改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法
改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法
【专利摘要】本发明涉及一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法。在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造：将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。本发明采用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白，利用花生种子含油量丰富的特点，使油体蛋白占种子总蛋白的10％以上，人Insulin蛋白表达基因经过密码子优化与花生油体蛋白融合表达实现了Insulin蛋白的高水平积累。
【专利说明】改造的人Insul in蛋白表达基因及表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法,尤其涉及Insulin序列的改造、密码子优化和利用油体蛋白表达系统在花生种子中表达人Insulin的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]“糖尿病”是一种血液中的葡萄糖容易堆积过多的疾病，四十岁以上的中年人染患率特别高。据统计2010年我国的糖尿病患者人数居全球之冠，达到了 9240万。Insulin是机体内唯一降低血糖的激素，在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位。我国有近亿人的糖尿病患者，所以对Insulin的需求量巨大。
[0003]临床用Insulin最早主要从动物胰脏中提取，存在人畜共患病原菌和朊病毒污染的风险。随着DNA重组技术研究深入，已成功在大肠杆菌和酵母如毕赤酵母中表达了重组Insulin，不过，原核大肠杆菌和低等真核生物酵母表达重组Insulin存在内毒素污染和无法完成蛋白修饰等系统固有缺陷，而用植物系统表达Insulin具有易于规模化安全和低成本优势，可以弥补原核和酵母系统的不足。
[0004]植物生物反应器成本低，不存在转基因动物细胞或微生物发酵中存在的细胞培养困难、培养基昂贵、在规模化生产时需要严格的培养条件避免污染、成本加大等问题(Liuand Jia, 2003 ；Gomord et al, 2004);安全性高，不存在病原菌的污染的风险(Commandeuret al, 2003 ；Cai et al, 2004);生产的产品一般含有较高的生物活性及免疫活性(Daniellet al, 2001);遗传稳定性高，通过自交和分离能很快获得转基因纯合体(Verwoerd etal, 1995 ；Liu et al, 2000);并且植物转基因技术成熟。利用植物反应器生产有用蛋白，即为“分子农业(molecular farming) ” (Commandeur et al, 2003),是一种非常安全的生产方式。目前已有多种植物用作生物反应器，如烟草(McCormick et al, 1999 ；Ma et all995)、大豆(Giddings et al, 2000)、拟南芥(Potera, 1999)、玉米、油菜(Arakawa et al, 1998 ；Witcher et al, 1998).、马铃薯(Richter et al, 2000 ；Artsaenko et al, 1998)、番爺(Chenet al, 2009)等，其表达产物也是多种多样的，如具有重要价值的药物蛋白、疫苗、抗体等(Yang et al,2009)。
[0005]国际上在转基因马铃薯块茎中表达人Insulin的融合蛋白，Insulin只占马铃薯块茎中可溶性蛋白的0.022%。SemBioSys生物工程公司利用油体蛋白表达系统在红花中表达人Insulin,每亩红花所产的红花籽中能提取到165克Insulin,
[0006]油体蛋白系统比其他表达系统Insulin的含量高，可能由于油体蛋白在种子中高水平表达并大量积累(Y1-hui and Sh1-rong，2003)，并且利用油体蛋白脂溶性的特点很容易将融合蛋白分离纯化，长时间的忙存仍能保持结构稳定(Frandsen et al, 2001),其应用前景非常广泛。目前利用油体蛋白系统已经成功获得了有生物活性的水蛭素、纳豆激酶、β -葡聚糖醛酸酶、木聚糖酶、表皮生长因子等多种蛋白(Zhao et al, 2009)。
[0007]花生(Arachis hypogaea)作为我国最重要的油料作物之一，既可以榨油和深加工，又可以生食，而且花生产量高，如果在花生中生产Insulin，按照每亩600斤花生，如果Insulin占种子总蛋白的1%算，每亩花生生产的Insulin约900克,为红花的5倍多。人Insulin蛋白具有广阔的临床应用前景，经检索，目前还没有关于在花生种子中利用油体蛋白表达系统表达人Insulin蛋白的方法的报道。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术的不足，提供一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法，实现Insulin在花生种子中高水平的表达积累。
[0009]本发明技术方案如下:
[0010]—种在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造:将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。
[0011]根据本发明优选的，上述人Insulin蛋白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0012]胰岛素原(Insulin蛋白)是一个含21个氨基酸的A链和30个氨基酸B链以及C连接肽，共86个氨基酸，由N端至C端的连接顺序为B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A ;将人Insulin的序列将编码区改造成花生偏好的密码子，并将A链的Asn21变为Gly21，同时B链末端添加Arg31、Arg32两 个氨基酸残基,使Insulin的结构更稳定,作用效果更持久。改造以后可以交给生物公司合成Insulin的编码序列。
[0013]一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白的方法，步骤如下:
[0014](I)将上述在花生种子中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段进行人工合成，制得改造后表达基因片段；
