一种聚合物整体柱及其制备方法与在制备酶反应器中的应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  2

【专利下载】Tel:18215660330

一种聚合物整体柱及其制备方法与在制备酶反应器中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种聚合物整体柱及其制备方法与在制备酶反应器中的应用。一种聚合物整体柱的制备方法,包括如下步骤:(1)惰性气氛下,在色谱管中,交联剂在催化剂Ⅰ的作用下经原子转移自由基聚合得到聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱;(2)共聚单体在所述聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱中进行电子转移催化再生原子转移自由基聚合,即得所述聚合物整体柱。本发明操作简单、反应时间快,可调控柱体表面作用位点及柱体的亲疏水性。本发明进一步公开了一种聚合物整体柱胰蛋白酶反应器的制备方法,包括如下步骤:将键合液流经上述聚合物整体柱,经开环反应即得。本发明所提供的酶反应器能实现高效快速的蛋白酶解。
【专利说明】一种聚合物整体柱及其制备方法与在制备酶反应器中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种聚合物整体柱及其制备方法与在制备酶反应器中的应用,属于聚合物整体柱及其酶固定领域。
【背景技术】
[0002]蛋白质组学作为后基因时代的新技术已受到人们越来越多的关注。在研究蛋白质组学的各种方法中,对蛋白质进行酶解是鉴定蛋白质的必要前提和重要步骤。传统的游离酶存在着自酶解、酶解时间较长以及操作复杂等局限性。为了实现快速高效的蛋白酶解,常用的改进方法是将酶固定于不同的材料上,从而制备得到固定化酶反应器。聚合物整体柱是一类由单体、引发剂、交联剂和致孔剂的混合物通过原位制备而成的棒状整体,其内部所具有的大孔和中孔使其具有良好的通透性,同时还可以减少多路径效应和加快传质,从而提高酶解效率。因此,聚合物整体柱是固定化酶反应器的理想载体。
[0003]目前,聚合物整体柱酶反应器的制备大多采用普通自由基聚合法,由于其引发温度较高,在制备过程通常在油浴中进行,其操作复杂且耗时。此外,自由基聚合体系不可控,会造成柱体表面固定化酶作用位点不均一等缺陷,从而使酶解效率降低。原子转移自由基聚合因其反应条件温和且接枝聚合物链长可控而备受青睐,因此,需要提供一种通过两步原子转移自由基聚合来制备聚合物整体柱酶反应器的新方法。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一种聚合物整体柱及其制备方法与在制备酶反应器中的应用,本发明通过两步原子转移自由基聚合得到聚合物链修饰的聚合物整体柱,具体通过在聚合物整体柱进行表面接枝实现对柱体表面酶固定作用位点及亲疏水性质的调控;本发明制备的聚合物整体柱可用于胰蛋白酶的固定。
[0005]本发明提供的一种聚合物整体柱的制备方法,包括如下步骤:
[0006](I)惰性气氛下,在色谱柱管中,交联剂在催化剂I的作用下经原子转移自由基聚合得到聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱;
[0007]所述交联剂可为二甲基丙烯酸乙二醇酯;
[0008]所述催化剂I可为溴化亚铜与1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺的混合物;
[0009](2)共聚单体在所述聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱中进行电子转移催化再生原子转移自由基聚合,即得到所述聚合物整体柱;
[0010]所述共聚单体可为寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯。
[0011]上述制备方法,步骤(1)中,所述原子转移自由基聚合在引发剂和致孔剂存在的条件下进行;
[0012]所述引发剂可为2-溴丙酸乙酯;
[0013]所述致孔剂可为甲醇和正己烷的混合液;所述甲醇和所述正己烷的体积比可为I~5:1,具体可为1:1 ;
[0014]所述二甲基丙烯酸乙二醇酯、所述1,I, 4,7,7-五甲基二亚乙基三胺、所述溴化亚铜、所述2-溴丙酸乙酯与所述甲醇和正己烷的摩尔比可为I~100:3:3:1:820:250,具体可为 17:3:3:1:820:250o
[0015]上述制备方法,步骤(1)中,所述原子转移自由基聚合的反应温度可为20°C~25°C,具体可为25°C ;反应时间可为12h~24h,具体可为24h ;
[0016]上述制备方法,步骤(1)中,所述色谱柱管的规格可为:内径为4.6mm,长度为50mmo
[0017]上述制备方法,步骤(2)中,所述电子转移催化再生原子转移自由基聚合在催化剂II和还原剂存在的条件下进行;
