早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱及诊断模型的制作方法
早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱及诊断模型的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱，由表达上调的miR-152，miR-148b-3p，以及表达下调的miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p,miR-30a-5p构成。所述早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如SEQIDNO：1～13所示。本发明还提供了一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型，利用以下公式：logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)计算，用于膀胱癌的早期诊断，经ROC曲线分析，此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学,此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和T1)。
【专利说明】早期膀胱癌血清m i RNAs特异表达谱及诊断模型
【技术领域】
[0001]本发明涉及早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱，其逆转录引物和检测引物，以及诊断模型，属于医学诊断【技术领域】。
【背景技术】
[0002]膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在我国其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤的首位，且近年有逐渐上升的趋势。20% -30%的膀胱癌病人初诊时已发生肌层浸润，而在最初诊断为非侵袭性膀胱癌的病人中，约15%的膀胱癌病人五年内发展为侵袭性膀胱癌。因此，早期诊断和早期治疗是改善膀胱癌预后、降低死亡率的关键。目前，用于膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜、尿脱落细胞学及影像学检查等。膀胱镜检查虽然具有较高的诊断效能，但该检查方法的有创性限制了其在膀胱癌筛查中的广泛应用；尿液脱落细胞学检查虽特异性较高，但敏感性较低，尤其对低分级肿瘤的敏感性仅为20%~40%，且易受监测这主观因素的影响；CT和超声检查不易发现膀胱内较小的病变，对膀胱癌分期预测具有一定的有限性。寻找临敏感性高和特异性高的早期肿瘤标志物，建立一种安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是临床亟待解决的难题。
[0003]MicroRNA(miRNAs)是一类广泛分布于真核生物的高度保守的、非蛋白编码的单链小分子RNAs，通过对靶mRNA降解或翻译抑制，在转录后水平调节靶基因的表达，进而调控细胞分化、生长、代谢和凋亡等功能。以往研究证实，miRNAs在肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在密切的联系。近年来研究发现，血清中存在丰富且稳定的miRNAs，通过对比分析肿瘤患者和对照组血清中miRNAs表达谱，发现不同肿瘤具有其特定的miRNAs表达谱，为肿瘤的无创性早期诊断提供了新的依据。因此，确定膀胱癌miRNAs特异表达谱，筛选差异表达的miRNAs，建立膀胱癌血清miRNAs诊断模型，有助于实现对膀胱癌的早期诊断。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术的不足，本发明提供了膀胱癌患者血清miRNA特异表达谱，及其逆转录引物和检测引物、检测试剂盒，以及诊断模型，为临床上膀胱癌的早期发现和早期治疗提供支持。
[0005]为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0006]一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，由上调表达的miR-152, miR-148b_3p以及下调表达的 miR-3187_3p, miR-15b_5p, miR-27a_3p, miR-30a_5p 构成。
[0007]所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
[0008]所述膀胱癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物,如下:
[0009] ((l)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:2所示:[0010]SEQIDNO: I:
[0011 ] 5 ’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3，；
[0012]SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ；
[0013](2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
[0014]SEQIDNO:3:
[0015]5， -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3，；
[0016]SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ；
[0017](3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
[0018]SEQIDNO:5:
[0019]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’ ；
[0020]SEQIDNO:6:5，-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3，；
[0021](4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
[0022]SEQIDNO:7:
[0023]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’ ；
[0024]SEQIDNO:8:5，-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3，；
[0025](5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
[0026]SEQIDNO:9:
[0027]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’ ；
[0028]SEQIDNO:10:5，-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3，；
[0029](6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
[0030]SEQIDNO: 11:
[0031]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
[0032]SEQIDNO:12:5，-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3，；
[0033](7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
[0034]SEQIDNO:13:5，-TGGTGTCGTGGAGTCG-3，。
[0035]一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，包括上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物。
[0036]一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型。具体如下:运用以下公式计算:
