乌头酸酶突变体、其编码基因及应用的制作方法
乌头酸酶突变体、其编码基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种乌头酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。编码该突变体的基因序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，经计算，乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比，降低了73％，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。
【专利说明】乌头酸酶突变体、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种乌头酸酶突变体、其编码基因及应 用。
【背景技术】
[0002] 柠檬酸，又名枸橼酸，化学名称是2-羟基丙烷-1，2, 3-三羧酸。因其具有令人愉悦 的酸味，人口爽快，无后酸味，安全无毒，已成为当前世界上生产量和消费量最大的食用有 机酸。世界上柠檬酸行业的集约化程度非常高，生产重心已转移至中国，我国柠檬酸产量和 出口量已连续多年居世界第一。2008年，我国柠檬酸产能达到10万吨，占世界总量的70% 左右，其中70-80%用于生产饮料、食品，其余用于医药、化工、环保、化妆品、纺织、印染、建 筑等各个领域。
[0003] 黑曲霉（Aspergillus niger)是生产朽1檬酸最常见的菌株，已有报道称黑曲霉在 发酵生产柠檬酸过程中存在三羧酸循环的酶系，其中由柠檬酸到异柠檬酸，即柠檬酸一顺 乌头酸一异柠檬酸，两步反应均由乌头酸酶（aconitase，AC0)催化。因此阻断柠檬酸向下 的代谢是柠檬酸的积累关键，即阻断乌头酸酶的催化反应。通过基因工程方法使黑曲霉中 乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种乌头酸酶突变体、其编码基因及应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的乌头酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006] 与野生型的乌头酸酶（野生型乌头酸酶的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和4所示）相比，本发明的乌头酸酶突变体具体的氨基酸序列的改变是：M226V(第226 位甲硫氨酸变为缬氨酸），N227Y (第227位天冬酰胺变为酪氨酸），T376N (第376位苏氨酸 变为天冬酰胺），A377T (第377位丙氨酸变为苏氨酸），S529P (第529位丝氨酸变为脯氨 酸），I530M(第530位异亮氨酸变为甲硫氨酸），H580R(第580位组氨酸变为精氨酸）。
[0007] 本发明还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 本发明还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因的载体、。
[0009] 本发明还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因、或上述载体的转基因细胞系及 工程菌。
[0010] 本发明还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的 应用。
[0011] 本发明还提供用于PCR特异性扩增编码所述乌头酸酶突变体的基因的引物对，所 述引物对为：
[0012] 正向引物：5，-GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3，
[0013]反向引物：5，-GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3，。
[0014] 本发明进一步提供所述乌头酸酶突变体的构建方法，包括以下步骤：
[0015] (1)从黑曲霉（Aspergillus niger)基因组DNA中，扩增AC0的编码基因 aco ;
[0016] ⑵采用易错PCR技术，以AC0的编码基因 aco为模板，扩增获得AC0突变体基因；
[0017] (3)将步骤（2)所得易错PCR产物及表达质粒pET28a(+)用Sac I和Not I双酶 切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，涂布至含Kan的LB平板，将平板 置37°C恒温培养箱培养，即得构建得到重组AC0基因突变库；
[0018] (4)含Kan的LB平板上长出菌落，挑取其中的100个单克隆，转接到含Kan的LB 液体培养基中，37°C摇床培养，待菌液0D_长至0. 8时，加入终浓度为0. 2mM的IPTG诱导， 放回37°C摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，测定AC0野生型和突变体酶活，挑选酶 活力最低的一株，并测定其基因序列（SEQ ID N0. 2)。
[0019] 本发明通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，经 计算，乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比，降低了 73 %，理论上可提高柠檬 酸的产量和/或产率。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例1中野生型乌头酸酶基因的PCR扩增结果。
[0021] 图2为本发明实施例5中乌头酸酶突变体蛋白的SDS-PAGE电泳结果；其中，1为 未诱导的菌体经超声破碎后，离心所得上清，2为乌头酸酶野生型蛋白，3为乌头酸酶突变 体蛋白。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0023] 实施例1乌头酸酶基因的获得
[0024] 以 lyg黑曲霉（Aspergillus niger)基因组DNA为PCR反应模板，按SEQ ID N0.4 的序列设计正向引物 AC0-F 为 5' -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3'，反向引物 AC0-R 为Y -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3'。其中，斜体字母部分分别为酶切位点Sac I和Not I。PCR反应在50 μ 1总体积中进行，反应条件为在94°C变性5min后开始循环； 94°C变性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30个循环；再于72°C延伸10min。取3μ 1 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。取100 μ 1 PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。
[0025] 实施例2野生型乌头酸酶基因表达载体的构建
[0026] 实施例1中PCR产物经限制性内切酶Sac I和Not I双酶切消化后，与同样用Sac I和Not I内切酶消化的pET-28a(+)质粒（Novagen公司）进行连接反应，构建的载体被称 为pET-ACO,然后用连接产物pET-ACO混合物转化大肠杆菌DH5- α (购自promega公司）， 并进行序列测定提取转化菌体库的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株（Promega公司）。
[0027] 实施例3易错PCR扩增黑曲霉乌头酸酶基因
[0028] 利用Taq DNA聚合酶不具有3' -5'校对功能的性质，在高镁离子浓度（5-9mmol/ L)和不同浓度dNTP的浓度下（1. 5-3. 5mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引 入随机突变，构建突变库。实验中最优的突变率约为〇. 6 %。
[0029] 易错PCR反应体系（100 μ 1):
[0030] lOxPCR反应缓冲液 丨Ομ丨 dATP 2 μ? dTTP 4 μ? dCTP 4 ul dGTP 2 μ? MgCb 6 μ? 正向引物 4μ1 反向引物 4μ1 DNA模板（实施例]PCR片段） 4μ1 TaqDNA聚合酶 1 μ? ddH20 59 μ I 总体积 100 μΙ
[0031] PCR反应程序为：96°C预变性4min ;94°C变性lmin，56°C退火lmin，75°C延伸 2min，共45个循环；最后75°C延伸15min。采用胶回收方法回收PCR产物。取5μ1产物进 行1 %琼脂糖凝胶电泳检验，_20°C保存备用。
[0032] 实施例4 pET-ACOM表达载体的构建
[0033] 实施例3中PCR产物经限制性内切酶Sac I和Not I双酶切消化后，与用Sac I 和Not I内切酶消化的pET-28a(+)质粒进行连接反应，构建的载体被命名为pET-ACOM，然 后用连接产物pET-ACOM混合物转化大肠杆菌DH5 α，构建转化菌体突变库。
[0034] 实施例5构建表达突变库及高产量突变体的筛选
[0035] 提取转化菌体库的质粒，分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，获得转化子约100 株，构建表达突变体库。挑取突变菌株至含kan的LB培养基（150 μ 1/孔）的96孔板中， 37°C、150rpm培养，待0D值达0. 6-0. 8,加入IPTG (终浓度0. 2mmol/L)，继续培养12h，收集 菌体。超声破碎菌体，离心收集上清，并进行酶活测定。检测酶活性最低的菌株，并挑选其克 隆，并提取质粒，测定与野生型乌头酸酶对应的基因序列。测定的基因序列为SEQ ID N0. 2 所示，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。乌头酸酶突变体蛋白的SDS-PAGE电泳结 果如图2所示。
[0036] 乌头酸酶的酶活检测：按照乌头酸酶活性检测试剂盒（Biovision公司）进行。经 计算，野生型蛋白的酶活为6. 3u/L，突变体蛋白的最低酶活为1. 7u/L，结果表明，通过易错 PCR对AC0进行改造，获得了酶活力降低了 73 %的突变株。
