早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱及诊断模型的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  2

【专利下载】Tel:18215660330

早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱及诊断模型的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱,由表达上调的miR-152,miR-148b-3p,以及表达下调的miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p,miR-30a-5p构成。所述早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物,如SEQIDNO:1~13所示。本发明还提供了一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型,利用以下公式:logit(P=BC)=0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p)-0.2395*(miR-15b-5p)-0.625*(miR-27a-3p)-0.1693*(miR-30a-5p)计算,用于膀胱癌的早期诊断,经ROC曲线分析,此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率,高于传统的尿液脱落细胞学,此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和T1)。
【专利说明】早期膀胱癌血清m i RNAs特异表达谱及诊断模型
【技术领域】
[0001]本发明涉及早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱,其逆转录引物和检测引物,以及诊断模型,属于医学诊断【技术领域】。
【背景技术】
[0002]膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,在我国其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤的首位,且近年有逐渐上升的趋势。20% -30%的膀胱癌病人初诊时已发生肌层浸润,而在最初诊断为非侵袭性膀胱癌的病人中,约15%的膀胱癌病人五年内发展为侵袭性膀胱癌。因此,早期诊断和早期治疗是改善膀胱癌预后、降低死亡率的关键。目前,用于膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜、尿脱落细胞学及影像学检查等。膀胱镜检查虽然具有较高的诊断效能,但该检查方法的有创性限制了其在膀胱癌筛查中的广泛应用;尿液脱落细胞学检查虽特异性较高,但敏感性较低,尤其对低分级肿瘤的敏感性仅为20%~40%,且易受监测这主观因素的影响;CT和超声检查不易发现膀胱内较小的病变,对膀胱癌分期预测具有一定的有限性。寻找临敏感性高和特异性高的早期肿瘤标志物,建立一种安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是临床亟待解决的难题。
[0003]MicroRNA(miRNAs)是一类广泛分布于真核生物的高度保守的、非蛋白编码的单链小分子RNAs,通过对靶mRNA降解或翻译抑制,在转录后水平调节靶基因的表达,进而调控细胞分化、生长、代谢和凋亡等功能。以往研究证实,miRNAs在肿瘤中异常表达,与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在密切的联系。近年来研究发现,血清中存在丰富且稳定的miRNAs,通过对比分析肿瘤患者和对照组血清中miRNAs表达谱,发现不同肿瘤具有其特定的miRNAs表达谱,为肿瘤的无创性早期诊断提供了新的依据。因此,确定膀胱癌miRNAs特异表达谱,筛选差异表达的miRNAs,建立膀胱癌血清miRNAs诊断模型,有助于实现对膀胱癌的早期诊断。

【发明内容】

[0004]针对上述现有技术的不足,本发明提供了膀胱癌患者血清miRNA特异表达谱,及其逆转录引物和检测引物、检测试剂盒,以及诊断模型,为临床上膀胱癌的早期发现和早期治疗提供支持。
[0005]为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
[0006]一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱,由上调表达的miR-152, miR-148b_3p以及下调表达的 miR-3187_3p, miR-15b_5p, miR-27a_3p, miR-30a_5p 构成。
[0007]所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
[0008]所述膀胱癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物,如下:
[0009] ((l)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:2所示:[0010]SEQIDNO: I:
[0011 ] 5 ’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3,;
[0012]SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ;
[0013](2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
[0014]SEQIDNO:3:
[0015]5, -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3,;
[0016]SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ;
[0017](3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
[0018]SEQIDNO:5:
[0019]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’ ;
[0020]SEQIDNO:6:5,-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3,;
[0021](4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
[0022]SEQIDNO:7:
[0023]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’ ;
[0024]SEQIDNO:8:5,-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3,;
[0025](5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
[0026]SEQIDNO:9:
[0027]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’ ;
[0028]SEQIDNO:10:5,-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3,;
[0029](6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
[0030]SEQIDNO: 11:
[0031]5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ;
[0032]SEQIDNO:12:5,-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3,;
[0033](7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
[0034]SEQIDNO:13:5,-TGGTGTCGTGGAGTCG-3,。
[0035]一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片,包括上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物。
[0036]一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型。具体如下:运用以下公式计算:
[0037]1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0038]公式中的“(miR-152) ”、“(miR-148b_3p) ”、“ (miR-3187_3p) ”、“miR-15b_5p) ”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
[0039]一种利用上述诊断模型诊断的方法,如下:首先,利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物测定待诊断患者的血清中六种miRNAs的表达量,包括miR-152,miR-148b-3p, miR-3187_3p,miR-15b_5p,miR-27a_3p 和 miR-30a_5p,然后,运用下述公式计算:
[0040]logit (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0041]将六种miRNAs的表达量分别输入Matlab软件(该软件为所属领域的常规软件,为现有技术中已有的软件),若1git (P = BC)为1,可以判断为膀胱癌;若1git (P = BC)为0,判断为非膀胱癌。
[0042]本发明首先基于临床常规收集的非侵袭性膀胱癌患者、侵袭性膀胱癌患者及对照者血清样本筛查差异表达miRNAs的技术路径,采用“miRNAscDNA文库+文库预扩增+Miseq深度测序”的研究策略,对三组血清标本中miRNAs表达谱进行了比对分析,共筛查出26个差异表达miRNAs,序列见表1。然后采用SYBRGreen的逆转录-实时荧光定量PCR方法,对上述26个差异表达miRNAs在膀胱癌患者及对照血清中的表达丰度进行验证,最终确定了与膀胱癌相关的6个miRNAs,包括表达上调的miR-152,miR-148b_3p以及下调表达的miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p,miR-30a-5p,且自主设计了其反转录引物和前向反向检测引物,具体见表2。进而,提供了一种诊断膀胱癌的血清miRNAs表达模型:利用多元logistic回归方法提供了一种膀胱癌血清miRNAs诊断模型的计算公式:
[0043]1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)-0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p)
[0044]ROC曲线分析显示,此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率,高于传统的尿液脱落细胞学,此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和Tl)。
【专利附图】

