993040SQ201410244813
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2009年6月18日 优先权日:2008年6月18日
【发明者】R.特鲁兰, R.巴克利, P.拉德克利夫, J.米斯金, K.米特罗法诺斯 申请人:牛津生物医学（英国）有限公司