[0018]所述催化剂II可为溴化铜与1,I, 4,7,7-五甲基二亚乙基三胺的混合物;
[0019]所述还原剂可为辛酸亚锡(Sn(Oct)2);
[0020]所述溴化铜、所 述1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺和所述辛酸亚锡的质量比可为 34:26:125 ;
[0021]上述制备方法,步骤(2)中,所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯与所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的体积比可为0.00~1.50:0.35~1.50,但所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯的添加量不为零,具体可为 0.76:1.50,0.76:0.76,0.76:0.35,0.35:0.76 和 1.50:
0.76 ;
[0022]所述溴化铜与所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯的摩尔比可为1:1~100,具体可为 1:11.3。
[0023]上述制备方法,步骤(2)中,所述电子转移催化再生原子转移自由基聚合的反应温度可为25°C~50°C,具体可为37°C ;反应时间可为Ih~12h,具体可为4h。
[0024]上述制备方法,步骤(2)中,所述电子转移催化再生原子转移自由基聚合可按照下述步骤进行:将所述共聚单体、所述催化剂II和所述还原剂超声混合后流经步骤(1)制得的聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱,可控制流速为0.10mL/min ;反应完毕后,可用去离子水通入柱子去除柱体中未反应的共聚单体。
[0025]本发明制备方法中,步骤(2)是利用步骤(1)制备的聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱柱体表面存在的溴原子,通过表面诱导的电子转移催化再生原子转移自由基聚合进行接枝聚合物链:寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯与甲基丙酸缩水甘油酯经共聚得到;其中,所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯为一种亲水性单体,能够为胰蛋白酶固定化酶反应器提供较为亲水的环境;所述甲基丙烯酸缩水甘油酯为一种功能性单体,在柱体表面能够为固定胰蛋白酶提供作用位点。因此,可以通过调控两种单体的体积比实现对柱体表面亲疏水性质的调控。
[0026]本发明进一步提供了上述制备方法制备的聚合物整体柱。
[0027]本发明制备的聚合物整体柱可用于制备聚合物整体柱胰蛋白酶反应器。
[0028]本发明进一步提供了一种聚合物整体柱胰蛋白酶反应器的制备方法,包括如下步骤:
[0029]将键合液流经上述聚合物整体柱,经开环反应即得到聚合物整体柱胰蛋白酶反应器;[0030]所述键合液的流速可为0.05mL/min ;
[0031]所述键合液由胰蛋白酶和盐酸苯甲醚分散于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液得到;
[0032]所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的pH值为8.7 ;
[0033]所述键合反应的温度为25°C ;键合时间为24h。
[0034]上述开环反应具体是利用胰蛋白酶中含有的氨基与甲基丙烯酸缩水甘油酯中的环氧基进行的共价键合。
[0035]上述胰蛋白酶的制备方法中,所述开环之前,用所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液平衡(冲洗)聚合物整体柱lh,即先将所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液冲洗所述聚合物整体柱;所述开环反应之后,用氯化钠溶液冲洗已键合的整体柱2h,以去除非特异性吸附在柱体上的胰蛋白酶。
[0036]本发明进一步提供了上述制备方法制备的聚合物整体柱胰蛋白酶反应器。
[0037]本发明提供的聚合物整体柱胰蛋白酶反应器可用于蛋白酶解;
[0038]所述蛋白可为细胞色素C、牛血清蛋白和/或溶菌酶。
[0039]本发明的优点如下:
[0040]1、本发明采用原子转移自由基聚合的方法制备聚合物整体柱,具有操作简单、反应时间快速的优点。
[0041]2、本发明所采用的表面诱导的电子转移催化再生原子转移自由基聚合为调控柱体表面作用位点以及柱体的亲疏水性提供了简单有效的方法。
[0042]3、采用本发明所提供的聚合物整体柱胰蛋白酶反应器能实现高效快速的蛋白酶解。
【专利附图】

【附图说明】
[0043]图1是实施例中I中聚合物整体柱胰蛋白酶反应器的制备流程图。