[0015](2)以步骤(1)制得的改造后表达基因片段为模板进行PCR扩增，扩增引物如下:
[0016]正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA；
[0017]反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA；
[0018]将经测序正确的PCR产物经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切后，与同样经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切的载体连接，制得植物表达载体；
[0019](3)步骤(2)制得的植物表达载体利用农杆菌侵染法转化花生，获得转基因植株，经育繁后，收获第二代转基因花生纯合体的花生种子，经纯化，制得人Insulin蛋白。
[0020]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下:
[0021]模板1μ 1，2XLA Taq π?χ?ομ 1，正向引物(10μΜ)0.5μ1，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，ddH208.0 μ I。
[0022]PCR反应程序如下:
[0023]94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，30 个循环；72°C再延伸IOrnin0
[0024]根据本发明优选的，所述步骤(2)中的测序为将PCR产物连接到T载体，经人工测序正确，即得。[0025]根据本发明优选的，所述步骤⑵的载体为pCAMBIA2301-Ah01eosin载体，通过在载体PCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的终止子获得。
[0026]根据本发明优选的，所述步骤(3)中纯化的步骤如下:
[0027]将花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀，回收上层的油相，清洗后、离心，再取上层的油相，加入肠肽酶进行酶消化反应，然后离心去掉上层的油相，回收水相，提取得到人Insulin 蛋白。
[0028]有益效果
[0029]1、本发明采用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白，利用花生种子含油量丰富的特点，使油体蛋白占种子总蛋白的10%以上，人Insulin蛋白表达基因经过密码子优化与花生油体蛋白融合表达实现了 Insulin蛋白的高水平积累；
[0030]2、由于花生种子便于贮藏，运输方便，而且重组蛋白在种子中的稳定性高，能在种子中长期保持活性，从而解决了人Insulin蛋白储存、运输的问题；
[0031]3、花生适应性强，种植面积广，融合表达的Insulin分离纯化简单易操作，成本低，增加了农产品的附加 值，为分子农业和生物制药的发展提供了技术支持；与微生物和动物反应器相比，植物表达系统在免疫原性、安全性、来源和成本等方面都更具有潜在的优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1、本发明构建的载体pCAMBIA2301-Aholeosin_Insulin的构建示意图；
[0033]图2、Western检测转基因花生种子中Insulin蛋白的表达结果照片；
[0034]其中:1，2:转经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生，WT:野生型，3，4:转未经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生；
[0035]图3、转基因花生Western检测Insulin蛋白的柱状分析图；
[0036]其中:1，2:转经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生，WT:野生型，3，4:转未经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0038]实施例1、人Insulin序列进行改造和合成
[0039]根据NCBI中人Insulin的编码序列(基因登录号:ΒΤ006808.I)，将编码序列改造成花生偏好密码子，同时将Insulin A链的Asn21变为Gly21，同时B链末端添加Arg31，Arg32两个氨基酸残基，优化改造后的人Insulin蛋白表达基因片段核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，将人Insulin蛋白表达基因片段由生物公司合成。
[0040]实施例2、构建 pCAMBIA2301-Aholeosin-1nsulin 植物表达载体
[0041]构建过程如图1所示，其中Insulin序列的扩增和获得如下:
[0042]以正向引物 primer I: GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA,和反向引物 primer2:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA，用合成的序列如SEQ ID N0.1所示的人Insulin蛋白表达基因片段为模板，进行PCR反应，PCR反应体系为:模板I μ 1，2XLA Taq π?χΙΟμ 1，正向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，ddH208.0 μ I。
[0043]PCR反应的程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C再延伸IOmin。
[0044]PCR产物经1.5wt%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收300bp左右条带，连接到T载体上(pEASY T3,购自Transgen Biotech公司)，连接体系为:
[0045]回收产物4μ 1，T载体1μ 1，25°C连接15min，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。
[0046]大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备:
[0047](I)取-70°C冰冻E.coli DH5 a菌种，用划线法接种细菌于LB培养基，37°C培养过夜。
[0048](2)取一环新鲜的菌落于装有3ml LB试管中，在37°C振荡培养约16h。
