一种pcr试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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一种pcr试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法
【专利摘要】本发明涉及一种PCR试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法,通过具体分析阳性模板核酸序列,在特定条件下将用做阳性对照的模板缩短50-100bp左右的碱基,完成相关PCR反应后,通过琼脂糖凝胶电泳即可观察和区分出待检样品的阳性条带是真阳性还是因操作失误造成待检样品中污染阳性对照而产生的假阳性。本发明能不改变反应过程的情况下直观反映各种样品检测的真实信息,不会出现假阳性。
【专利说明】—种PCR试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测领域,尤其涉及一种PCR试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法。
【背景技术】
[0002]现有技术中的PCR类检测试剂盒所用阳性对照,一般是将目的片段突变某一个或数个位点后插入某一质粒中,将该质粒线性化后作为阳性对照。由于阳性对照目的片段进行了突变,因此通过测序可确定检测为阳性的样品是真阳性,还是因反应体系污染阳性对照模板而导致的假阳性。但是测序工作一般需要交由测序公司进行,从送交样品算起大概需要一周左右的时间,大大浪费了时间。此外,对于某些有保密要求的样品来说,送交公司测序增加了泄密的可能性。
[0003]并且,PCR试剂盒中通常以含有扩增片段目的基因的质粒作为阳性对照的模板,PCR灵敏度高,操作过程中容易造成阳性质粒污染待检测的样品,从而造成待检样品假阳性。

【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供一种PCR试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法,用以克服上述技术缺陷。 [0005]为实现上述目的,本发明提供一种PCR试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法,比较分析具体的阳性模板核酸序列,将用做阳性对照的模板缩短50-100bp左右的碱基,缩短后的阳性对照模板与原阳性对照模板相比,必须符合以下条件:1)两者具有相同或相近的GC百分比;2)未增加或减少发卡结构;3)基本未增加或减少二聚体、错配的S G值;4)扩增片段超过450bp,阳性对照模板缩短lOObp。低于450bp,阳性对照模板缩短50bp ;5)尽量不在靠近上下游引物的地方删减碱基。以该模板为阳性对照,完成相关PCR反应后,通过琼脂糖凝胶电泳即可观察和区分出待检样品的阳性条带是真阳性还是因操作失误造成待检样品中污染阳性对照而产生的假阳性,同时不影响反应过程。
[0006]进一步,以新城疫检测技术为例,该具体过程为:
[0007]步骤a,阳性模板制备;根据新城疫检测技术国家标准(GB/T 16550-2008)提供引物扩增的片段序列,人工合成或利用其他分子生物学方法在片段中间删减lOObp,使片段长度为435bp,连接T载体后作为阳性模板;
[0008]步骤b,检测;
[0009]按照新城疫检测技术国家标准(GB/T 16550-2008)提供条件对阳性和阴性样品检测。
[0010]进一步,上述步骤a中,人工合成的序列为:
[0011]序列2:
[0012]ATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCCCTGATGCTGACTGTCCGACTTGTGCTGGCACTGAGTTGCGTCTGCCCGACCAGCTCCCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGGAGACAAGGC
AGTCAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTCCCAAATATCAAGAGTCTGTGACCAC
ATCTGGAGGAGGGAAACAGGGACGTCTTATAGGCGCCATTATCGGTGGTGCGGCTCTCGGGGTTGCAACCGCTGCAC
AGATAACAGCAGCCTCGGCTCTAATACAAGCCAATCAAAATGCTGCCAACATTCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCT
GCAACCAATGAGGCTGTGCACGAGGTCACTGACGGATTATCACAACTAGCAGTGGCAG。
[0013]与现有技术相比较本发明的有益效果在于:本发明通过分析具体核酸序列,在符合下述条件的情况下将用做对照的模板减少50-100bp左右的碱基:1)两者具有相同或相近的GC百分比;2)未增加或减少发卡结构;3)基本未增加或减少二聚体、错配的δ G值;
4)扩增片段超过450bp,阳性对照模板缩短lOObp。低于450bp,阳性对照模板缩短50bp;
5)尽量不在靠近上下游引物的地方删减碱基。不影响扩增效果的同时,通过PCR反应结束后的琼脂糖凝胶电泳结果即可判断待检样品是真阳性还是假阳性,能有效防止假阳性的出现;并且本发明能直观反映 各种样品检测的真实信息,不会出现假阳性。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1为本发明I阳性和阴性样品没有被阳性对照污染;