[0037] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0001] 序列表 <110〉安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 <120〉乌头酸酶突变体、其编码基因及应用 <130> KHP141112765.8 <160> 6 <170> Patentln version 3,3 <2丄0>丄 <211> 817 <212〉 PRT <213〉乌头酸酶突变体 <400> 1 Met Gly Asp Ala Ser Glu Pro Tyr Ala Pro Ser Leu Leu Leu Val Leu 15 10 15 Gin Gin Thr Arg Asp Val Val Leu Ser Glu Ala Asp Thr Tyr Ala Leu 20 25 30 Pro Thr \mi Gly Asn Leu i.nu Thr Gin f.eu Va.1 Arg Va.1 Val Asp Ala 35 40 45 Leu Arg Ala Gin Asp His Pro Arg Glu Ala Asn. Ala Leu Thr Asp Val 50 55 60 Leu Ala丄ie Ser Gin Gin Pro Thr G丄u Met G丄y Gly Leu G丄y leu Ser 65 70 75 80 Glu Ala Asp Thr Leu Thr Pro Glu Gin Glu Ala Glu lie Thr Phe Leu 85 90 95 Val Thr Ala Trp Leu Glu Ala Leu Asn Ser Ala Asp Arg Ala Arg Ala 100 105 110 Pro Pro Val Pro Leu Ala Val Arg Pro Pro Gly Arg Arg Gly MeL Thr 115 120 125 \.f)U Ser Glu T,ys Tie Phe Ala i,eu His Asp f,eu Gly Arg Lys Gly Ser 130 135 .140 Val Ala Pro Gly Glu Leu Lie Arg Val Asp Val Asp Trp Val lie Ala 145 150 155 160 Ser Glu Aia Ser Trp Gin G丄y Met Giu G丄n Thr Tyr Glu Arg Leu Gly 165 170 175 Lys Pro Gly lie Tyr Arg Asn Asp Arg Phe Trp Leu Ala Gly Asp His 180 185 190 Val Val Asp Pro Arg Val Asn Glu Val Pro Lys Val Lys Ala Leu lie 195 200 205 Asp Ala Ser Glu Arg Ala Lys Arg Val Phe Lys Mel Thr Asp Tyr Glri 210 215 220 Gly Val Tyr Tyr Thr Tift ?,^ιι His Thr Glu Phe Tyr Arg Gin Arg Ala 225 230 235 240 Gin Pro Gly Met Val Val Val Gly Ser Asp Ser His Thr Cys Ser Ser 245 250 255
[0002] Gly Ala Leu Gly Cys Leu Ala lie Gly Leu Gly Ala Ala Asp Val Thr 260 265 270 Leu Pro Leu Val Thr Gly Glu Thr Trp Phe Lys Val Pro Glu Ser Val 275 280 285 Asn lie Arg Leu Val Gly Ala Pro Lys Pro Gly lie Gly Gly Lys Asp 290 295 300 Thr lie Leu Tyr lie Leu Gin Gin Leu Lys Arg Asn Thr Val Ala Ala 305 310 315 320 Asp Arg lie Val Glu Phc Thr Gly Pro G丄y Val Lys His Leu Ser Cys 325 330 335 Asp Ala Arg Phe Ala He Ser Asn Met Thr Thr Glu Phe Gly Gly lie 340 345 350 Thr Gly Val Phe Val Pro Asp Gin He Thr Glu Glu Phe lie Gin Lys 355 360 365 Arg Arg Leu Pro Arg His Lys Asn Thr Ser Val Tyr Phe Lys Pro Asp 370 375 380 Asp Asp Ala Glu Tyr Ala Glu Thr His Glu lie Asp Leu Gly Glu Val 385 390 395 400 Arg Ser Phe Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Pro Asp Asp Val Val Pro Val 405 410 415 Thr Glu Gin Glu Gly Met His Leu Asp Gly Cys Phe lie Gly Ala Cys 420 425 430 Thr Thr Ala Glu Glu Asp Leu lie Leu Gly Ala Leu Val Leu Glu Gin 435 440 445 Gly Leu Gin Asn Gly Leu Lys Pro Val Ser His Gly Lys Arg Lys Val 450 455 460 Val Pro Gly Ser Val Pro lie Leu His Arg Leu Arg Glu Leu Gly Leu 465 470 475 480 Ala Gin lie Tyr Glu Asp Ala Gly Phe Glu lie Gly lie Pro Gly Cys 485 490 495 Ser Tyr Cys Val Gly Met Ser Ala Asp G丄n Ala G_Ly Pro G丄y Glu Val 500 505 510 Trp 丄丄e Ser Ser Gin Asn Arg Asn Phe G丄u Asn Arg Met G丄y Lys Gly 515 520 525 Pro Met Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ala Thr Val Ala Ala Ser Ser Phe 530 535 540 Glu Met Lys [,eu i,ys Asp Pro His Glu Tyr Leu Ala Ala Tie Asp Leu 545 550 555 560 Glu Arg Trp His Thr Leu Arg Gly Va.1 Ser Va.l Ser Ala. Thr Asp Ser 565 570 575 Thr Gin Glu Arg lie Ser Tyr Met Glu Pro Ser Gly Ser Ala Thr Ala 580 585 590 Glu Ala Lys Thr Val Asp Ser Pro Asp Val Lys Val Thr Glu Ala Asn 595 600 605
[0003] Thr Pro Glu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Asp Leu Met Thr Glv Lys 610 615 620 Val Gin Arg Leu Gly Asp Phe He Asp Thr Asp Ala Leu Ala Pro Ala 625 630 635 640 Gin Pbe Leu He Gly Met Ser Asn Asn Gin lie Ala Gly G]u His Cys 645 650 655 Leu Glu His Thr His Pro Glu Phe Arg Gin Arg Val Lys Asp Gly Phe 660 665 670 Asn lie Val Val Ala Gly Lys Ala Phe Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu 675 680 685 Gin Ala Val Met Ala Leu Leu Gly Cys Gly Val Gin Cys Val lie Ala 690 695 700 Lys Ser Tyr Ser Phe He Phe Gin Arg Asn Met Pro Ser Leu Gly Leu 705 710 715 720 Leu Gly lie Thr Leu Thr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Ala Ala Gin Asp 725 730 735 Gly Asn Glu He Ser He Asp Phe Lys Thr Lys Val lie Asn Val Asp 740 745 750 Gly Lys Gin Tyr Ala Phe Gin Leu Ser Gin Met Glu Arg Glu Leu Phe 755 760 765 Gin His Gly Gly lie Ala Ser Ala Phe Gin Lys Phe Gly Asn Arg Leu 770 775 780 Phe Glu Gin Met Thr Arg Pro Lys Asn Leu Gly Gly Ala Lys Ser Leu 785 790 795 800 Ala Leu Arg Gly Ser Gly Glu Ser Ala Gly Pro His Ala Gly Leu Gin 805 810 815 Trp <210> 2 <211> 2531 <212> DNA <213〉乌头酸酶突变体基因 <400> 2 atgggtgacg ccagcgaacc atatgcccct tcgctgctgc tggtatigca gcaaacccgg 60 gatgtcgtcc tctccgaggc agacacatac gcattgccga ccctaggaaa tctgcttacc 120 cagctggtgc gagtggtcga tgcacttcga gcgcaggacc acccccggga ggccaatgcc 180 ctcaccgatg tcctcgcgat cagccaacaa cccacggaga tgggaggact cggtctatcc 240 gaagcggana rtntgacarc cgagcaggaa gctgaaatca cnttcrtggt gacggrgtgg 300 ctcgaagctt tgaactcagc cgatcgcgcc agggcaccgc ccgttccgct cgcggtccga 360 ccccccggtc gacgtggcat gacgctgagt gagaagatct ttgcgcttca cgatcttggt 420 cgcaagggat ccgtggcgcc tggggagttg atccgggtgg acgtcgactg ggttattgct 480 tccgaKKcat catggcaggg catggaacaa acgtatgagc gtctcgggaa acctggaalc 540 tatcggaatg accggttctg gctggcggga gatcatgttg tggaccctcg cgtgaatgag 600 gtccccaaag ttaaggcatt gattgacgct agtgagaggg ccaagcgtgt cttcaaaatg 660