[0044]图2是聚合物整体柱表面接枝前后的扫描电镜照片,其中,图2 (A-1)和图2(A_2)均表示聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱(聚合物整体柱B’接枝前)的扫描电镜照片,图2(B-1)和图2(B-2)均表示聚合物整体柱B’的扫描电镜照片。
[0045]图3是实施例4中疏水性分析物在不同亲水性含量聚合物整体柱上的保留时间。
[0046]图4是实施例6中聚合物整体柱酶反应器的底物浓度的倒数-酶反应速率倒数的关系曲线。
【具体实施方式】
[0047]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0048]下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0049]实施例1、聚合物整体柱胰蛋白酶反应器的制备
[0050](I)聚合物整体柱的制备
[0051]I)聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱的制备
[0052]将二甲基丙烯酸乙二醇酯(0.5mL,0.26mmol),2_溴丙酸乙酯(EBP) (1.9L,
0.015mmol),溴化亚铜(6.5mg,0.045mmol),甲醇(0.5mL)和正己烧(0.5mL)置于带有橡皮塞的容器中,超声使其混合均匀。通入氮气IOmin后,用注射器将1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA) (9.2L,0.045mmol)加入至上述混合液中,继续超声IOs使其混合均匀。将此反应液用注射器迅速注入不锈钢色谱柱管(50mmX4.6mm1.d.)中,在25°C下反应24h,得到聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱。
[0053]2)聚合物整体柱的制备(聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱的表面接枝)
[0054]将溴化铜(34mg,0.15mmol),1,1,4,7,7_ 五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)(32L, 0.15mmol),寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA) (0.76mL, 1.7mmol),甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA) (0.76mL, 5.8mmol)和20mL去离子水加入烧杯中,并超声使其混合均匀。然后将0.1OmL辛酸亚锡(纯度:95% )用注射器加入上述混合液中,继续超声使其形成均匀溶液。随后将得到的反应液以0.lOmL/min的流速流经聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱,在37°C下反应4h后,将去离子水通入柱子去除柱体中未反应的单体,得到接枝后的聚合物整体柱,其中单体寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯与单体甲基丙烯酸缩水甘油酯的体积比为0.76/0.76,此聚合物整体柱记为B’ (0.76/0.76)。 [0055]按照上述I)和2)步骤相同的方法制备其它组成的聚合物整体柱,不同之处在于:改变2)步骤中寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和基丙烯酸缩水甘油酯的投料量,分别得到如下聚合物整体柱:A’ (0.76/1.50)、C,(0.76/0.35)、D,(0.00/0.76)、E,(0.35/0.76)和F,(1.50/0.76)。
[0056](2)聚合物整体柱胰蛋白酶反应器的制备(胰蛋白酶的固定)
[0057]在50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(pH8.7)中配制1.0mg/mL胰蛋白酶,并加入酶抑制剂盐酸苯甲醚(50mM),得到键合液。在固定胰蛋白酶之前,用50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(PH8.7)冲洗上述制备的聚合物整体柱B’ lh。然后,将键合液以0.05mL/min流速流经柱子,在25°C下反应24h。用0.50M氯化钠溶液冲洗已键合的整体柱2h,以去除非特异性吸附在柱体上的胰蛋白酶,得到胰蛋白酶反应器,标记为B(0.76/0.76)。
[0058]按照上述的方法,将聚合物整体柱B’ (0.76/0.76)分别替换为A’ (0.76/1.50)、C’ (0.76/0.35)、D’ (0.00/0.76)、E’ (0.35/0.76)和 F’ (1.50/0.76),分别制备得到胰蛋白酶反应器 A (0.76/1.50)、C (0.76/0.35)、D (0.00/0.76)、E (0.35/0.76)和 F (1.50/0.76)。