[0015]图2为本发明2阳性和阴性样品被阳性对照污染;
[0016]图3为本发明3阳性样品被阳性对照污染;
[0017]图4为本发明4阴性样品被阳性对照污染。
【具体实施方式】
[0018]以下结合附图,对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0019]本发明通过比较分析具体核酸序列,将用做阳性对照的模板在符合下述条件的情况下缩短50-100bp左右的碱基:1)两者具有相同或相近的GC百分比;2)未增加或减少发卡结构;3)基本未增加或减少二聚体、错配的SG值;4)扩增片段超过450bp,阳性对照模板缩短lOObp。低于450bp,阳性对照模板缩短50bp ;5)尽量不在靠近上下游引物的地方删减碱基。完成相关PCR反应后,通过琼脂糖凝胶电泳即可观察和区分出待检样品的阳性条带是真阳性还是因操作失误造成待检样品中污染阳性对照而产生的假阳性。
[0020]以新城疫检测技术为例,该具体过程为:
[0021]步骤a,阳性模板制备;
[0022]根据新城疫检测技术国家标准(GB/T 16550-2008)提供引物扩增的片段序列(序列长度535bp)(序列见“序列I”),人工合成或利用其他分子生物学方法在片段中间删减lOObp,使片段长度为435bp(序列见“序列2”),连接T载体后作为阳性模板。
[0023]步骤b,检测;
[0024]按照新城疫检测技术国家标准(GB/T 16550-2008)提供条件对阳性和阴性样品检测,阳性对照为按照本发明提供的方法制备。
[0025]检测结果出现如下4种情况。
[0026]说明:下面4个模式图中,泳道I为核酸分子量标志;泳道2为阳性对照;泳道3为阳性待检样品;泳道4为阴性待检样品。
[0027]图1中,I阳性和阴性样品没有被阳性对照污染;[0028]图2中,2阳性和阴性样品被阳性对照污染;
[0029]图3中,3阳性样品被阳性对照污染;
[0030]图4中,4阴性样品被阳性对照污染。
[0031]上述4种情况涵盖检测过程中所有可能出现的情况,由于阳性对照条带与阳性样品条带大小不同,所以无论出现何种情况,本发明均能直观反映样品检测的真实信息,不会出现假阳性。
[0032]本发明不限于以上所述的实施例,而是可在随附权利要求的范围内进行修改,只需满足本发明的 技术构思和主要精神。
【权利要求】
1.一种PCR试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法,其特征在于,通过分析具体核酸序列,在符合下述条件下将用做阳性对照的模板缩短50-100bp左右的碱基:1)两者具有相同或相近的GC百分比;2)未增加或减少发卡结构;3)未增加或减少二聚体、错配的S G值;4)扩增片段超过450bp,阳性对照模板缩短10bp ;低于450bp,阳性对照模板缩短50bp ;5)不在靠近上下游引物的地方删减碱基; 完成相关PCR反应后,通过琼脂糖凝胶电泳即可观察和区分出待检样品的阳性条带是真阳性还是因操作失误造成待检样品中污染阳性对照而产生的假阳性。
2.根据权利要求1所述的PCR试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法,其特征在于,以新城疫病毒检测方法为例,该具体过程为: 步骤a,阳性模板制备;根据新城疫检测技术国家标准(GB/T 16550-2008)提供引物扩增的片段序列,人工合成或利用其他分子生物学方法在片段中间删减lOObp,使片段长度为435bp,连接T载体后作为阳性模板; 步骤b,检测; 按照新城疫检测技术国家标准(GB/T 16550-2008)提供条件对阳性和阴性样品检测。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法,其特征在于,以新城疫检测为 例,上述步骤a中,人工合成的序列为: 序列2:
ATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCCCTGATGCTGACTGTCCGACTTGTGCTGGCACTGAGTTGCGTCTGCCCGACCAGCTCCCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGGAGACAAGGCAGTCAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTCCCAAATATCAAGAGTCTGTGACCACATCTGGAGGAGGGAAACAGGGACGTCTTATAGGCGCCATTATCGGTGGTGCGGCTCTCGGGGTTGCAACCGCTGCACAGATAACAGCAGCCTCGGCTCTAATACAAGCCAATCAAAATGCTGCCAACATTCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCTGCAACCAATGAGGCTGTGCACGAGGTCACTGACGGATTATCACAACTAGCAGTGGCAGo
【文档编号】C12Q1/68GK104031998SQ201410246787
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】张永强, 刘朔, 赵永刚, 吴晓东, 李金明, 王志亮 申请人:中国动物卫生与流行病学中心

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