一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法
一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法，具体涉及一种新的鉴定凝结芽孢杆菌的分子生物学方法。该方法通过对凝结芽孢杆菌基因特异的DNA序列设计特异性引物：HFQ1/HFQ2，用该引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增检测，可以将凝结芽孢杆菌菌株鉴定到种的水平。本发明将为凝结芽孢杆菌鉴定提供一种更加准确、更易于操作的实用方法，有利于凝结芽孢杆菌菌株的分类及研究工作。
【专利说明】一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物额鉴定方法，具体涉及一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法，属于分子生物学的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)呈杆状,两端钝圆,革兰氏阳性菌,过氧化氢酶阳性，芽胞端生，无鞭毛。最适生长温度为45~50°C,最适pH值为6.6~7.0。其能分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的杆菌类乳酸菌。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是近年来益生菌领域的后起之秀,其除具有乳酸菌和双歧杆菌等保健功效外，还具有耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性，且具有较强的抑制肠道致病菌能力。
[0003]在国外已广泛应用于保健、医疗、食品和畜牧等领域，但在我国关于凝结芽孢杆菌的研究和开发才刚刚起步。凝结芽孢杆菌是造成罐头食品平盖酸败的一种重要微生物。
[0004]综上所述，不论是作为益生菌来利用，还是作为酸败的罪魁祸首，都需要一种快速的鉴定方法，而传统的生化鉴定操作繁琐、检测时间长，已经不能满足各个领域的需求，因而，对凝结芽孢杆菌快速检测的研究是很有必要的。PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点，是当前细菌鉴定中一种快速有效的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，提供一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明提供一种检测速度快、成本低的快速检测凝结芽孢杆菌到种的PCR方法。
[0006]本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现:
[0007]作为本发明的第一方面，一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物是一对特异性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物HFQl序列与SEQ IDN0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
[0008]作为本发明的第二方面，一种特异性引物鉴定凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0009](I)提取凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),准备对照菌株；
[0010](2)以步骤⑴中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增；和
[0011] (3)用I %琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。
[0012]步骤(2)中，正向引物HFQl 序列与 SEQ ID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ；反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
[0013]步骤(2)中，PCR扩增体系为:20μ1 由 2 μ 110 XBufferwith MgCl2、I μ ldNTP2.5mmol/L、I μ I HFQ11 Ommo I/L、I μ I HFQ2I Ommo I/L、0.I μ I TaqDNAPolymerase5U/ μ 1、I μ I DNA 模板，13.9 μ I ddH20 ；
[0014]PCR 扩增条件为:预变性 94°C 5min，变性 94°C 35s，退火 50°C 40s，延伸 72°C 40s，30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
[0015]作为本发明的第三方面，一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物的用途，其特征在于:用于凝结芽孢杆菌的分子检测。
[0016]本发明的有益效果:
[0017]1、较传统鉴定凝结芽孢杆菌的16sDNA扩增、测序、比对、生理生化试验等繁杂步骤来说，本发明的方法可以直接鉴定出是否是凝结芽孢杆菌，极大程度上节省了实验资源，可用于大规模样品的鉴定凝结芽孢杆菌。
[0018]2、本发明的引物是根据凝结芽孢杆菌特异保守基因而设计的，应用本发明的引物HFQ1/HFQ2可从各类样品DNA中直接扩增出长度大约为290bp的凝结芽孢杆菌目的片段。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为实施例1中HFQ1/HFQ2引物对种细菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。
[0020]M 泳道为标准 DNA markerfOOO。
[0021]I号泳道为凝结芽孢杆菌的扩增结果。
[0022]2号泳道为阴性对 照。
[0023]3-10号泳道分别为含有枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、大肠杆菌标准株(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA0
[0024]图2为实施例2中HFQ1/HFQ2引物对不同样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。
[0025]M 泳道为标准 DNA marker2000。
[0026]I号泳道为凝结芽孢杆菌的扩增结果。
[0027]2号泳道为阴性对照。
[0028]3号泳道为土壤A样品DNA。
[0029]4号泳道为土壤B样品DNA。
[0030]5-号泳道为番爺罐头A样品DNA。
[0031]6号泳道为番爺罐头B样品DNA。
【具体实施方式】
[0032]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0033]实施例1
[0034]实验步骤
[0035]1、提取凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、大肠杆菌标准株(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA,上述菌种来源见表 I。
