检测携带绵羊黄脂遗传病基因的试剂盒的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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检测携带绵羊黄脂遗传病基因的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开用于检测携带绵羊黄脂遗传病基因的试剂盒。本发明的检测携带绵羊黄脂遗传病基因的试剂盒内包括有:序列表中引物核苷酸序列SEQID№1和SEQID№2,探针核苷酸序列SEQID№3,BCO2基因CC基因型核酸序列SEQID№4和BCO2基因TT基因型核酸序列SEQID№5。本发明与已有检测BCO2基因突变位点方法相比,具有分型鉴定方法准确、快速、简便、成本低、实用,具有很好的实用价值和市场价值。
【专利说明】检测携带绵羊黄脂遗传病基因的试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种兽医用遗传疾病检测试剂盒,特别是一种可用于检测携带绵羊黄脂遗传病基因的试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]消费者单纯凭借视觉就可对肉类外在的脂肪颜色品质做出直观的评价,因此脂肪颜色是肉质的主要感官指标,也是人们选择肉品首要和主要的依据。美国、加拿大、澳大利亚和日本等国已将牛肉的脂肪颜色作为其胴体分级系统(Carcass grading systems)中的重要组成部分。澳大利亚肉类品质规格管理局(AUS-MEAT)将黄脂的黄色程度分为十个等级,O为“白色”,9为“特别黄”;规定黄脂的程度由经过训练的评价师比对AUS-MEAT标准颜色芯片(Standard colour chips)判定。爱尔兰等一些欧洲国家却将黄脂的黄色程度分为五个等级,I为“非常白”,5为“特别黄”。家畜屠宰后有些胴体的脂肪组织呈淡黄色或黄色的现象,称为黄脂。类似黄脂的现象在牛、马、猪、绵羊、狐狸、水貂、猫、鼬鼠、鸡和兔等动物中都有报道[梅步俊,李亚珍,吉日嘎拉,汪长寿,马惠茹.反刍动物黄脂研究进展.草食家畜,2013,(04): 1-5.]。加拿大1995-1996年牛肉品质调查中,4%胴体存在黄脂现象。墨西哥的研究报道牛肉的黄脂发生率为12.9%[ M6ndez RD, Meza CO, BerruecosJM, Garces P, Delgado EJ, Rubio MS.A survey of beef carcass quality and quantityattributes in Mexic0.Anim Sci, 2009, 87(11): 3782-3790.]。刘晓牧等在山东省部分屠宰企业的调查,发现高档牛肉黄脂检出率也为4%左右,每公斤高档牛肉中含有黄色脂肪的肉价格比白色脂肪低40元左右[刘晓牧,吴乃科,宋恩亮,等.牛肉黄脂研究进展.中国牛业科学,2006,32(2):31-33.]。在国内绵羊中,卢振鸿、吴心华、孙淑萍、韩合国、张建华等在宁夏灵武市狼皮梁子乡、白土岗子乡、盐池县王乐井乡、内蒙古前旗、辽宁沈阳、山西大同等地出现羊育肥期结束屠宰时发现脂肪变成黄色的现象,不能销售,发病率达10%[刘宝山,姚龙泉,魏振波,吴波.育肥羊谨防黄脂病.畜牧与兽医,2011,(02): 107-108.卢振鸿.育肥羊黄脂症的病因分析及防治措施.2010中国羊业进展,2010:369-370.孙淑萍,陶占军,卢振鸿,黄丽红.育肥羊黄脂症的病因分析及防治措施.当代畜牧,2010,(03):24-25.吴心华,赵洪喜,陈绍淑,李爱华,谢琴,扈登强,余四九.育肥羊黄脂症的诊治.黑龙江畜牧兽医,2010,(02):94.韩合国.育肥羊黄脂症的调查分析与防治.中国动物检疫,2013,(10):49-50.张建华.育肥绵羊黄脂病的病例报告及预防措施.当代畜牧,2012,(07):32-33.]。
[0003]绵羊黄脂病的研究始于20世纪40年代,1934年Castle首次报道了冰岛绵羊群体中的黄脂现象[Castle, ff.E.Yellow fat in sheep.Journal of Heredity ,1934,25:246-247.]。通过对绵羊黄脂病的研究首次发现黄脂中至少包含三种黄色素:黄体素,叶黄素5、6环氧化物和叶黄呋喃素,绵羊黄脂遗传病主要是由于类胡萝卜素在脂肪组织中过量的沉积所造成。[A.H.Kirton, Brenda Crane, D.J.Paterson N.T.Clare.Yellow fat in lambs caused by carotenoid pigmentation.New Zealand Journal ofAgricultural Research, 1975,18(3):267-272.]。