[0004] accgactatc agggcgtgta ctatactatt cttcataccg agttctaccg cgagcgagcc 720 cagccgggta tggtggtcgt gggttccgat tcccacacct gctcgtccgg agcattaggc 780 tgcctggcca ttgggttggg cgcagccgat gtgacccttc cattggtcac cggagagacc 840 tggttcaaag tgcccga.atc ggtcaacatt cgtctcgtcg gtgctcccaa gcccggaa.tt 900 ggaggcaagg acacgatctt gtacatcctg caacaactga agcgaaacac cgtggccgca 960 gaccggattg tcgagttcac cggcccaggt gtgaaacatc tttcatgcga tgctcggttt 1020 gccattagca acatgactac agaattcggc ggaattaccg gtgtctttgt gcccgatcaa 1080 attacagaag aaltcatcca gaagcgacgt ctgccccgac acaaaaacac cagcgtctac 1140 ficgiitgfl.cgp, r,ga.gtangr,r, gaaa.occatg a.gatagar.ct tggcgaggtg 1200 cgatctttcc tggccaaata ccccaaccct gacgacgtcg ttccggtcac tgagcaggaa 1260 ggcatgcacc tggatggatg ctttattggt gcctgcacca ctgccgagga ggatctgatt 1320 ctcggtgctc tcgtgctgga acaagggctc cagaatggct. tgaagccagt. ttctcacgga 丄380 aagaggaagg UgLtccggg cLcagLgccc aLccUcaLd gactccgLga gcUgggcU 1440 gcgcagatct acgaggatgc tggatttgag atcggcattc caggatgcag ctactgtgtc 1500 ggaatgtcgg ctgatcaggc tggacctgga gaagtctgga tatcttccca gaaccgcaac 1560 tttgagaacc gtatgggcaa aggccccatg ggaaatcttg catcagctgc cactgttgcg 1620 gcatcgtctt tcgagatgaa gctgaaagat ccacatgaat acctcgcagc catcgatctc 1680 gaaagatggc ataccctccg cggtgtttct gtgtctgcaa cagactccac acaagaacgc 1740 atctcttata tggaacctag tggctccgcg actgcggagg caaagactgt tgactcacca 1800 gacgtcaagg taacagaggc aaatactcca gagacagcag atagctcttc gtccgacctc 1860 atgacaggca aagtgcagcg actgggcgat tttattgata ccgatgcttt ggcccctgcc 1920 cagtttctca tcggcatgtc aaacaatcag atcgcaggcg agcactgcct cgagcacacc 1980 caccccgagt ttcggcagcg cgtgaaagac ggcttcaata tcgtcgtggc aggcaaggca 2040 ttcggatgtg gatcgtcccg cgaacaagcg gtcatggcgc tgttaggctg cggcgtccaa 2100 tgtgtgattg rnaagtrata rtcatttatr ttrcagrgra nratgcrrag trttggtctt 2160 ttgggcatca cactgaccga cgaggagttt tacgacgcgg ctcaagacgg caac^agatt 2220 tccatagact tcaagaccaa ggtgatcaac gtggaiggga agcaatacgc tttccagttg 2280 agtcagatgg agcgggaact ctttcagcat ggcggtattg cgtcggcctt. ccagaaattt. 2340 g^aaaccggc LgLlcgagca gaLgacuiigu CGgaagaaLc Lgggggglgc caaglcccLL 2400 gcgctgcgtg gaagtgggga gagtgctggt ccgcatgcag gtttgcagtg gtagtagcct 2460 acttagtatc gtgaagatag tcttcagt.aa aacaagacgt agctttacta ttatgatatt 2520 cgttatgcat. g 2531 <210> 3 <211> 817 <212> PRT <213〉野生型乌头酸酶 <400> 3 Met Gly Asp Ala Ser Glu Pro Tyr Ala Pro Ser Leu Leu Leu Val Leu 15 10 15 Gin Gin Thr Arg Asp Val Val Leu Ser Glu Ala Asp Thr Tyr Ala Leu 20 25 30 Pro Thr Leu Gly Asn Leu Leu Thr Gin Leu Val Arg Val Val Asp Ala. 35 40 45 Leu Arg Ala Gin Asp His Pro Arg Glu Ala Asn Ala Leu Thr Asp Val
[0005] 50 55 60 Leu Ala lie Ser Gin Gin Pro Thr Glu Met Gly Gly Leu Gly Leu Ser 65 70 75 80 Glu Ala Asp Thr Leu Thr Pro Glu Gin Glu Ala Glu lie Thr Phe Leu 85 90 95 Va.1 Thr Ala Trp ]>e\i Glu Ala Leu Asn Ser Ala Asp Arg Ala. Arg Ala. loo 105 no Pro Pro Val Pro Leu A丄a Val Arg Pro Pro Gly Arg Arg Gly Met Thr 115 120 125 Leu Ser Glu Lys lie Phe Ala Leu His Asp Leu Gly Arg Lys Gly Ser 130 135 140 Val Ala Pro Gly Glu Leu lie Arg Val Asp Val Asp Trp Val lie Ala 145 150 155 160 Ser Glu Ala Ser Trp Gin Gly Met Glu Gin Thr Tyr Glu Arg Leu Gly 165 170 175 Lys Pro Gly He Tyr Arg Asn Asp Arg Phe Trp Leu Ala Gly Asp His 180 185 190 Val Val Asp Pro Arg Val Asn Glu Val Pro Lys Val Lys Ala Leu lie 195 200 205 Asp Ala Ser Glu Arg Ala Lys Arg Val Phe Lys Met Thr Asp Tyr Gin 210 215 220 Gly Met Asn Tyr Thr Tie i,eu His Thr Glu Phe Tyr Arg Glu Arg Ala 225 230 235 240 Gin Pro Gly Met Val Val Val Gly Scr Asp Scr His Thr Cys Scr Scr 245 250 255 Gly Ala Leu Gly Cys Leu Ala lie Gly Leu Gly Ala Ala Asp Val Thr 260 265 270 Leu Pro Leu Val Thr Gly G丄u Thr Trp Phe Lys Val Pro G·丄u Ser Vai 275 280 285 Asn lie Arg Leu Val Gly Ala Pro Lys Pro Gly lie Gly Gly Lys Asp 290 295 300 Thr lie Leu Tyr He Leu Gin Gin Leu Lys Arg Asn Thr Val Ala Ala 305 310 315 320 Asp Arg lie Val Glu Phe Thr Gly Pro Gly Val Lys His Leu Ser Cys 325 330 335 Asp Ala Arg Phe Ala He Ser Asn Met Thr Thr Glu Phe Gly Gly lie 340 345 350 Thr Gly Va.1 Phe Val Pro Asp Gin Tie Thr Glu Glu Phe Tie Gin I,ys 355 360 365 Arg Arg Leu Pro Arg His Lys Thr Ala Ser Val Tyr Phe Lys Pro Asp 370 375 380 Asp Asp Ala Glu Tyr Ala -Glu Thr His Glu He Asp Leu Gly Glu Val 385 390 395 400 Arg Ser Phe Leu A丄a Lys Tyr Pro Asn Pro Asp Asp Val Vai Pro Val
[0006] 405 410 415 Thr Glu Gin Glu Gly Met His Leu Asp Gly Cys Phe lie Gly Ala Cys 420 425 430 Thr Thr Ala Glu Glu Asp Leu lie Leu Gly Ala Leu Val Leu Glu Gin 435 440 445 Gly Leu Gin Asn Gly Leu Lys Pro Val Ser His Gly Lys Arg Lvs Val 450 455 460 Val Pro Gly Ser Val Pro lie Leu His Arg Leu Arg Glu Leu Gly Leu 465 470 475 480 Ala Gin lie Tyr Glu Asp Ala Gly Phe Glu He Gly lie Pro Gly Cys 485 490 495 Ser Tyr Cys Val Gly Met Ser Ala Asp Gin Ala Gly Pro Gly Glu Val 500 505 510 Trp lie Ser Ser Gin Asn Arg Asn Phe Glu Asn Arg Met Gly Lys Gly 515 520 525 Ser lie Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ala Thr Val Ala Ala Ser Ser Phe 530 535 540 Glu Met Lys Leu Lys Asp Pro His Glu Tyr Leu Ala Ala lie Asp Leu 545 550 555 560 Glu Arg Trp His Thr Leu Arg Gly Val Ser Val Ser Ala Thr Asp Ser 565 570 575 Thr Gin Glu His lie Ser Tyr Met Glu Pro Ser Gly Ser Ala Thr Ala 580 585 590 Glu Ala Lys Thr Val Asp Ser Pro