[0037]1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0038]公式中的“(miR-152) ”、“(miR-148b_3p) ”、“ (miR-3187_3p) ”、“miR-15b_5p) ”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
[0039]一种利用上述诊断模型诊断的方法，如下:首先，利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物测定待诊断患者的血清中六种miRNAs的表达量，包括miR-152，miR-148b-3p, miR-3187_3p，miR-15b_5p，miR-27a_3p 和 miR-30a_5p，然后，运用下述公式计算:
[0040]logit (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0041]将六种miRNAs的表达量分别输入Matlab软件(该软件为所属领域的常规软件，为现有技术中已有的软件)，若1git (P = BC)为1，可以判断为膀胱癌；若1git (P = BC)为0，判断为非膀胱癌。
[0042]本发明首先基于临床常规收集的非侵袭性膀胱癌患者、侵袭性膀胱癌患者及对照者血清样本筛查差异表达miRNAs的技术路径，采用“miRNAscDNA文库+文库预扩增+Miseq深度测序”的研究策略，对三组血清标本中miRNAs表达谱进行了比对分析，共筛查出26个差异表达miRNAs，序列见表1。然后采用SYBRGreen的逆转录-实时荧光定量PCR方法，对上述26个差异表达miRNAs在膀胱癌患者及对照血清中的表达丰度进行验证，最终确定了与膀胱癌相关的6个miRNAs，包括表达上调的miR-152，miR-148b_3p以及下调表达的miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p，miR-30a-5p，且自主设计了其反转录引物和前向反向检测引物，具体见表2。进而，提供了一种诊断膀胱癌的血清miRNAs表达模型:利用多元logistic回归方法提供了一种膀胱癌血清miRNAs诊断模型的计算公式:
[0043]1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0044]ROC曲线分析显示，此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学，此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和Tl)。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1:六种miRNAs在膀胱癌组和对照组中的表达，其中，A:miR-152 ；B:miR-148b_3p ；C:miR-3187_3p ；D:miR-15b_5p ；E:miR-27a_3p ；F:miR-30a_5p。
[0046]图2:六种 miRNAs 对膀胱癌的诊断 ROC 曲线，其中，A:miR-152 ；B:miR-148b-3p ；C:miR-3187_3p ；D:miR-15b_5p ；E:miR-27a_3p ；F:miR-30a_5p。
[0047]图3:建立的诊断模型(panel)及尿液脱落细胞学对膀胱癌的诊断ROC曲线。
[0048]图4:建立的诊断模型对不同分期膀胱癌的诊断ROC曲线，其中，A:Ta ；B:T1 ；C:T2-T4。
[0049]图2、3、4中，横坐标:特异性；纵坐标:敏感性。
【具体实施方式】
[0050]以下结合实施例和实验对本发明作详细的说明。
[0051]实施例一
[0052]1、研究对象
[0053] 血清标本共来自经受试者同意的175例膀胱癌患者(BC)和165例排除泌尿系肿瘤的对照者。所有膀胱癌患者均来自山东大学齐鲁医院(以下称本院)泌尿外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经膀胱镜检查或术后病理检查确认。对照者包括37名前列腺良性增生患者，25名尿路结石患者，19名膀胱炎患者和84名健康者。其中，获取75名膀胱癌患者、16名前列腺良性增生患者、13名尿路结石患者、8名膀胱炎患者和38名健康者的尿液标本。所有血清和尿液标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。
[0054]2、标本采集
[0055]采集血清3ml，立即1600g离心5分钟，然后16000g离心10分钟，将分离上清液保存于-80°c待测。取3 μ I分离上清液与3 μ IRNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清，将上清1:10稀释用于逆转录模板。留取中段尿15ml,立即1300g离心10min,取沉洛瑞氏染色进行尿液脱落细胞学检查。
[0056]4、文库构建和Miseq测序
[0057]取冻存样本于常温下解冻,按miRNeasyMiniKit试剂盒(Qiagen公司)操作者说明提取血清总RNA，总RNA浓缩后经T4RNA连接酶作用，分别连接3’-1inker和5’_linker，然后通过RT-PCR技术扩增建库。使用KAPAqPCR试剂盒检测文库，若qPCR浓度大于InM且无dimer污染则确定为检测合格。文库检测符合要求后，通过Miseq测序仪进行深度测序分析。比对分析测序后获得的序列和miRNA数据库(miRBasel7.0)中人miRNA序列，获取三组样本已知miRNA的表达丰度。
[0058]5、RT_qPCR
[0059]使用One Step PrimeScript? miRNA cDNA SynthesisKit 逆转录试剂盒(Takara 公司)反转录上述mRNA成cDNA，再进行PCR反应，运行于ABI7500实时荧光定量PCR分析仪(ABI公司)。
[0060]PCR 反应体系(25 μ I):
[0061]模板DNA: 2u I
[0062]SYBRPremixExTaq II: 12.5 μ I
[0063]Dye I1:0.5 μ I
[0064]上游引物(10μ Μ):1 μ I
[0065]下游引物(10μ Μ):1 μ I
[0066]无菌水:8μ1
[0067]反应条件为:95°C 30秒一I个循环；(95°C 5秒，57°C 34秒)一45个循环；添加
溶解曲线。
[0068]每个标本均重复测定三次,miRNA表达量采用2- ΔΔ Ct进行分析。
[0069]6、数据处理与统计学分析
[0070]通过SPSS17.0软件对数据进行统计学分析,使用Mann-WhitneyU非参数检验比较两组样本间miRNAs的浓度差异，P〈0.05被认为具有统计学差异。经多元logistic回归分析建立miRNAs诊断模型和计算公式,诊断模型的诊断效能采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析。
[0071]7、检测结果
[0072]I)经Miseq测序分析，膀胱癌组与对照组对比共得到26个差异表达的miRNAs (入选标准:在任一组中拷贝数大于50 ;在膀胱癌组与对照组的表达量差异大于2倍)，其中上调的包括 miR-24-3p, miR-128, miR-98, miR-148b_3p，miR-152, miR-30d_5p，miR-1294 和let-7c,下调的包括 miR-484, let-7b_5p, let-7a_5p, miR-30a_5p，miR-181b_5p，miR-1228-5p, miR-181a_5p, miR-27a_3p, miR_3135b, miR-3187_3p, miR-185_5p, miR-15a_5p, miR_15b_5p, miR-92b_5p, miR-342_3p, miR-148a_3p, miR-501_3p，和 let_7i_5p。序列如表 I 所不(如 SEQIDNO: 14 ~39 所示)。
[0073]表1测序筛出的差异miRNAs序列
[0074]
【权利要求】
1.一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，其特征在于:由上调表达的miR-152，miR-148b-3p,以及下调表达的 miR-3187_3p，miR-15b_5p，miR-27a_3p，miR-30a_5p 构成。
2.根据权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，其特征在于:所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