[0036]2、以步骤I中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增。
[0037]PCR 扩增体系为:20μ I 由 2μ 110 X Buffer (with MgCl2), I μ I dNTP (2.5mmol/L)、I μ I HFQl(IOmmoI/L)、I μ I HFQ2(IOmmoI/L)、0.I μ I TaqDNA Polymerase(5U/μ I)、I μ IDNA 模板，13.9 μ I ddH20。
[0038]PCR 扩增条件为:预变性 94°C 5min,变性 94°C 35s，退火 50°C 40s,延伸 72°C 40s，30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
[0039]3、用I %琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。
[0040]实验结果 [0041]检测结果如图1所示，从图1中可以看出本实施方式用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物HFQ1/HFQ2能够准确的扩增出凝结芽孢杆菌的靶标序列片段，而未能从其他属细菌DNA和空白对照中扩增出核酸片段。将I号泳道对应的扩增片段进行测序，经Blast比对分析，确定其为凝结芽孢杆菌特异基因序列。
[0042]表1菌种来源表
[0043]
【权利要求】
1.一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物是一对特异性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物 HFQl 序列与 SEQ ID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
2.一种如权利要求1所述的特异性引物鉴定凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans),准备对照菌株； (2)以步骤⑴中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增；和 (3)用I%琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。
3.根据权利要求2述的方法，其特征在于:步骤(2)中，正向引物HFQl序列与SEQID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
4.根据权利要求2述的方法，其特征在于: 步骤(2)中，PCR扩增体系为:20μ I 由 2μ 110XBufferwith MgCl2,1 μ ldNTP2.5mmol/LU μ I HFQ110mmol/L、l μ I HFQ210mmol/L、0.1 μ I Taq DNAPolymerase5U/μ 1、1 μ I DNA 模板，13.9μ I ddH20 ；
PCR扩增条件为:预变性940C 5min,变性94°C 35s，退火50°C 40s,延伸72°C 40s, 30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
5.一种如权利要求1所述的鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物的用途，其特征在于:用于凝结芽孢杆菌的分子检测。
【文档编号】C12R1/07GK104004846SQ201410245441
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】符雷, 郗洪生, 施腾鑫, 陆亚怡 申请人:江苏恒丰强生物技术有限公司
【专利摘要】本发明涉及一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法，具体涉及一种新的鉴定凝结芽孢杆菌的分子生物学方法。该方法通过对凝结芽孢杆菌基因特异的DNA序列设计特异性引物：HFQ1/HFQ2，用该引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增检测，可以将凝结芽孢杆菌菌株鉴定到种的水平。本发明将为凝结芽孢杆菌鉴定提供一种更加准确、更易于操作的实用方法，有利于凝结芽孢杆菌菌株的分类及研究工作。
【专利说明】一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物额鉴定方法，具体涉及一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法，属于分子生物学的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)呈杆状,两端钝圆,革兰氏阳性菌,过氧化氢酶阳性，芽胞端生，无鞭毛。最适生长温度为45~50°C,最适pH值为6.6~7.0。其能分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的杆菌类乳酸菌。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是近年来益生菌领域的后起之秀,其除具有乳酸菌和双歧杆菌等保健功效外，还具有耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性，且具有较强的抑制肠道致病菌能力。
[0003]在国外已广泛应用于保健、医疗、食品和畜牧等领域，但在我国关于凝结芽孢杆菌的研究和开发才刚刚起步。凝结芽孢杆菌是造成罐头食品平盖酸败的一种重要微生物。
[0004]综上所述，不论是作为益生菌来利用，还是作为酸败的罪魁祸首，都需要一种快速的鉴定方法，而传统的生化鉴定操作繁琐、检测时间长，已经不能满足各个领域的需求，因而，对凝结芽孢杆菌快速检测的研究是很有必要的。PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点，是当前细菌鉴定中一种快速有效的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，提供一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明提供一种检测速度快、成本低的快速检测凝结芽孢杆菌到种的PCR方法。
[0006]本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现:
[0007]作为本发明的第一方面，一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物是一对特异性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物HFQl序列与SEQ IDN0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
[0008]作为本发明的第二方面，一种特异性引物鉴定凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0009](I)提取凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),准备对照菌株；
[0010](2)以步骤⑴中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增；和