[0059]实施例2、聚合物整体柱的接枝前后的扫描电镜表征
[0060]实验条件:扫描电镜扩大倍数,(图2(A_1),图2(B-1)) X2000,(图2 (A-2),图2(B-2))X4000。
[0061]实验结果如图2所示,图2表明接枝聚合物链后,聚合物整体柱形貌发生了变化,柱体结构被压缩,孔径尺寸有所减小,此结果证明聚合物链已成功接枝于整体柱表面。
[0062]实施例3、聚合物整体柱渗透性考察
[0063]色谱条件:流动相,甲醇;流速,0.2mL/min ;检测波长,254nm ;色谱柱,实施例1制备的亲水性单体含量不同的聚合物整体柱A’~F’。
[0064]实验结果如表1所示:
[0065]表1聚合物整体柱的渗透性
【权利要求】
1.一种聚合物整体柱的制备方法,包括如下步骤: (1)惰性气氛下,在色谱管中,交联剂在催化剂I的作用下经原子转移自由基聚合得到聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱; 所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯; 所述催化剂I为溴化亚铜与1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺的混合物; (2)共聚单体在所述聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)整体柱中进行电子转移催化再生原子转移自由基聚合,即得到所述聚合物整体柱; 所述共聚单体为寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述原子转移自由基聚合在引发剂和致孔剂存在的条件下进行; 所述引发剂为2-溴丙酸乙酯; 所述致孔剂为甲醇和正己烷的混合液; 所述二甲基丙烯酸乙二醇酯、所述1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺、所述溴化亚铜、所述2-溴丙酸乙酯与所述甲醇和正己烷的摩尔比为I~100:3:3:1:820:250。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述原子转移自由基聚合的反应温度为20°C~25°C,反应时间为12h~24h。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述电子转移催化再生原子转移自由基聚合在催化剂II和还原剂存在的条件下进行; 所述催化剂II为溴化铜与1,1,4, 7,7-五甲基二亚乙基三胺的混合物; 所述还原剂为辛酸亚锡; 所述溴化铜、所述1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺和所述辛酸亚锡的质量比为34:26:125 ; 所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯与所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的体积比为0.00~1.50:0.35~1.50,但所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯的添加量不为零; 所述溴化铜与所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯的摩尔比为1:1~100。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述电子转移催化再生原子转移自由基聚合的反应温度可以为25°C~50°C,反应时间为Ih~12h。
6.权利要求1-5中任一项所述方法制备的聚合物整体柱。
7.一种聚合物整体柱胰蛋白酶反应器的制备方法,包括如下步骤: 将键合液流经权利要求6所述聚合物整体柱,经开环反应即得到聚合物整体柱胰蛋白酶反应器; 所述键合液由胰蛋白酶和盐酸苯甲醚分散于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液得到; 所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的PH值为8.7。
8.权利要求7所述制备方法制备的聚合物整体柱胰蛋白酶反应器。
9.权利要求6所述聚合物整体柱在制备聚合物整体柱胰蛋白酶反应器中的应用。
10.权利要求8所述的聚合物整体柱胰蛋白酶反应器在蛋白酶解中的应用; 所述蛋白为细胞色素C、牛血清蛋白和/或溶菌酶。
【文档编号】C12P21/06GK104004141SQ201410245118
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】齐莉, 李楠, 沈莹, 乔娟 申请人:中国科学院化学研究所

最新回复(0)