3.权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，其特征在于:包括以下引物: (1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:2 所示:
SEQIDN0: I:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC_3’ ；
SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ； (2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
SEQIDNO:3:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT_3’ ；
SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ； (3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
SEQIDNO:5:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG_3’ ；
SEQIDNO:6:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’ ； (4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
SEQIDNO:7:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC_3’ ；
SEQIDNO:8:5’ -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’ ； (5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
SEQIDNO:9:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT_3’ ；
SEQIDNO:10:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’ ； (6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
SEQIDNO:11:
5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
SEQIDNO:12:5’ -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’ ； (7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
SEQIDNO:13:5’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
4.一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于:包括特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如下: (1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:2所示:
SEQIDNO: I:
.5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC_3’ ；
SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ； (2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
SEQIDNO:3:
.5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT_3’ ；.
SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ； (3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
SEQIDNO:5:. . 5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG_3’ ；
SEQIDNO:6:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’ ； (4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
SEQIDNO:7:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC_3’ ；
SEQIDNO:8:5’ -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’ ； (5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
SEQIDNO:9:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT_3’ ；
SEQIDNO:10:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’ ； (6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
SEQIDNO:11: . 5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
SEQIDNO:12:5’ -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’ ； (7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
SEQIDNO:13:5’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
5.一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型，其特征在于:运用以下公式计算:
1git (P = BC) = 0.439 + 0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)—.0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—.0.1693*(miR-30a-5p)
公式中的“ (miR-152) ”、“ (miR-148b_3p) ”、“ (miR-3187_3p) ”、“miR-15b_5p) ”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
6.一种利用权利要求5所述的早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型诊断的方法，其特征在于:首先，利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物检测待诊断患者的血清中六种 miRNAs 的表达量，包括 miR-152，miR-148b_3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a_3p和miR-30a-5p，然后，运用以下公式进行计算: 1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)—0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395* (miR-15b_5p) — 0.625* (miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p) 将六种miRNAs的表达量分别输入Matlab软件，若1git (P = BC)为1，可判断为膀胱癌；若1git (P = BC)为0，则判断为非膀胱癌。
【文档编号】C12N15/11GK103993093SQ201410245237
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】王传新, 杜鲁涛, 蒋秀梅, 张欣, 杨咏梅 申请人:山东大学齐鲁医院