很多因素都会影响脂肪颜色,包括饲料、营养、环境、饲养管理、品种、性别、年龄,很多研究表明绵羊脂肪的黄色程度也是由遗传因素控制的。通过分析33只公羊的半同胞后裔数据,估计出的绵羊黄脂肉的遗传力为0.18[Baker, R.L., Steine, T., Vabeno, A.ff., Breines, D.: The inheritance and incidenceof yellow fat in Norwegian sheep Acta Agriculturae Scandinavica 1985, 35:389-397.Gedde-Dahl Tff.Reduction of the yellow fat incidence by different breeding plansfor sheep.Nord Vet Med.1972, 24(12):620-30.F.Hill.Xanthophyll pigmentation insheep fat.Nature.1962,194:865-6.]。进一步表明:绵羊黄脂遗传病其特征是胭体脂肪呈黄色,由一对隐性纯合子所控制[Baker, R.L., Steine, T., Vabeno, A.ff.Breines, D.The inheritence and incidence of yellow fat in Norweigian sheep.Acta AgriculturaeScandinavica.1985, (35):389-397.马卫东.绵羊的先天性缺陷.国外畜牧学(草食家畜),1991,06:31-33.]。最近研究表明,在绵羊脂肪组织中,由β —胡萝卜素氧化合成为维生素A的关键非对称裂解酶-BC02酶基因的突变位点(c.196C>T)引起蛋白质翻译的提前终止,使得BC02酶由原来的575个氨基酸变为65个氨基酸,从而引起BC02酶功能的丧失,使得β —胡萝卜素的在脂肪组织的沉积引进黄脂遗传病。患黄脂遗传病的羊只均携带BC02 c.196突变纯合基因型ΤΤ,部分携带BC02 c.196野生/突变杂合基因型CT,健康羊只均携带 BC02 c.196 野生纯合基因型 CC [Vage DI, Boman IA.A nonsense mutation in thebeta-carotene oxygenase 2 (BC02) gene is tightly associated with accumulation ofcarotenoids in adipose tissue in sheep (Ovisaries).BMC Genet.2010,11:10-15.]。因此我们可应用遗传检测手段对BC02酶基因的突变(c.196C>T)进行基因分型,剔除携带突变纯合基因型TT和突变杂合基因型CT,从而降低绵羊黄脂遗传病的发病率。
[0004]现有技术中对BC02酶基因的突变位点(c.196C>T)进行基因分型主要技术为PCR-RFLP 和 Mass ARRAY [Vage DI, Boman IA.A nonsense mutation in the beta-caroteneoxygenase 2 (BC02) gene is tightly associated with accumulation of carotenoids inadipose tissue in sheep (Ovis aries).BMC Genet.2010,11:10-15.],现有技术中 BC02 酶基因突变位点(c.196C>T)分型鉴定方法在PCR扩增后不仅需要进行一轮延伸反应或进行限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染等技术难度大、重复性差的技术环节,而且还需要电泳仪、凝胶成像系统、时间飞行质谱生物芯片系统等大中型设备的依赖,因此每一基因SNP检测成本很高,因此并不适合于在我国畜牧生产中应用,难以广泛的推广。

【发明内容】

[0005]本发明提供一种中可克服现有技术不足,可用于检测绵羊是否携带黄脂遗传病基因的试剂盒及其使用方法。
[0006]本发明的检测携带绵羊黄脂遗传病基因的试剂盒内包括有:序列表中引物核苷酸序列SEQ ID Na I和SEQID Na 2,探针核苷酸序列SEQ ID Na 3 , BC02基因CC基因型核酸序列SEQ ID Na 4和BC02基因TT基因型核酸序列SEQ ID Ns 5。
[0007]为方便使用,本发明的试剂盒内还有分别放置的PCR缓冲液、d NTP混合液、TaqDNA聚合酶,以及IXLCGreen PLUS+饱和荧光染料。[0008]本发明试剂盒的使用方法是在待检羊DNA中加入所述试剂盒中的引物核苷酸序列和探针核苷酸序列,以及PCR缓冲液、d NTP混合液、Taq DNA聚合酶、LCGreen PLUS+饱和荧光染料,再进行PCR扩增,PCR扩增产物在高分辨率熔解曲线分析仪中进行熔解曲线分析,得到熔解曲线中的T、C峰分布情况,根据熔解曲线中的T、C峰可预测待检羊只是否携带绵羊黄脂遗传病基因情况。
