一种筛选高产苏氨酸菌株的方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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一种筛选高产苏氨酸菌株的方法
【专利摘要】本发明涉及一种苏氨酸响应器的构建方法,及利用该响应器高通量筛选高产苏氨酸菌株的方法。建立苏氨酸响应器:苏氨酸能够与大肠杆菌体内转录因子gcvR相互作用,从而引起gcvTHP启动子的激活。根据该原理,利用gcvTHP启动子改造获得gcvTHP-mut启动子,并构建gcvTHP-mut启动子启动下游连接报告基因的苏氨酸响应器。利用苏氨酸响应器的实验结果表明:在一定的苏氨酸浓度范围下,随着苏氨酸浓度的增加,苏氨酸响应器的相对单位荧光升高。本发明能够从菌株库中筛选获得高产苏氨酸的菌种,为高通量的选育高产苏氨酸工程菌提供了有效方法。
【专利说明】一种筛选高产苏氨酸菌株的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于功能菌筛选【技术领域】,具体涉及一种筛选高产苏氨酸菌株方法。
【背景技术】
[0002]苏氨酸是人体和动物所必需的八种氨基酸之一,被广泛的应用于食品、饲料和医疗工业等方面。而作为一种重要的发酵氨基酸,采用分子生物学方法改造选育高产苏氨酸菌株是提高苏氨酸产量,解决需求量问题的最好方法
[0003]为了获得目的蛋白的高产菌株,目前常采用化学、物理等方式进行无定向随机诱变;针对酶的催化活性等理化性质进行的定向突变及对于启动子、转录调控等全局性调控元件的定向进化。而作为工程菌选育过程中的一个环节,高通量筛选直接影响后续工作顺利与否。目前选育工程菌的筛选常用的方法均通过摇瓶或发酵罐发酵工程菌,收获细胞,破碎处理并获得细胞匀浆液,使用相应的试剂盒或者色谱检测目标产物的产量,比较并最终筛选相对的高产菌株。这两种方法存 在发酵时间较长,消耗原料多,预处理操作复杂,通量小且试剂盒(或设备)成本较高的问题。
[0004]因此,人工构建高通量的高产苏氨酸菌株筛选方法,对于基因工程中改造获得优质的工程菌株,提高苏氨酸的产量具有十分重要的意义。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种筛选高产苏氨酸菌株的方法,即一种响应苏氨酸的高通量筛选高产苏氨酸菌株的方法,从而克服现有技术的缺陷。
[0006]本发明的筛选高产苏氨酸菌株的方法,包括如下的步骤:
[0007]I)首先构建一种重组质粒,所述的重组质粒含有gcv启动子及受gcv启动子控制的报告基因;
[0008]2)然后将重组质粒转化入待筛选的产苏氨酸的菌株中,然后将转化的菌株在含氨苄青霉素的LB培养基平板中37°C倒置培养过夜,得到需筛选苏氨酸的重组菌种;
[0009]3)取LB平板上的单克隆至含有M9培养基的96孔板或者384孔板中,37摄氏度培养过夜,使用多功能酶标仪分别于550nm和600nm检测荧光值及吸收光,计算荧光值与吸收光的比值获得单位相对荧光值来表示苏氨酸的浓度。
[0010]其中的gcv启动子,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1 ;
[0011]所使用的报告基因优选为红色荧光蛋白基因。
[0012]本发明所使用的重组质粒,一种选用的载体是pLX07,含有pBR322复制子,rrnBTl转录终止子及氨苄青霉素为其抗性基因。
[0013]本发明利用细胞内的调控关系,构建的苏氨酸响应器可以利用启动子响应苏氨酸浓度的变化,目前还没有相关的文献和专利报道;启动子结合红色荧光蛋白报告基因,结果以荧光的形式表现出来,最终进行高通量的菌株筛选。同时,本发明整个过程涉及的操作方法简单、原料价格低廉且实验通量高。【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1:苏氨酸响应器对不同浓度苏氨酸刺激的响应情况,其中X轴为苏氨酸浓度,Y轴为苏氨酸响应器的相对单位荧光;
[0015]图2:本发明获得的4株高产菌与对照菌的响应情况,其中X轴为菌株,Y轴为苏氨酸响应器的相对单位荧光值。
[0016]图3:本发明获得的4株高产菌摇瓶发酵产苏氨酸情况,其中X轴为菌株,Y为发酵48h的苏氨酸产量。
【具体实施方式】
[0017]在利用等温滴定量热法证明苏氨酸与gcv启动子直接相互作用的基础上,本发明使用野生型的gcv启动子作为苏氨酸响应器的核心元件可以响应苏氨酸浓度的变化,并利用该响应器筛选高产苏氨酸的菌株。