Asp Val Lys Val Thr Glu Ala Asn 595 600 605 Thr Pro Glu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Asp Leu Mel Thr Gly Lys 610 615 620 Val Gin Arg Leu Gly Asp Phe lie Asp Thr Asp Ala Leu Ala Pro Ala 625 630 635 640 Gin Phe Leu lie Gly Met Ser Asn Asn Gin lie Ala Gly Glu His Cys 645 650 655 Leu Glu His Thr His Pro Glu Phe Arg Gin Arg Val Lys Asp Gly Phe 660 665 670 Asn lie Val Val Ala Gly Lys Ala Phe Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu 675 680 685 Gin Ala Val Met Ala Leu Leu Gly Cys Gly Val Gin Cys Val lie Ala 690 695 700 Lys Ser Tyr Ser Phe He Phe Gin Arg Asn Met Pro Ser Leu Gly Leu 705 710 715 720 Leu Gly lie Thr Leu Thr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Ala Ala Gin Asp 725 730 735 Gly Asn Glu He Ser lie Asp Phe Lys Thr Lys Val He Asn Val Asp 740 745 750 Gly Lys Gin Tyr Ala Phe Gin Leu Ser Gin Met Glu Arg Glu Leu Phe
[0007] 755 760 765 Gin His Gly Gly lie Ala Ser Ala Phe Gin Lys Phe Gly Asn Arg Leu 770 775 780 Phe Glu Gin Met Thr Arg Pro Lys Asn Leu Gly Ala Lys Ser Leu 785 790 795 800 Ala. Leu Arg Gly Ser Gly Glu Ser Ala. Gly Pro His Ala. Gly i.eu Gin 805 810 815 Trp <210> 4 <211> 2531 <212> DNA <213〉野生型乌头酸酶 <400> 4 atgggtgacg ccagcgaacc atatgcccct tcgctgctgc tggtattgca gcaaacccgg 60 gatgtcgtcc tctccgaggc agacacatac gcattgccga ccctaggaaa tctgcttacc 120 cagctggtgc gagtggtcga tgcacttcga gcgcaggacc acccccggga ggccaatgcc 180 ctcaccgatg tcctcgcgat cagccaacaa cccacggaga tgggaggact cggtctatcc 240 gaagcggaca ctctgacacc cgagcsggaa gctgaaatca ccttcctggt gacggcgtgg 300 ctcgaagctt tgaactcagc cgatcgcgcc agggcaccgc ccgttccgct cgcggtccga 360 ccccccggtc gacgtggcat gacgctgagt gagaagatct ttgcgcttca cgatctlggt 420 cgnnagggat nogtggcgoc tggggagttg atcogggtgg Rc.gtc.gnc.tg ggttattget 480 tccgaggcat catggcaggg catggaacaa acgtatgagc gtctcgggaa acctggaatc 540 tatcggaatg accggttctg gctggcggga gatcatgttg tggoccctcg cgtgaatgag 600 gtccccaaag ttaaggcatt gattgacgct agtgagaggg ccaagcgtgt cttcaaaatg 660 accgactatc agggcat.gaa ctatactatt cttcataccg agttctaccg cgagcgagcc 720 cagccgggta tggtggtcgt gggttccgat tcccacacct gctcgtccgg agcattaggc 780 tgcctggcca ttgggltggg cgcagccgat gtgacccttc cattggtcac cggagagacc 840 tggttcaaag tgcccgaatc ggtcaacatt cgtctcgtcg gtgctcccaa gcccggaatt 900 ggaggcaagg acacgatctt gtacat'cctg eaacaactga agcgaaacac cgtggccgca 960 gaccggattg tcgagttcac cggcccaggt gtgaaacatc tttcatgcga tgctcggttt 1020 gccattagca acargactac agaattcggc ggaattaccg gtgtctttgt gcccgatcaa 1080 atiacagaag aattcatcca gaagcgacgt ctgccccgac acaaaaccgc cagcgtctac 1140 ttcaaacccg atgatgacgc cgagtacgcc gaaacccatg aaatagacct tggcgaggtg 1200 cgatctttcc tggccaaata ccccaaccct gacgacgtcg ttccggtcac tgagcaggaa 1260 ggcatgcacc tggatggatg ctttattggt gcctgcacca ctgccgagga ggatctgatt 1320 ctcggtgctc tcgtgctgga acaagggctc cagaatggct tgaagccagt ttctcacgga 1380 aagnggaagg ttgrtrcggg ctcagtgrcc arnnttcata gactcrgtga gnttgggctt 1440 gcgcagatct acgaggatgc tggatt.tgag atcggcattc caggatgcag ctactgtgtc 1500 ggaatgtcgg ctgatcaggc tggacctgga gaagtctgga tatcttcGca gaaccgcaac 1560 tttgagaacc gtaigggcaa aggctccatc ggaaatcttg catcagctgc cacagttgcg 1620 gcatCKtctt Lc^agatgaa gctgaaagat ccacatgaat acctcgcagc catcgatclc 1680 gaaagatggc ataccctccg cggtgtttct gtgtctgcaa cagactccac acaagaacac 1740 atctcttata tggaacctag tggctccgcg actgcggagg caaagactgt tgactcacca 1800
[0008] gacgtcaagg taacagaggc aaatactcca gfigacfigcag atagctcttc gtccgacctc 1860 atgacaggca aagtgcagcg actgggcgat tttattgata ccgatgcttt ggcccctgcc 1920 cagtttctca tcggcatgtc aaacaatcag atcgcaggcg agcactgcct cgagcacacc 1980 caccccgagt ttcggcagcg cgtgaaagac ggcttcaata tcgtcgtggc aggcaaggca 2040 ttcggatgtg gatcgtcccg cgaacaagcg gtcatggcgc tgttaggctg cggcgtccaa 2100 tgtgtgattg ccaagtcata ctcatttatc ttccagcgca acatgcccag tcttggtctt 2160 "ttgggcatca cactgaccga cgaggagttt tacgacgcgg ctcaagacgg caacgagatt 2220 tGGatagact tcaagaGcaa ggtgatGaaG gtggatggga agcaatacgc tttGcagttg 2280 agtcagatgg agcgggaact ctttcagcat ggcggtattg cgtcggcctt ccagaaattt 2340 ggaaaccggc tgttcgagca gatgaccaga ccgaagaatc tggggggtgc caagtccctt 2400 gcgctgcgtg gaagtgggga gagtgctggt ccgcatgcag gtttgcagtg gtagtagcct 2460 acttagtatc gtgaagatag tcttcagtaa aacaagacgt agctttacta ttatgatatt 2520 cgttatgcat g 2531 <210> 5 <211〉 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 5 gatcgagctc atggggtgac gccagcga 28 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 6 gatcgcggcc gccatgcata acgaatatca 30
【权利要求】
1. 乌头酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述突变体的基因。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
4. 含有权利要求2或3所述基因的载体。
5. 含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体的工程菌。
6. 权利要求2或3所述基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的应用。
7. 用于PCR特异性扩增权利要求2或3所述基因的引物对，其特征在于，所述引物对 为： 正向引物：5 ^ -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3 ' 反向引物：5' -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3'。
【文档编号】C12N1/19GK104087570SQ201410245359
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】李荣杰, 尚海涛, 杨为华, 邓远德, 徐斌, 杨金环 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司
