定点引入不配对区域的高效保真pcr方法

定点引入不配对区域的高效保真pcr方法
【专利摘要】本发明提供一种定点引入不配对区域的高效保真PCR方法，定点引入不配对区域的高效保真的2步PCR方法，分别使用不同性质的聚合酶,在各自最优化的缓冲体系中进行PCR扩增反应：先使用保真性低而具备高扩增能力的tag酶进行PCR反应，解决引物与模板不配对的问题，得到具有与原始模板不配对的区域（含酶切位点的引物区域或点突变区域）的产物；继而专用高保真Pfu酶以前一步产物为模板，完全匹配地进行扩增，很好解决了这类具不配对区域的PCR反应中的扩增效率与高保真的问题。
【专利说明】定点引入不配对区域的高效保真PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及PCR扩增方法，特别是涉及在指定位点引入与模板不配对区域的PCR方法。
【背景技术】
[0002]在定点引入不配对区域的PCR过程中，如引物5 ’端增加酶切位点的PCR、定点突变是分子生物学中常用技术，对PCR过程有极高的要求:原有配对区要求高保真、而定点不配对区则要求能做到定向突变、产物要求高效扩增。但是在实际操作过程中实验操作者很难做到保真性、特异性突变和效率兼顾；除了引物设计、退火温度等因素外，PCR过程中所使用的聚合酶及Mg2+浓度也是与特异性、保真性、扩增效率、突变兼容性密切相关的因素。
[0003]高扩增效率的低保真PCR聚合酶(热启动酶,如Tag酶,Roche的fast starTag,等等)一扩增效率高但是突变率高；且突变位点随机，得到和目标产物完全一致的序列几率低，增加测序次数、成本、时间。
[0004]高保真酶(具有3’ 一 5’外切酶活性的酶,如promega公司的Pfu等)一降低碱基错配率，当发生错配时，可将错配碱基切除，保真性高但扩增效率低，在引物与模板有一定的不配对性的情况下而扩增能力更低(表1)。
[0005]
【权利要求】
1.一种定点引入不配对区域的高效保真PCR方法，其特征在于，通过以下步骤实现: (1)根据目标基因⑶NA序列及所需引入不配对碱基设计引物，其规则为:5，端一3，端:不配对区+18个碱基以上的⑶NA上游配对区； (2)选取保真性不高但扩增效率高的低保真PCR聚合酶，酶用量按理论要求所需最低用量，实验体系按其使用说明建立缓冲体系，按配对碱基数计算PCR退火温度，进行3-5个循环；扩增得到具有与原始模板不配对的区域的第一阶段产物； (3)取第一步产物为模板，取高保真PCR聚合酶(如Pfu酶，错误率7*10_7，对目标分子扩增一百万倍，理论所需循环数为30个)，按其使用说明建立实验缓冲体系，并根据配对碱基数的增加可相应提高退火温度，按扩增效率选择循环数，以高保真酶扩增得到第二阶段产物。
2.根据权利要求1所述的一种定点引入不配对区域的高效保真PCR方法，其特征在于，步骤(1)所述不配对的区域为特定位点的定向碱基突变，包括含酶切位点的引物区域或点突变区域。
3.根据权利要求1所述的一种定点引入不配对区域的高效保真PCR方法，其特征在于，步骤(3)所取产物做模板的体积小于等于第二步骤反应体系的1/10。
【文档编号】C12N15/10GK104031907SQ201410245609
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】王贝贝 申请人:浙江大学