[0011] (3)用I %琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。
[0012]步骤(2)中，正向引物HFQl 序列与 SEQ ID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ；反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
[0013]步骤(2)中，PCR扩增体系为:20μ1 由 2 μ 110 XBufferwith MgCl2、I μ ldNTP2.5mmol/L、I μ I HFQ11 Ommo I/L、I μ I HFQ2I Ommo I/L、0.I μ I TaqDNAPolymerase5U/ μ 1、I μ I DNA 模板，13.9 μ I ddH20 ；
[0014]PCR 扩增条件为:预变性 94°C 5min，变性 94°C 35s，退火 50°C 40s，延伸 72°C 40s，30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
[0015]作为本发明的第三方面，一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物的用途，其特征在于:用于凝结芽孢杆菌的分子检测。
[0016]本发明的有益效果:
[0017]1、较传统鉴定凝结芽孢杆菌的16sDNA扩增、测序、比对、生理生化试验等繁杂步骤来说，本发明的方法可以直接鉴定出是否是凝结芽孢杆菌，极大程度上节省了实验资源，可用于大规模样品的鉴定凝结芽孢杆菌。
[0018]2、本发明的引物是根据凝结芽孢杆菌特异保守基因而设计的，应用本发明的引物HFQ1/HFQ2可从各类样品DNA中直接扩增出长度大约为290bp的凝结芽孢杆菌目的片段。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为实施例1中HFQ1/HFQ2引物对种细菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。
[0020]M 泳道为标准 DNA markerfOOO。
[0021]I号泳道为凝结芽孢杆菌的扩增结果。
[0022]2号泳道为阴性对 照。
[0023]3-10号泳道分别为含有枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、大肠杆菌标准株(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA0
[0024]图2为实施例2中HFQ1/HFQ2引物对不同样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。
[0025]M 泳道为标准 DNA marker2000。
[0026]I号泳道为凝结芽孢杆菌的扩增结果。
[0027]2号泳道为阴性对照。
[0028]3号泳道为土壤A样品DNA。
[0029]4号泳道为土壤B样品DNA。
[0030]5-号泳道为番爺罐头A样品DNA。
[0031]6号泳道为番爺罐头B样品DNA。
【具体实施方式】
[0032]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0033]实施例1
[0034]实验步骤
[0035]1、提取凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、大肠杆菌标准株(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA,上述菌种来源见表 I。
[0036]2、以步骤I中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增。
[0037]PCR 扩增体系为:20μ I 由 2μ 110 X Buffer (with MgCl2), I μ I dNTP (2.5mmol/L)、I μ I HFQl(IOmmoI/L)、I μ I HFQ2(IOmmoI/L)、0.I μ I TaqDNA Polymerase(5U/μ I)、I μ IDNA 模板，13.9 μ I ddH20。
[0038]PCR 扩增条件为:预变性 94°C 5min,变性 94°C 35s，退火 50°C 40s,延伸 72°C 40s，30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
[0039]3、用I %琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。
[0040]实验结果 [0041]检测结果如图1所示，从图1中可以看出本实施方式用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物HFQ1/HFQ2能够准确的扩增出凝结芽孢杆菌的靶标序列片段，而未能从其他属细菌DNA和空白对照中扩增出核酸片段。将I号泳道对应的扩增片段进行测序，经Blast比对分析，确定其为凝结芽孢杆菌特异基因序列。
[0042]表1菌种来源表
[0043]
【权利要求】
1.一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物是一对特异性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物 HFQl 序列与 SEQ ID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
2.一种如权利要求1所述的特异性引物鉴定凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans),准备对照菌株； (2)以步骤⑴中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增；和 (3)用I%琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。
3.根据权利要求2述的方法，其特征在于:步骤(2)中，正向引物HFQl序列与SEQID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。
4.根据权利要求2述的方法，其特征在于: 步骤(2)中，PCR扩增体系为:20μ I 由 2μ 110XBufferwith MgCl2,1 μ ldNTP2.5mmol/LU μ I HFQ110mmol/L、l μ I HFQ210mmol/L、0.1 μ I Taq DNAPolymerase5U/μ 1、1 μ I DNA 模板，13.9μ I ddH20 ；
PCR扩增条件为:预变性940C 5min,变性94°C 35s，退火50°C 40s,延伸72°C 40s, 30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
5.一种如权利要求1所述的鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物的用途，其特征在于:用于凝结芽孢杆菌的分子检测。
【文档编号】C12R1/07GK104004846SQ201410245441
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】符雷, 郗洪生, 施腾鑫, 陆亚怡 申请人:江苏恒丰强生物技术有限公司
最新回复(0)