【专利摘要】本发明提供一种乌头酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。编码该突变体的基因序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，经计算，乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比，降低了73％，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。
【专利说明】乌头酸酶突变体、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种乌头酸酶突变体、其编码基因及应 用。
【背景技术】
[0002] 柠檬酸，又名枸橼酸，化学名称是2-羟基丙烷-1，2, 3-三羧酸。因其具有令人愉悦 的酸味，人口爽快，无后酸味，安全无毒，已成为当前世界上生产量和消费量最大的食用有 机酸。世界上柠檬酸行业的集约化程度非常高，生产重心已转移至中国，我国柠檬酸产量和 出口量已连续多年居世界第一。2008年，我国柠檬酸产能达到10万吨，占世界总量的70% 左右，其中70-80%用于生产饮料、食品，其余用于医药、化工、环保、化妆品、纺织、印染、建 筑等各个领域。
[0003] 黑曲霉（Aspergillus niger)是生产朽1檬酸最常见的菌株，已有报道称黑曲霉在 发酵生产柠檬酸过程中存在三羧酸循环的酶系，其中由柠檬酸到异柠檬酸，即柠檬酸一顺 乌头酸一异柠檬酸，两步反应均由乌头酸酶（aconitase，AC0)催化。因此阻断柠檬酸向下 的代谢是柠檬酸的积累关键，即阻断乌头酸酶的催化反应。通过基因工程方法使黑曲霉中 乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种乌头酸酶突变体、其编码基因及应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的乌头酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006] 与野生型的乌头酸酶（野生型乌头酸酶的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和4所示）相比，本发明的乌头酸酶突变体具体的氨基酸序列的改变是：M226V(第226 位甲硫氨酸变为缬氨酸），N227Y (第227位天冬酰胺变为酪氨酸），T376N (第376位苏氨酸 变为天冬酰胺），A377T (第377位丙氨酸变为苏氨酸），S529P (第529位丝氨酸变为脯氨 酸），I530M(第530位异亮氨酸变为甲硫氨酸），H580R(第580位组氨酸变为精氨酸）。
[0007] 本发明还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 本发明还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因的载体、。
[0009] 本发明还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因、或上述载体的转基因细胞系及 工程菌。
[0010] 本发明还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的 应用。
[0011] 本发明还提供用于PCR特异性扩增编码所述乌头酸酶突变体的基因的引物对，所 述引物对为：
[0012] 正向引物：5，-GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3，
[0013]反向引物：5，-GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3，。
[0014] 本发明进一步提供所述乌头酸酶突变体的构建方法，包括以下步骤：
[0015] (1)从黑曲霉（Aspergillus niger)基因组DNA中，扩增AC0的编码基因 aco ;
[0016] ⑵采用易错PCR技术，以AC0的编码基因 aco为模板，扩增获得AC0突变体基因；
[0017] (3)将步骤（2)所得易错PCR产物及表达质粒pET28a(+)用Sac I和Not I双酶 切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，涂布至含Kan的LB平板，将平板 置37°C恒温培养箱培养，即得构建得到重组AC0基因突变库；
[0018] (4)含Kan的LB平板上长出菌落，挑取其中的100个单克隆，转接到含Kan的LB 液体培养基中，37°C摇床培养，待菌液0D_长至0. 8时，加入终浓度为0. 2mM的IPTG诱导， 放回37°C摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，测定AC0野生型和突变体酶活，挑选酶 活力最低的一株，并测定其基因序列（SEQ ID N0. 2)。
[0019] 本发明通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，经 计算，乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比，降低了 73 %，理论上可提高柠檬 酸的产量和/或产率。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例1中野生型乌头酸酶基因的PCR扩增结果。
[0021] 图2为本发明实施例5中乌头酸酶突变体蛋白的SDS-PAGE电泳结果；其中，1为 未诱导的菌体经超声破碎后，离心所得上清，2为乌头酸酶野生型蛋白，3为乌头酸酶突变 体蛋白。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0023] 实施例1乌头酸酶基因的获得
[0024] 以 lyg黑曲霉（Aspergillus niger)基因组DNA为PCR反应模板，按SEQ ID N0.4 的序列设计正向引物 AC0-F 为 5' -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3'，反向引物 AC0-R 为Y -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3'。其中，斜体字母部分分别为酶切位点Sac I和Not I。PCR反应在50 μ 1总体积中进行，反应条件为在94°C变性5min后开始循环； 94°C变性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30个循环；再于72°C延伸10min。取3μ 1 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。取100 μ 1 PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。
[0025] 实施例2野生型乌头酸酶基因表达载体的构建
[0026] 实施例1中PCR产物经限制性内切酶Sac I和Not I双酶切消化后，与同样用Sac I和Not I内切酶消化的pET-28a(+)质粒（Novagen公司）进行连接反应，构建的载体被称 为pET-ACO,然后用连接产物pET-ACO混合物转化大肠杆菌DH5- α (购自promega公司）， 并进行序列测定提取转化菌体库的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株（Promega公司）。
[0027] 实施例3易错PCR扩增黑曲霉乌头酸酶基因
[0028] 利用Taq DNA聚合酶不具有3' -5'校对功能的性质，在高镁离子浓度（5-9mmol/ L)和不同浓度dNTP的浓度下（1. 5-3. 5mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引 入随机突变，构建突变库。实验中最优的突变率约为〇. 6 %。
[0029] 易错PCR反应体系（100 μ 1):
[0030] lOxPCR反应缓冲液 丨Ομ丨 dATP 2 μ? dTTP 4 μ? dCTP 4 ul dGTP 2 μ? MgCb 6 μ? 正向引物 4μ1 反向引物 4μ1 DNA模板（实施例]PCR片段） 4μ1 TaqDNA聚合酶 1 μ? ddH20 59 μ I 总体积 100 μΙ
[0031] PCR反应程序为：96°C预变性4min ;94°C变性lmin，56°C退火lmin，75°C延伸 2min，共45个循环；最后75°C延伸15min。采用胶回收方法回收PCR产物。取5μ1产物进 行1 %琼脂糖凝胶电泳检验，_20°C保存备用。
[0032] 实施例4 pET-ACOM表达载体的构建
[0033] 实施例3中PCR产物经限制性内切酶Sac I和Not I双酶切消化后，与用Sac I 和Not I内切酶消化的pET-28a(+)质粒进行连接反应，构建的载体被命名为pET-ACOM，然 后用连接产物pET-ACOM混合物转化大肠杆菌DH5 α，构建转化菌体突变库。
[0034] 实施例5构建表达突变库及高产量突变体的筛选
[0035] 提取转化菌体库的质粒，分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，获得转化子约100 株，构建表达突变体库。挑取突变菌株至含kan的LB培养基（150 μ 1/孔）的96孔板中， 37°C、150rpm培养，待0D值达0. 6-0. 8,加入IPTG (终浓度0. 2mmol/L)，继续培养12h，收集 菌体。超声破碎菌体，离心收集上清，并进行酶活测定。检测酶活性最低的菌株，并挑选其克 隆，并提取质粒，测定与野生型乌头酸酶对应的基因序列。测定的基因序列为SEQ ID N0. 2 所示，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。乌头酸酶突变体蛋白的SDS-PAGE电泳结 果如图2所示。
[0036] 乌头酸酶的酶活检测：按照乌头酸酶活性检测试剂盒（Biovision公司）进行。经 计算，野生型蛋白的酶活为6. 3u/L，突变体蛋白的最低酶活为1. 7u/L，结果表明，通过易错 PCR对AC0进行改造，获得了酶活力降低了 73 %的突变株。