【专利摘要】本发明公开了一种早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱，由表达上调的miR-152，miR-148b-3p，以及表达下调的miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p,miR-30a-5p构成。所述早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如SEQIDNO：1～13所示。本发明还提供了一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型，利用以下公式：logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)计算，用于膀胱癌的早期诊断，经ROC曲线分析，此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学,此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和T1)。
【专利说明】早期膀胱癌血清m i RNAs特异表达谱及诊断模型
【技术领域】
[0001]本发明涉及早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱，其逆转录引物和检测引物，以及诊断模型，属于医学诊断【技术领域】。
【背景技术】
[0002]膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在我国其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤的首位，且近年有逐渐上升的趋势。20% -30%的膀胱癌病人初诊时已发生肌层浸润，而在最初诊断为非侵袭性膀胱癌的病人中，约15%的膀胱癌病人五年内发展为侵袭性膀胱癌。因此，早期诊断和早期治疗是改善膀胱癌预后、降低死亡率的关键。目前，用于膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜、尿脱落细胞学及影像学检查等。膀胱镜检查虽然具有较高的诊断效能，但该检查方法的有创性限制了其在膀胱癌筛查中的广泛应用；尿液脱落细胞学检查虽特异性较高，但敏感性较低，尤其对低分级肿瘤的敏感性仅为20%~40%，且易受监测这主观因素的影响；CT和超声检查不易发现膀胱内较小的病变，对膀胱癌分期预测具有一定的有限性。寻找临敏感性高和特异性高的早期肿瘤标志物，建立一种安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是临床亟待解决的难题。
[0003]MicroRNA(miRNAs)是一类广泛分布于真核生物的高度保守的、非蛋白编码的单链小分子RNAs，通过对靶mRNA降解或翻译抑制，在转录后水平调节靶基因的表达，进而调控细胞分化、生长、代谢和凋亡等功能。以往研究证实，miRNAs在肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在密切的联系。近年来研究发现，血清中存在丰富且稳定的miRNAs，通过对比分析肿瘤患者和对照组血清中miRNAs表达谱，发现不同肿瘤具有其特定的miRNAs表达谱，为肿瘤的无创性早期诊断提供了新的依据。因此，确定膀胱癌miRNAs特异表达谱，筛选差异表达的miRNAs，建立膀胱癌血清miRNAs诊断模型，有助于实现对膀胱癌的早期诊断。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术的不足，本发明提供了膀胱癌患者血清miRNA特异表达谱，及其逆转录引物和检测引物、检测试剂盒，以及诊断模型，为临床上膀胱癌的早期发现和早期治疗提供支持。
[0005]为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0006]一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，由上调表达的miR-152, miR-148b_3p以及下调表达的 miR-3187_3p, miR-15b_5p, miR-27a_3p, miR-30a_5p 构成。
[0007]所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
[0008]所述膀胱癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物,如下:
[0009] ((l)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:2所示:[0010]SEQIDNO: I:
[0011 ] 5 ’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3，；
[0012]SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ；
[0013](2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
[0014]SEQIDNO:3:
[0015]5， -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3，；
[0016]SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ；
[0017](3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
[0018]SEQIDNO:5:
[0019]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’ ；
[0020]SEQIDNO:6:5，-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3，；
[0021](4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
[0022]SEQIDNO:7:
[0023]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’ ；
[0024]SEQIDNO:8:5，-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3，；
[0025](5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
[0026]SEQIDNO:9:
[0027]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’ ；
[0028]SEQIDNO:10:5，-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3，；
[0029](6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
[0030]SEQIDNO: 11:
[0031]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
[0032]SEQIDNO:12:5，-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3，；
[0033](7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
[0034]SEQIDNO:13:5，-TGGTGTCGTGGAGTCG-3，。
[0035]一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，包括上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物。
[0036]一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型。具体如下:运用以下公式计算:
[0037]1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0038]公式中的“(miR-152) ”、“(miR-148b_3p) ”、“ (miR-3187_3p) ”、“miR-15b_5p) ”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