【附图说明】
[0045]图1:六种miRNAs在膀胱癌组和对照组中的表达,其中,A:miR-152 ;B:miR-148b_3p ;C:miR-3187_3p ;D:miR-15b_5p ;E:miR-27a_3p ;F:miR-30a_5p。
[0046]图2:六种 miRNAs 对膀胱癌的诊断 ROC 曲线,其中,A:miR-152 ;B:miR-148b-3p ;C:miR-3187_3p ;D:miR-15b_5p ;E:miR-27a_3p ;F:miR-30a_5p。
[0047]图3:建立的诊断模型(panel)及尿液脱落细胞学对膀胱癌的诊断ROC曲线。
[0048]图4:建立的诊断模型对不同分期膀胱癌的诊断ROC曲线,其中,A:Ta ;B:T1 ;C:T2-T4。
[0049]图2、3、4中,横坐标:特异性;纵坐标:敏感性。
【具体实施方式】
[0050]以下结合实施例和实验对本发明作详细的说明。
[0051]实施例一
[0052]1、研究对象
[0053] 血清标本共来自经受试者同意的175例膀胱癌患者(BC)和165例排除泌尿系肿瘤的对照者。所有膀胱癌患者均来自山东大学齐鲁医院(以下称本院)泌尿外科住院患者,均为首次入院接受治疗的患者,入院前未曾接受任何药物或手术治疗,其分期和病理类型均经膀胱镜检查或术后病理检查确认。对照者包括37名前列腺良性增生患者,25名尿路结石患者,19名膀胱炎患者和84名健康者。其中,获取75名膀胱癌患者、16名前列腺良性增生患者、13名尿路结石患者、8名膀胱炎患者和38名健康者的尿液标本。所有血清和尿液标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。
[0054]2、标本采集
[0055]采集血清3ml,立即1600g离心5分钟,然后16000g离心10分钟,将分离上清液保存于-80°c待测。取3 μ I分离上清液与3 μ IRNA分离液混合,16000g离心10分钟,分离上清,将上清1:10稀释用于逆转录模板。留取中段尿15ml,立即1300g离心10min,取沉洛瑞氏染色进行尿液脱落细胞学检查。
[0056]4、文库构建和Miseq测序
[0057]取冻存样本于常温下解冻,按miRNeasyMiniKit试剂盒(Qiagen公司)操作者说明提取血清总RNA,总RNA浓缩后经T4RNA连接酶作用,分别连接3’-1inker和5’_linker,然后通过RT-PCR技术扩增建库。使用KAPAqPCR试剂盒检测文库,若qPCR浓度大于InM且无dimer污染则确定为检测合格。文库检测符合要求后,通过Miseq测序仪进行深度测序分析。比对分析测序后获得的序列和miRNA数据库(miRBasel7.0)中人miRNA序列,获取三组样本已知miRNA的表达丰度。
[0058]5、RT_qPCR
[0059]使用One Step PrimeScript? miRNA cDNA SynthesisKit 逆转录试剂盒(Takara 公司)反转录上述mRNA成cDNA,再进行PCR反应,运行于ABI7500实时荧光定量PCR分析仪(ABI公司)。
[0060]PCR 反应体系(25 μ I):
[0061]模板DNA: 2u I
[0062]SYBRPremixExTaq II: 12.5 μ I
[0063]Dye I1:0.5 μ I
[0064]上游引物(10μ Μ):1 μ I
[0065]下游引物(10μ Μ):1 μ I
[0066]无菌水:8μ1
[0067]反应条件为:95°C 30秒一I个循环;(95°C 5秒,57°C 34秒)一45个循环;添加
溶解曲线。
[0068]每个标本均重复测定三次,miRNA表达量采用2- ΔΔ Ct进行分析。
[0069]6、数据处理与统计学分析
[0070]通过SPSS17.0软件对数据进行统计学分析,使用Mann-WhitneyU非参数检验比较两组样本间miRNAs的浓度差异,P〈0.05被认为具有统计学差异。经多元logistic回归分析建立miRNAs诊断模型和计算公式,诊断模型的诊断效能采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析。
[0071]7、检测结果
[0072]I)经Miseq测序分析,膀胱癌组与对照组对比共得到26个差异表达的miRNAs (入选标准:在任一组中拷贝数大于50 ;在膀胱癌组与对照组的表达量差异大于2倍),其中上调的包括 miR-24-3p, miR-128, miR-98, miR-148b_3p,miR-152, miR-30d_5p,miR-1294 和let-7c,下调的包括 miR-484, let-7b_5p, let-7a_5p, miR-30a_5p,miR-181b_5p,miR-1228-5p, miR-181a_5p, miR-27a_3p, miR_3135b, miR-3187_3p, miR-185_5p, miR-15a_5p, miR_15b_5p, miR-92b_5p, miR-342_3p, miR-148a_3p, miR-501_3p,和 let_7i_5p。序列如表 I 所不(如 SEQIDNO: 14 ~39 所示)。
[0073]表1测序筛出的差异miRNAs序列
[0074]
【权利要求】
1.一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱,其特征在于:由上调表达的miR-152,miR-148b-3p,以及下调表达的 miR-3187_3p,miR-15b_5p,miR-27a_3p,miR-30a_5p 构成。
2.根据权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs特异表达谱,其特征在于:所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
3.权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物,其特征在于:包括以下引物: (1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:2 所示:
SEQIDN0: I:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC_3’ ;
SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ; (2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
SEQIDNO:3:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT_3’ ;
SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ; (3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
SEQIDNO:5:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG_3’ ;
SEQIDNO:6:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’ ; (4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
SEQIDNO:7:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC_3’ ;