[0037] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0001] 序列表 <110〉安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 <120〉乌头酸酶突变体、其编码基因及应用 <130> KHP141112765.8 <160> 6 <170> Patentln version 3,3 <2丄0>丄 <211> 817 <212〉 PRT <213〉乌头酸酶突变体 <400> 1 Met Gly Asp Ala Ser Glu Pro Tyr Ala Pro Ser Leu Leu Leu Val Leu 15 10 15 Gin Gin Thr Arg Asp Val Val Leu Ser Glu Ala Asp Thr Tyr Ala Leu 20 25 30 Pro Thr \mi Gly Asn Leu i.nu Thr Gin f.eu Va.1 Arg Va.1 Val Asp Ala 35 40 45 Leu Arg Ala Gin Asp His Pro Arg Glu Ala Asn. Ala Leu Thr Asp Val 50 55 60 Leu Ala丄ie Ser Gin Gin Pro Thr G丄u Met G丄y Gly Leu G丄y leu Ser 65 70 75 80 Glu Ala Asp Thr Leu Thr Pro Glu Gin Glu Ala Glu lie Thr Phe Leu 85 90 95 Val Thr Ala Trp Leu Glu Ala Leu Asn Ser Ala Asp Arg Ala Arg Ala 100 105 110 Pro Pro Val Pro Leu Ala Val Arg Pro Pro Gly Arg Arg Gly MeL Thr 115 120 125 \.f)U Ser Glu T,ys Tie Phe Ala i,eu His Asp f,eu Gly Arg Lys Gly Ser 130 135 .140 Val Ala Pro Gly Glu Leu Lie Arg Val Asp Val Asp Trp Val lie Ala 145 150 155 160 Ser Glu Aia Ser Trp Gin G丄y Met Giu G丄n Thr Tyr Glu Arg Leu Gly 165 170 175 Lys Pro Gly lie Tyr Arg Asn Asp Arg Phe Trp Leu Ala Gly Asp His 180 185 190 Val Val Asp Pro Arg Val Asn Glu Val Pro Lys Val Lys Ala Leu lie 195 200 205 Asp Ala Ser Glu Arg Ala Lys Arg Val Phe Lys Mel Thr Asp Tyr Glri 210 215 220 Gly Val Tyr Tyr Thr Tift ?,^ιι His Thr Glu Phe Tyr Arg Gin Arg Ala 225 230 235 240 Gin Pro Gly Met Val Val Val Gly Ser Asp Ser His Thr Cys Ser Ser 245 250 255
[0002] Gly Ala Leu Gly Cys Leu Ala lie Gly Leu Gly Ala Ala Asp Val Thr 260 265 270 Leu Pro Leu Val Thr Gly Glu Thr Trp Phe Lys Val Pro Glu Ser Val 275 280 285 Asn lie Arg Leu Val Gly Ala Pro Lys Pro Gly lie Gly Gly Lys Asp 290 295 300 Thr lie Leu Tyr lie Leu Gin Gin Leu Lys Arg Asn Thr Val Ala Ala 305 310 315 320 Asp Arg lie Val Glu Phc Thr Gly Pro G丄y Val Lys His Leu Ser Cys 325 330 335 Asp Ala Arg Phe Ala He Ser Asn Met Thr Thr Glu Phe Gly Gly lie 340 345 350 Thr Gly Val Phe Val Pro Asp Gin He Thr Glu Glu Phe lie Gin Lys 355 360 365 Arg Arg Leu Pro Arg His Lys Asn Thr Ser Val Tyr Phe Lys Pro Asp 370 375 380 Asp Asp Ala Glu Tyr Ala Glu Thr His Glu lie Asp Leu Gly Glu Val 385 390 395 400 Arg Ser Phe Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Pro Asp Asp Val Val Pro Val 405 410 415 Thr Glu Gin Glu Gly Met His Leu Asp Gly Cys Phe lie Gly Ala Cys 420 425 430 Thr Thr Ala Glu Glu Asp Leu lie Leu Gly Ala Leu Val Leu Glu Gin 435 440 445 Gly Leu Gin Asn Gly Leu Lys Pro Val Ser His Gly Lys Arg Lys Val 450 455 460 Val Pro Gly Ser Val Pro lie Leu His Arg Leu Arg Glu Leu Gly Leu 465 470 475 480 Ala Gin lie Tyr Glu Asp Ala Gly Phe Glu lie Gly lie Pro Gly Cys 485 490 495 Ser Tyr Cys Val Gly Met Ser Ala Asp G丄n Ala G_Ly Pro G丄y Glu Val 500 505 510 Trp 丄丄e Ser Ser Gin Asn Arg Asn Phe G丄u Asn Arg Met G丄y Lys Gly 515 520 525 Pro Met Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ala Thr Val Ala Ala Ser Ser Phe 530 535 540 Glu Met Lys [,eu i,ys Asp Pro His Glu Tyr Leu Ala Ala Tie Asp Leu 545 550 555 560 Glu Arg Trp His Thr Leu Arg Gly Va.1 Ser Va.l Ser Ala. Thr Asp Ser 565 570 575 Thr Gin Glu Arg lie Ser Tyr Met Glu Pro Ser Gly Ser Ala Thr Ala 580 585 590 Glu Ala Lys Thr Val Asp Ser Pro Asp Val Lys Val Thr Glu Ala Asn 595 600 605
[0003] Thr Pro Glu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Asp Leu Met Thr Glv Lys 610 615 620 Val Gin Arg Leu Gly Asp Phe He Asp Thr Asp Ala Leu Ala Pro Ala 625 630 635 640 Gin Pbe Leu He Gly Met Ser Asn Asn Gin lie Ala Gly G]u His Cys 645 650 655 Leu Glu His Thr His Pro Glu Phe Arg Gin Arg Val Lys Asp Gly Phe 660 665 670 Asn lie Val Val Ala Gly Lys Ala Phe Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu 675 680 685 Gin Ala Val Met Ala Leu Leu Gly Cys Gly Val Gin Cys Val lie Ala 690 695 700 Lys Ser Tyr Ser Phe He Phe Gin Arg Asn Met Pro Ser Leu Gly Leu 705 710 715 720 Leu Gly lie Thr Leu Thr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Ala Ala Gin Asp 725 730 735 Gly Asn Glu He Ser He Asp Phe Lys Thr Lys Val lie Asn Val Asp 740 745 750 Gly Lys Gin Tyr Ala Phe Gin Leu Ser Gin Met Glu Arg Glu Leu Phe 755 760 765 Gin His Gly Gly lie Ala Ser Ala Phe Gin Lys Phe Gly Asn Arg Leu 770 775 780 Phe Glu Gin Met Thr Arg Pro Lys Asn Leu Gly Gly Ala Lys Ser Leu 785 790 795 800 Ala Leu Arg Gly Ser Gly Glu Ser Ala Gly Pro His Ala Gly Leu Gin 805 810 815 Trp <210> 2 <211> 2531 <212> DNA <213〉乌头酸酶突变体基因 <400> 2 atgggtgacg ccagcgaacc atatgcccct tcgctgctgc tggtatigca gcaaacccgg 60 gatgtcgtcc tctccgaggc agacacatac gcattgccga ccctaggaaa tctgcttacc 120 cagctggtgc gagtggtcga tgcacttcga gcgcaggacc acccccggga ggccaatgcc 180 ctcaccgatg tcctcgcgat cagccaacaa cccacggaga tgggaggact cggtctatcc 240 gaagcggana rtntgacarc cgagcaggaa gctgaaatca cnttcrtggt gacggrgtgg 300 ctcgaagctt tgaactcagc cgatcgcgcc agggcaccgc ccgttccgct cgcggtccga 360 ccccccggtc gacgtggcat gacgctgagt gagaagatct ttgcgcttca cgatcttggt 420 cgcaagggat ccgtggcgcc tggggagttg atccgggtgg acgtcgactg ggttattgct 480 tccgaKKcat catggcaggg catggaacaa acgtatgagc gtctcgggaa acctggaalc 540 tatcggaatg accggttctg gctggcggga gatcatgttg tggaccctcg cgtgaatgag 600 gtccccaaag ttaaggcatt gattgacgct agtgagaggg ccaagcgtgt cttcaaaatg 660