[0009]本发明试剂盒的最佳使用方法是:
在进行PCR扩增时,其扩增条件为-M0C 5分钟,94°C 45秒,60.(TC 30秒,720C 20秒,72 0C 10分钟,共进行50个循环;反应完成后,将PCR产物再进行2个95 °C 2分钟,25°C 30秒的变性和复性的循环;
所得PCR产物在高分辨率熔解曲线分析仪中进行熔解曲线分析时将PCR产物以0.30C/秒的速度从40°C升温到90°C过程中,获得样品的熔解曲线,依据熔解曲线获得待测羊只BC02基因突变位点(c.196C>T)的基因型。
[0010]本发明是利用HRM (High Resolution Melt)技术进行检测。HRM中文译为“高分辨率熔解”是近几年来在国外兴起的最新的SNP及突变研究工具。HRM分析技术是2002年由犹他大学和爱德华科技公司合作开发,最初应用于单核苷酸多态(Single NucleotidePolymorphism, SNP)检测分析的一项新技术。它是在PCR结束后,根据不同碱基序列构成核苷酸熔解温度不同这一物理性质,在同一容器中直接进行高分辨率熔解,利用饱和染料监控核苷酸的熔解过程,得到特征性熔解曲线,再根据熔解曲线的形态变化来判断核苷酸性质的差异。目前,HRM的应用领域已经扩展到突变扫描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等诸多方面,近年来已成为生命科学研究中的热点技术。
[0011]本发明即是一种利用高分辨率熔解曲线分析仪对BC02基因突变位点(c.196C>T)进行分型鉴定的快速、简便、准确的新手段。本发明改进了现有技术中BC02基因突变位点(c.196C>T)分型鉴定中的缺点。在本发明的BC02基因突变位点(c.196C>T)分型鉴定过程中,实验样本基因组DNA应用本发明中试剂盒中的特异引物和探针进行扩增后,可直接应用高分辨率熔解曲线分析仪进行基因分型,而无需现有技术中BC02基因突变位点(c.196C>T)分型鉴定方法在PCR扩增后还需要进行一轮延伸反应或限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染等技术难度大、重复性差的技术环节,从而摆脱了对电泳仪、凝胶成像系统、时间飞行质谱生物芯片系统等大中型设备的依赖,使BC02基因突变位点(c.196C>T)分型简便易操作,并且可在一个小时内完成1000个样品的基因分型,因此应用本发明进行BC02基因突变位点(c.196C>T)分型鉴定降低了每一基因鉴定的成本,提高了检测速度。总之,本发明较上述已有BC02基因突变位点(c.196C>T)分型鉴定方法准确、快速、简便、成本低、实用,具有很好的实用价值和市场价值。
【专利附图】

【附图说明】
[0012]图1分别为实测的.pMD19-T BC02 (CC)、pMD19_T BC02 (TT)两个载体基因的部分序列。
[0013] 图2为待检样品PCR扩增产物的熔解曲线,其中:样品I的BC02基因突变位点(c.196C>T)的基因型为野生纯合基因型CC ;样品2的BC02基因突变位点(c.196C>T)的基因型为突变纯合基因型TT ;样品3的BC02基因突变位点(c.196C>T)的基因型为野生/突变杂合基因型CT。
【具体实施方式】
[0014]以下为本发明的【具体实施方式】:
BC02基因克隆标准品的制备及BC02基因突变位点(c.196C>T)基因分型检测(I).以下表1所列的本发明所使用的引物基因序列和探针序列均由上海生工生物工程科技发展有限公司合成。
【权利要求】
1.检测携带绵羊黄脂遗传病基因的试剂盒,其特征是试剂盒内包括有:序列表中引物核苷酸序列SEQ ID Na I和SEQID Na 2,探针核苷酸序列SEQ ID Na 3 , BC02基因CC基因型核酸序列SEQ ID Na 4和BC02基因TT基因型核酸序列SEQ ID Ns 5。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是试剂盒内还有分别放置的PCR缓冲液、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶,以 及IXLCGreen PLUS+饱和荧光染料。
【文档编号】C12Q1/68GK103993094SQ201410245526
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】岳耀敬, 郭婷婷, 秦哲, 杨博辉, 刘建斌, 郭健, 牛春娥, 孙晓萍, 冯瑞林 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

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