[0018]一、苏氨酸响应器的构建
[0019]出发菌株为大肠杆菌MG1655,挑取单克隆并接种于LB培养基中,37°C,200rpm培养10h,培养结束后,使用PBS洗液清洗3次,收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒,提取基因组为模板,设计出用于扩增gcvTHP启动子的特异性引物P-gcv-F和P-gcv-R,并以pLX07质粒为模板,设计合成扩增红色荧光蛋白基因的特异性引物C-rfp-F,C-rfp-R;引物的序列如下:
[0020]P-gcv-F:5 ’ CTAGTCTAGAGAATTCGGTACCAATCCG
[0021]P-gcv-R:5 ‘GGAGGAAGCCATCTTGTCCTCATT
[0022]C-rfp-F:5’AATGAGGACAAGATGGCTTCCTCCG
[0023]C-rfp-R:5’ ACGCGTCGACATTGTCTCATG
[0024]引物两端分别设计XbaI和SalI酶切位点(下划线所示),PCR扩增分别获得gcvTHP的启动子序列(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)和红色荧光蛋白基因,琼脂糖凝胶电泳回收目标片段gcvTHP启动子及红色荧光蛋白基因片段。
[0025]回收的gcvTHP启动子片段和红色荧光蛋白(核苷酸序列为SEQ ID NO: 2),以该两个基因片段为模板,引物P-gcv-F和引物C-rfp-R进行重叠PCR,获得含有gcvTHP启动子的报告基因系统gcv-rfp。gcv-rfp经XbaI和Sal I双酶切,胶回收目标片段并与同样双酶切回收的PLX07载体,构建重组质粒苏氨酸响应器。
[0026]二、苏氨酸响应器对于胞外不同浓度苏氨酸的响应
[0027]将苏氨酸响应器转化入大肠杆菌MG1655菌株中,挑取单克隆,并于LB液体培养基中培养过夜,按照1:100的菌量转接入含有不同苏氨酸浓度的M9培养基中,其中苏氨酸的浓度从80mM按照2倍稀释的方法,稀释至0.15625mM。将转接的菌于37°C培养过夜,并检测单位相对荧光值如下表,表明单位相对荧光值和苏氨酸浓度间具有正相关性(图1)[0028]
【权利要求】
1.一种筛选高产苏氨酸菌株的方法,其特征在于,所述的方法包括如下的步骤: 1)首先构建一种重组质粒,所述的重组质粒含有gcv启动子及受gcv启动子控制的报告基因; 2)然后将重组质粒转化入待筛选的产苏氨酸的菌株中,然后将转化的菌株在含氨苄青霉素的LB培养基平板中37°C倒置培养过夜,得到需筛选苏氨酸的重组菌种; 3)取LB平板上的单克隆至含有M9培养基的96孔板或者384孔板中,37摄氏度培养过夜,使用多功能酶标仪分别于550nm和600nm检测荧光值及吸收光,计算荧光值与吸收光的比值获得单位相对荧光值来表示苏氨酸的浓度。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的gcv启动子,其核苷酸序列为SEQIDNO:1。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的报告基因为红色荧光蛋白基因。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的红色荧光蛋白基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的重组质粒,其载体是PLX07,含有PBR322复制子,rrnB Tl转录终止子及氨苄青霉素为其抗性基因。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于单位相对荧光值的计算公式为RFU= ex610/0D600,其中RFU:单位相对荧光值;ex610:样品的荧光强度;0D600:样品的吸光值。
【文档编号】C12N15/70GK103981206SQ201410246839
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】马红武, 郑阳阳, 刘仲祥 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所

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