[0004] accgactatc agggcgtgta ctatactatt cttcataccg agttctaccg cgagcgagcc 720 cagccgggta tggtggtcgt gggttccgat tcccacacct gctcgtccgg agcattaggc 780 tgcctggcca ttgggttggg cgcagccgat gtgacccttc cattggtcac cggagagacc 840 tggttcaaag tgcccga.atc ggtcaacatt cgtctcgtcg gtgctcccaa gcccggaa.tt 900 ggaggcaagg acacgatctt gtacatcctg caacaactga agcgaaacac cgtggccgca 960 gaccggattg tcgagttcac cggcccaggt gtgaaacatc tttcatgcga tgctcggttt 1020 gccattagca acatgactac agaattcggc ggaattaccg gtgtctttgt gcccgatcaa 1080 attacagaag aaltcatcca gaagcgacgt ctgccccgac acaaaaacac cagcgtctac 1140 ficgiitgfl.cgp, r,ga.gtangr,r, gaaa.occatg a.gatagar.ct tggcgaggtg 1200 cgatctttcc tggccaaata ccccaaccct gacgacgtcg ttccggtcac tgagcaggaa 1260 ggcatgcacc tggatggatg ctttattggt gcctgcacca ctgccgagga ggatctgatt 1320 ctcggtgctc tcgtgctgga acaagggctc cagaatggct. tgaagccagt. ttctcacgga 丄380 aagaggaagg UgLtccggg cLcagLgccc aLccUcaLd gactccgLga gcUgggcU 1440 gcgcagatct acgaggatgc tggatttgag atcggcattc caggatgcag ctactgtgtc 1500 ggaatgtcgg ctgatcaggc tggacctgga gaagtctgga tatcttccca gaaccgcaac 1560 tttgagaacc gtatgggcaa aggccccatg ggaaatcttg catcagctgc cactgttgcg 1620 gcatcgtctt tcgagatgaa gctgaaagat ccacatgaat acctcgcagc catcgatctc 1680 gaaagatggc ataccctccg cggtgtttct gtgtctgcaa cagactccac acaagaacgc 1740 atctcttata tggaacctag tggctccgcg actgcggagg caaagactgt tgactcacca 1800 gacgtcaagg taacagaggc aaatactcca gagacagcag atagctcttc gtccgacctc 1860 atgacaggca aagtgcagcg actgggcgat tttattgata ccgatgcttt ggcccctgcc 1920 cagtttctca tcggcatgtc aaacaatcag atcgcaggcg agcactgcct cgagcacacc 1980 caccccgagt ttcggcagcg cgtgaaagac ggcttcaata tcgtcgtggc aggcaaggca 2040 ttcggatgtg gatcgtcccg cgaacaagcg gtcatggcgc tgttaggctg cggcgtccaa 2100 tgtgtgattg rnaagtrata rtcatttatr ttrcagrgra nratgcrrag trttggtctt 2160 ttgggcatca cactgaccga cgaggagttt tacgacgcgg ctcaagacgg caac^agatt 2220 tccatagact tcaagaccaa ggtgatcaac gtggaiggga agcaatacgc tttccagttg 2280 agtcagatgg agcgggaact ctttcagcat ggcggtattg cgtcggcctt. ccagaaattt. 2340 g^aaaccggc LgLlcgagca gaLgacuiigu CGgaagaaLc Lgggggglgc caaglcccLL 2400 gcgctgcgtg gaagtgggga gagtgctggt ccgcatgcag gtttgcagtg gtagtagcct 2460 acttagtatc gtgaagatag tcttcagt.aa aacaagacgt agctttacta ttatgatatt 2520 cgttatgcat. g 2531 <210> 3 <211> 817 <212> PRT <213〉野生型乌头酸酶 <400> 3 Met Gly Asp Ala Ser Glu Pro Tyr Ala Pro Ser Leu Leu Leu Val Leu 15 10 15 Gin Gin Thr Arg Asp Val Val Leu Ser Glu Ala Asp Thr Tyr Ala Leu 20 25 30 Pro Thr Leu Gly Asn Leu Leu Thr Gin Leu Val Arg Val Val Asp Ala. 35 40 45 Leu Arg Ala Gin Asp His Pro Arg Glu Ala Asn Ala Leu Thr Asp Val
[0005] 50 55 60 Leu Ala lie Ser Gin Gin Pro Thr Glu Met Gly Gly Leu Gly Leu Ser 65 70 75 80 Glu Ala Asp Thr Leu Thr Pro Glu Gin Glu Ala Glu lie Thr Phe Leu 85 90 95 Va.1 Thr Ala Trp ]>e\i Glu Ala Leu Asn Ser Ala Asp Arg Ala. Arg Ala. loo 105 no Pro Pro Val Pro Leu A丄a Val Arg Pro Pro Gly Arg Arg Gly Met Thr 115 120 125 Leu Ser Glu Lys lie Phe Ala Leu His Asp Leu Gly Arg Lys Gly Ser 130 135 140 Val Ala Pro Gly Glu Leu lie Arg Val Asp Val Asp Trp Val lie Ala 145 150 155 160 Ser Glu Ala Ser Trp Gin Gly Met Glu Gin Thr Tyr Glu Arg Leu Gly 165 170 175 Lys Pro Gly He Tyr Arg Asn Asp Arg Phe Trp Leu Ala Gly Asp His 180 185 190 Val Val Asp Pro Arg Val Asn Glu Val Pro Lys Val Lys Ala Leu lie 195 200 205 Asp Ala Ser Glu Arg Ala Lys Arg Val Phe Lys Met Thr Asp Tyr Gin 210 215 220 Gly Met Asn Tyr Thr Tie i,eu His Thr Glu Phe Tyr Arg Glu Arg Ala 225 230 235 240 Gin Pro Gly Met Val Val Val Gly Scr Asp Scr His Thr Cys Scr Scr 245 250 255 Gly Ala Leu Gly Cys Leu Ala lie Gly Leu Gly Ala Ala Asp Val Thr 260 265 270 Leu Pro Leu Val Thr Gly G丄u Thr Trp Phe Lys Val Pro G·丄u Ser Vai 275 280 285 Asn lie Arg Leu Val Gly Ala Pro Lys Pro Gly lie Gly Gly Lys Asp 290 295 300 Thr lie Leu Tyr He Leu Gin Gin Leu Lys Arg Asn Thr Val Ala Ala 305 310 315 320 Asp Arg lie Val Glu Phe Thr Gly Pro Gly Val Lys His Leu Ser Cys 325 330 335 Asp Ala Arg Phe Ala He Ser Asn Met Thr Thr Glu Phe Gly Gly lie 340 345 350 Thr Gly Va.1 Phe Val Pro Asp Gin Tie Thr Glu Glu Phe Tie Gin I,ys 355 360 365 Arg Arg Leu Pro Arg His Lys Thr Ala Ser Val Tyr Phe Lys Pro Asp 370 375 380 Asp Asp Ala Glu Tyr Ala -Glu Thr His Glu He Asp Leu Gly Glu Val 385 390 395 400 Arg Ser Phe Leu A丄a Lys Tyr Pro Asn Pro Asp Asp Val Vai Pro Val
[0006] 405 410 415 Thr Glu Gin Glu Gly Met His Leu Asp Gly Cys Phe lie Gly Ala Cys 420 425 430 Thr Thr Ala Glu Glu Asp Leu lie Leu Gly Ala Leu Val Leu Glu Gin 435 440 445 Gly Leu Gin Asn Gly Leu Lys Pro Val Ser His Gly Lys Arg Lvs Val 450 455 460 Val Pro Gly Ser Val Pro lie Leu His Arg Leu Arg Glu Leu Gly Leu 465 470 475 480 Ala Gin lie Tyr Glu Asp Ala Gly Phe Glu He Gly lie Pro Gly Cys 485 490 495 Ser Tyr Cys Val Gly Met Ser Ala Asp Gin Ala Gly Pro Gly Glu Val 500 505 510 Trp lie Ser Ser Gin Asn Arg Asn Phe Glu Asn Arg Met Gly Lys Gly 515 520 525 Ser lie Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ala Thr Val Ala Ala Ser Ser Phe 530 535 540 Glu Met Lys Leu Lys Asp Pro His Glu Tyr Leu Ala Ala lie Asp Leu 545 550 555 560 Glu Arg Trp His Thr Leu Arg Gly Val Ser Val Ser Ala Thr Asp Ser 565 570 575 Thr Gin Glu His lie Ser Tyr Met Glu Pro Ser Gly Ser Ala Thr Ala 580 585 590 Glu Ala Lys Thr Val Asp Ser Pro Asp Val Lys Val Thr Glu Ala Asn 595 600 