SEQIDNO:8:5’ -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’ ; (5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
SEQIDNO:9:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT_3’ ;
SEQIDNO:10:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’ ; (6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
SEQIDNO:11:
5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ;
SEQIDNO:12:5’ -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’ ; (7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
SEQIDNO:13:5’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
4.一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片,其特征在于:包括特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物,如下: (1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:2所示:
SEQIDNO: I:
.5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC_3’ ;
SEQIDNO:2:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’ ; (2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:3所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:4所示:
SEQIDNO:3:
.5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT_3’ ;.
SEQIDNO:4:5’ -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’ ; (3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:5所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:6所示:
SEQIDNO:5:. . 5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG_3’ ;
SEQIDNO:6:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’ ; (4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:7所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:8所示:
SEQIDNO:7:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC_3’ ;
SEQIDNO:8:5’ -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’ ; (5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:9所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:10所示:
SEQIDNO:9:
5’ _CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT_3’ ;
SEQIDNO:10:5’ -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’ ; (6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物:逆转录引物的序列如SEQIDNO:11所示,前向检测引物的序列如SEQIDNO:12所示:
SEQIDNO:11: . 5’ -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’ ;
SEQIDNO:12:5’ -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’ ; (7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO:13所示:
SEQIDNO:13:5’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
5.一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型,其特征在于:运用以下公式计算:
1git (P = BC) = 0.439 + 0.1775* (miR-152)+0.0767* (miR-148b-3p)—.0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395*(miR-15b_5p) — 0.625*(miR-27a_3p)—.0.1693*(miR-30a-5p)
公式中的“ (miR-152) ”、“ (miR-148b_3p) ”、“ (miR-3187_3p) ”、“miR-15b_5p) ”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
6.一种利用权利要求5所述的早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型诊断的方法,其特征在于:首先,利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物检测待诊断患者的血清中六种 miRNAs 的表达量,包括 miR-152,miR-148b_3p,miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a_3p和miR-30a-5p,然后,运用以下公式进行计算: 1git (P = BC) = 0.439+0.1775* (miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)—0.475*(miR-3187-3p) — 0.2395* (miR-15b_5p) — 0.625* (miR-27a_3p)—0.1693*(miR-30a-5p) 将六种miRNAs的表达量分别输入Matlab软件,若1git (P = BC)为1,可判断为膀胱癌;若1git (P = BC)为0,则判断为非膀胱癌。
【文档编号】C12N15/11GK103993093SQ201410245237
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】王传新, 杜鲁涛, 蒋秀梅, 张欣, 杨咏梅 申请人:山东大学齐鲁医院

最新回复(0)