[0039]一种利用上述诊断模型诊断的方法，如下:首先，利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物测定待诊断患者的血清中六种miRNAs的表达量，包括miR-152，miR-148b-3p, miR-3187_3p，miR-15b_5p，miR-27a_3p 和 miR-30a_5p，然后，运用下述公式计算:
[0040]logit (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0041]将六种miRNAs的表达量分别输入Matlab软件(该软件为所属领域的常规软件，为现有技术中已有的软件)，若1git (P = BC)为1，可以判断为膀胱癌；若1git (P = BC)为0，判断为非膀胱癌。
[0042]本发明首先基于临床常规收集的非侵袭性膀胱癌患者、侵袭性膀胱癌患者及对照者血清样本筛查差异表达miRNAs的技术路径，采用“miRNAscDNA文库+文库预扩增+Miseq深度测序”的研究策略，对三组血清标本中miRNAs表达谱进行了比对分析，共筛查出26个差异表达miRNAs，序列见表1。然后采用SYBRGreen的逆转录-实时荧光定量PCR方法，对上述26个差异表达miRNAs在膀胱癌患者及对照血清中的表达丰度进行验证，最终确定了与膀胱癌相关的6个miRNAs，包括表达上调的miR-152，miR-148b_3p以及下调表达的miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p，miR-30a-5p，且自主设计了其反转录引物和前向反向检测引物，具体见表2。进而，提供了一种诊断膀胱癌的血清miRNAs表达模型:利用多元logistic回归方法提供了一种膀胱癌血清miRNAs诊断模型的计算公式:
[0043]1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0044]ROC曲线分析显示，此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学，此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和Tl)。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1:六种miRNAs在膀胱癌组和对照组中的表达，其中，A:miR-152 ；B:miR-148b_3p ；C:miR-3187_3p ；D:miR-15b_5p ；E:miR-27a_3p ；F:miR-30a_5p。
[0046]图2:六种 miRNAs 对膀胱癌的诊断 ROC 曲线，其中，A:miR-152 ；B:miR-148b-3p ；C:miR-3187_3p ；D:miR-15b_5p ；E:miR-27a_3p ；F:miR-30a_5p。
[0047]图3:建立的诊断模型(panel)及尿液脱落细胞学对膀胱癌的诊断ROC曲线。
[0048]图4:建立的诊断模型对不同分期膀胱癌的诊断ROC曲线，其中，A:Ta ；B:T1 ；C:T2-T4。
[0049]图2、3、4中，横坐标:特异性；纵坐标:敏感性。
【具体实施方式】
[0050]以下结合实施例和实验对本发明作详细的说明。
[0051]实施例一
[0052]1、研究对象
[0053] 血清标本共来自经受试者同意的175例膀胱癌患者(BC)和165例排除泌尿系肿瘤的对照者。所有膀胱癌患者均来自山东大学齐鲁医院(以下称本院)泌尿外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经膀胱镜检查或术后病理检查确认。对照者包括37名前列腺良性增生患者，25名尿路结石患者，19名膀胱炎患者和84名健康者。其中，获取75名膀胱癌患者、16名前列腺良性增生患者、13名尿路结石患者、8名膀胱炎患者和38名健康者的尿液标本。所有血清和尿液标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。
[0054]2、标本采集
[0055]采集血清3ml，立即1600g离心5分钟，然后16000g离心10分钟，将分离上清液保存于-80°c待测。取3 μ I分离上清液与3 μ IRNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清，将上清1:10稀释用于逆转录模板。留取中段尿15ml,立即1300g离心10min,取沉洛瑞氏染色进行尿液脱落细胞学检查。
[0056]4、文库构建和Miseq测序
[0057]取冻存样本于常温下解冻,按miRNeasyMiniKit试剂盒(Qiagen公司)操作者说明提取血清总RNA，总RNA浓缩后经T4RNA连接酶作用，分别连接3’-1inker和5’_linker，然后通过RT-PCR技术扩增建库。使用KAPAqPCR试剂盒检测文库，若qPCR浓度大于InM且无dimer污染则确定为检测合格。文库检测符合要求后，通过Miseq测序仪进行深度测序分析。比对分析测序后获得的序列和miRNA数据库(miRBasel7.0)中人miRNA序列，获取三组样本已知miRNA的表达丰度。
[0058]5、RT_qPCR
[0059]使用One Step PrimeScript? miRNA cDNA SynthesisKit 逆转录试剂盒(Takara 公司)反转录上述mRNA成cDNA，再进行PCR反应，运行于ABI7500实时荧光定量PCR分析仪(ABI公司)。
[0060]PCR 反应体系(25 μ I):
[0061]模板DNA: 2u I
[0062]SYBRPremixExTaq II: 12.5 μ I
[0063]Dye I1:0.5 μ I
[0064]上游引物(10μ Μ):1 μ I
[0065]下游引物(10μ Μ):1 μ I
[0066]无菌水:8μ1
[0067]反应条件为:95°C 30秒一I个循环；(95°C 5秒，57°C 34秒)一45个循环；添加
溶解曲线。
[0068]每个标本均重复测定三次,miRNA表达量采用2- ΔΔ Ct进行分析。
[0069]6、数据处理与统计学分析
[0070]通过SPSS17.0软件对数据进行统计学分析,使用Mann-WhitneyU非参数检验比较两组样本间miRNAs的浓度差异，P〈0.05被认为具有统计学差异。经多元logistic回归分析建立miRNAs诊断模型和计算公式,诊断模型的诊断效能采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析。
[0071]7、检测结果
[0072]I)经Miseq测序分析，膀胱癌组与对照组对比共得到26个差异表达的miRNAs (入选标准:在任一组中拷贝数大于50 ;在膀胱癌组与对照组的表达量差异大于2倍)，其中上调的包括 miR-24-3p, miR-128, miR-98, miR-148b_3p，miR-152, miR-30d_5p，miR-1294 和let-7c,下调的包括 miR-484, let-7b_5p, let-7a_5p, miR-30a_5p，miR-181b_5p，miR-1228-5p, miR-181a_5p, miR-27a_3p, miR_3135b, miR-3187_3p, miR-185_5p, miR-15a_5p, miR_15b_5p, miR-92b_5p, miR-342_3p, miR-148a_3p, miR-501_3p，和 let_7i_5p。序列如表 I 所不(如 SEQIDNO: 14 ~39 所示)。
[0073]表1测序筛出的差异miRNAs序列
[0074]
【权利要求】
1.一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，其特征在于:由上调表达的miR-152，miR-148b-3p,以及下调表达的 miR-3187_3p，miR-15b_5p，miR-27a_3p，miR-30a_5p 构成。
2.根据权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，其特征在于:所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
3.权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，其特征在于:包括以下引物: (1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:2 所示:
SEQIDN0: I:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC_3’ ；
SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ； (2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
SEQIDNO:3:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT_3’ ；
SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ； (3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
SEQIDNO:5:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG_3’ ；
SEQIDNO:6:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’ ； (4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
SEQIDNO:7:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC_3’ ；
SEQIDNO:8:5’ -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’ ； (5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
SEQIDNO:9:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT_3’ ；
SEQIDNO:10:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’ ； (6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
SEQIDNO:11:
5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
SEQIDNO:12:5’ -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’ ； (7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
SEQIDNO:13:5’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
4.一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于:包括特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如下: (1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:2所示:
SEQIDNO: I:
.5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC_3’ ；
SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ； (2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
SEQIDNO:3:
.5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT_3’ ；.
SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ； (3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
SEQIDNO:5:. . 5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG_3’ ；
SEQIDNO:6:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’ ； (4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
SEQIDNO:7:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC_3’ ；
SEQIDNO:8:5’ -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’ ； (5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
SEQIDNO:9:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT_3’ ；
SEQIDNO:10:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’ ； (6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
SEQIDNO:11: . 5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ；
SEQIDNO:12:5’ -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’ ； (7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
SEQIDNO:13:5’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
5.一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型，其特征在于:运用以下公式计算:
1git (P = BC) = 0.439 + 0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)—.0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—.0.1693*(miR-30a-5p)
公式中的“ (miR-152) ”、“ (miR-148b_3p) ”、“ (miR-3187_3p) ”、“miR-15b_5p) ”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
6.一种利用权利要求5所述的早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型诊断的方法，其特征在于:首先，利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物检测待诊断患者的血清中六种 miRNAs 的表达量，包括 miR-152，miR-148b_3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a_3p和miR-30a-5p，然后，运用以下公式进行计算: 1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)—0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395* (miR-15b_5p) — 0.625* (miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p) 将六种miRNAs的表达量分别输入Matlab软件，若1git (P = BC)为1，可判断为膀胱癌；若1git (P = BC)为0，则判断为非膀胱癌。
【文档编号】C12N15/11GK103993093SQ201410245237
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】王传新, 杜鲁涛, 蒋秀梅, 张欣, 杨咏梅 申请人:山东大学齐鲁医院
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