605 Thr Pro Glu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Asp Leu Mel Thr Gly Lys 610 615 620 Val Gin Arg Leu Gly Asp Phe lie Asp Thr Asp Ala Leu Ala Pro Ala 625 630 635 640 Gin Phe Leu lie Gly Met Ser Asn Asn Gin lie Ala Gly Glu His Cys 645 650 655 Leu Glu His Thr His Pro Glu Phe Arg Gin Arg Val Lys Asp Gly Phe 660 665 670 Asn lie Val Val Ala Gly Lys Ala Phe Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu 675 680 685 Gin Ala Val Met Ala Leu Leu Gly Cys Gly Val Gin Cys Val lie Ala 690 695 700 Lys Ser Tyr Ser Phe He Phe Gin Arg Asn Met Pro Ser Leu Gly Leu 705 710 715 720 Leu Gly lie Thr Leu Thr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Ala Ala Gin Asp 725 730 735 Gly Asn Glu He Ser lie Asp Phe Lys Thr Lys Val He Asn Val Asp 740 745 750 Gly Lys Gin Tyr Ala Phe Gin Leu Ser Gin Met Glu Arg Glu Leu Phe
[0007] 755 760 765 Gin His Gly Gly lie Ala Ser Ala Phe Gin Lys Phe Gly Asn Arg Leu 770 775 780 Phe Glu Gin Met Thr Arg Pro Lys Asn Leu Gly Ala Lys Ser Leu 785 790 795 800 Ala. Leu Arg Gly Ser Gly Glu Ser Ala. Gly Pro His Ala. Gly i.eu Gin 805 810 815 Trp <210> 4 <211> 2531 <212> DNA <213〉野生型乌头酸酶 <400> 4 atgggtgacg ccagcgaacc atatgcccct tcgctgctgc tggtattgca gcaaacccgg 60 gatgtcgtcc tctccgaggc agacacatac gcattgccga ccctaggaaa tctgcttacc 120 cagctggtgc gagtggtcga tgcacttcga gcgcaggacc acccccggga ggccaatgcc 180 ctcaccgatg tcctcgcgat cagccaacaa cccacggaga tgggaggact cggtctatcc 240 gaagcggaca ctctgacacc cgagcsggaa gctgaaatca ccttcctggt gacggcgtgg 300 ctcgaagctt tgaactcagc cgatcgcgcc agggcaccgc ccgttccgct cgcggtccga 360 ccccccggtc gacgtggcat gacgctgagt gagaagatct ttgcgcttca cgatctlggt 420 cgnnagggat nogtggcgoc tggggagttg atcogggtgg Rc.gtc.gnc.tg ggttattget 480 tccgaggcat catggcaggg catggaacaa acgtatgagc gtctcgggaa acctggaatc 540 tatcggaatg accggttctg gctggcggga gatcatgttg tggoccctcg cgtgaatgag 600 gtccccaaag ttaaggcatt gattgacgct agtgagaggg ccaagcgtgt cttcaaaatg 660 accgactatc agggcat.gaa ctatactatt cttcataccg agttctaccg cgagcgagcc 720 cagccgggta tggtggtcgt gggttccgat tcccacacct gctcgtccgg agcattaggc 780 tgcctggcca ttgggltggg cgcagccgat gtgacccttc cattggtcac cggagagacc 840 tggttcaaag tgcccgaatc ggtcaacatt cgtctcgtcg gtgctcccaa gcccggaatt 900 ggaggcaagg acacgatctt gtacat'cctg eaacaactga agcgaaacac cgtggccgca 960 gaccggattg tcgagttcac cggcccaggt gtgaaacatc tttcatgcga tgctcggttt 1020 gccattagca acargactac agaattcggc ggaattaccg gtgtctttgt gcccgatcaa 1080 atiacagaag aattcatcca gaagcgacgt ctgccccgac acaaaaccgc cagcgtctac 1140 ttcaaacccg atgatgacgc cgagtacgcc gaaacccatg aaatagacct tggcgaggtg 1200 cgatctttcc tggccaaata ccccaaccct gacgacgtcg ttccggtcac tgagcaggaa 1260 ggcatgcacc tggatggatg ctttattggt gcctgcacca ctgccgagga ggatctgatt 1320 ctcggtgctc tcgtgctgga acaagggctc cagaatggct tgaagccagt ttctcacgga 1380 aagnggaagg ttgrtrcggg ctcagtgrcc arnnttcata gactcrgtga gnttgggctt 1440 gcgcagatct acgaggatgc tggatt.tgag atcggcattc caggatgcag ctactgtgtc 1500 ggaatgtcgg ctgatcaggc tggacctgga gaagtctgga tatcttcGca gaaccgcaac 1560 tttgagaacc gtaigggcaa aggctccatc ggaaatcttg catcagctgc cacagttgcg 1620 gcatCKtctt Lc^agatgaa gctgaaagat ccacatgaat acctcgcagc catcgatclc 1680 gaaagatggc ataccctccg cggtgtttct gtgtctgcaa cagactccac acaagaacac 1740 atctcttata tggaacctag tggctccgcg actgcggagg caaagactgt tgactcacca 1800
[0008] gacgtcaagg taacagaggc aaatactcca gfigacfigcag atagctcttc gtccgacctc 1860 atgacaggca aagtgcagcg actgggcgat tttattgata ccgatgcttt ggcccctgcc 1920 cagtttctca tcggcatgtc aaacaatcag atcgcaggcg agcactgcct cgagcacacc 1980 caccccgagt ttcggcagcg cgtgaaagac ggcttcaata tcgtcgtggc aggcaaggca 2040 ttcggatgtg gatcgtcccg cgaacaagcg gtcatggcgc tgttaggctg cggcgtccaa 2100 tgtgtgattg ccaagtcata ctcatttatc ttccagcgca acatgcccag tcttggtctt 2160 "ttgggcatca cactgaccga cgaggagttt tacgacgcgg ctcaagacgg caacgagatt 2220 tGGatagact tcaagaGcaa ggtgatGaaG gtggatggga agcaatacgc tttGcagttg 2280 agtcagatgg agcgggaact ctttcagcat ggcggtattg cgtcggcctt ccagaaattt 2340 ggaaaccggc tgttcgagca gatgaccaga ccgaagaatc tggggggtgc caagtccctt 2400 gcgctgcgtg gaagtgggga gagtgctggt ccgcatgcag gtttgcagtg gtagtagcct 2460 acttagtatc gtgaagatag tcttcagtaa aacaagacgt agctttacta ttatgatatt 2520 cgttatgcat g 2531 <210> 5 <211〉 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 5 gatcgagctc atggggtgac gccagcga 28 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 6 gatcgcggcc gccatgcata acgaatatca 30
【权利要求】
1. 乌头酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述突变体的基因。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
4. 含有权利要求2或3所述基因的载体。
5. 含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体的工程菌。
6. 权利要求2或3所述基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的应用。
7. 用于PCR特异性扩增权利要求2或3所述基因的引物对，其特征在于，所述引物对 为： 正向引物：5 ^ -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3 ' 反向引物：5' -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3'。
【文档编号】C12N1/19GK104087570SQ201410245359
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】李荣杰, 尚海涛, 杨为华, 邓远德, 徐斌, 杨金环 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司
最新回复(0)