[0049](3)取Iml上述菌液转接到装有30ml LB三角烧瓶中(接种量按菌液浓度而定，一般在I %左右)，剧烈振荡培养至OD6tltl值0.2-0.4。
[0050](4)将菌液冰浴IOmin,倒入冰上遇冷50ml的离心管中。4°C, 4000rpm离心5min,
弃上清，收集菌体。
[0051 ] (5)用50mmol/L预冷的CaCl2中约IOml,轻轻的悬浮细胞，冰浴IOmin, 4 V,4000rpm,离心5min,弃上清收集菌体。
[0052](6)将菌体悬浮在l_2ml的50mmol/L冷CaCl2中。置冰上作为转化用的感受态细胞。
[0053](7)用预冷的枪头，取100 μ I分装到预冷的EP管中，加入等体积的30% (体积百分比)的甘油，放入液氮速冻，_70°C保存。
[0054]大肠杆菌的转化:将上述5 μ I的连接产物加入100 μ I DH5 α感受态细胞中混匀。冰上放置30min，42°C热激90s，冰浴5min，加入800 μ I液体LB (NaC110g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37°C IOOrpm振荡培养lh，将菌液均匀涂抹布在含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基上(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂粉15g/L)，37°C培养过夜。挑取单菌落到ImL液体LB中，37°C摇菌4-6h，用primerl和primer2进行PCR检测，对阳性克隆用通用引物进行测序验证(见序列表SEQ ID N0.1)，得到克隆载体T-1nsulin质粒。
[0055]将人Insulin蛋白基因连接到pCAMBIA2301_Ah01eosin表达载体:
[0056]将花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因(序列如SEQ ID N0.2所示)以及tRUBP终止子(序列如SEQ ID N0.3所示)连接至Ij pCAMBIA2301 (Cambia公司有售)的植物表达载体，构建成 pCAMBIA2301-Ah01eosin。将 pCAMBIA2301_Ah01eosin 和 T-1nsulin质粒同时用Xba I和BamH I双酶切，回收载体和Insulin蛋白表达基因片段，T4连接酶将两个片段连接:10XT4DNA ligase buffer2y I, Insulin蛋白表达基因片段6 μ 1，pCAMBIA2301-Ah01eosin2 μ 1，T4DNA Iigasel μ 1，H209 μ 1，16°C连接过夜。
[0057]连接产物按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5 α，同样挑取单菌落PCR验证，测序验证表达载体构建成功。
[0058]表达载体的农杆菌转化:
[0059]制备农杆菌LBA4404的感受态细胞:[0060](I)将_80°C保存的根癌农杆菌LBA4404划板，28°C培养两天；
[0061](2)挑取单克隆，接种于5ml YEP液体培养基中，28°C，220rpm振荡培养过夜；
[0062](3)取 Iml 稀释 50ml YEP (NaC15g/L,蛋白胨 10g/L,酵母粉 10g/L)培养基中，28 0C 250rpm 震荡培养至 0D600 值 0.6 ;
[0063](4)将培养物置于冰上20min，并不时的轻摇，保证内容物充分的冷却；
[0064](5)将菌液转移至预冷的50ml离心管中，4°C，5000rpm离心10min，弃上清液；
[0065](6)菌体用 IOml 预冷的 0.15M 的 NaCl 重悬；4°C, 5000rpm 离心 IOmin ；
[0066](7)弃上清，用Iml预冷的20mM CaCl2 (含15 %的甘油)(250 μ 160 %的甘油加750 μ ICaCl2)重悬；分装到预冷的eppendorf管中(200 μ I/管)；
[0067]重组质粒转化农杆菌:200 μ I感受态细胞中加入I μ I重组质粒，冰浴30min ;液氮冷冻Imin ;37°C水浴融化细胞2-3min ;加入1ml YEP，28°C轻轻震荡2_4h，低速离心lmin，用0.1ml YEP悬浮沉淀，将细胞悬浮液涂布于含50 μ g/ml卡那霉素，50 μ g/ml利福平的YEP (NaC15g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉15g/L)平板上28°C培养2_3天，挑取单菌落，ImlYEP摇菌，菌液用primerl和primer2PCR验证，阳性菌株_80°C保存。
[0068]实施例3、花生的遗传转化和转基因花生种子的获得:
[0069](I)花生胚轴的遗传转化
[0070]外植体的制备:将成熟荚果去果皮，先后浸于浓度为75%的酒精中lmin，在质量浓度为0.1% HgCl2溶液中浸泡15min，进行表面消毒，再用无菌水漂洗3次。将种皮剥离，放入MS0培养基，于光下培养。培养4天左右取胚轴作为外植体。
[0071 ] MS0培养基按如下步骤配制:
[0072]取母液I 50mL,母液 I1、II1、IV 各 5mL ；再取 2,4-D (2，4- 二氯苯氧乙酸)5mL、NAA(萘乙酸)ImL —起放入烧杯中，无菌水定容到1L。固体培养基再加入9g琼脂。
[0073]母液I组分如表1所示:
[0074]表1
【权利要求】
1.一种在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造:将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。
2.如权利要求1所述的人Insulin蛋白表达基因片段,其特征在于,上述人Insulin蛋白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白的方法，其特征在于，步骤如下: (1)将上述在花生种子中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段进行人工合成，制得改造后表达基因片段； (2)以步骤(1)制得的改造后表达基因片段为模板进行PCR扩增，扩增引物如下: 正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA ； 反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA ； 将经测序正确的PCR产物经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切后，与同样经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切的载体连接，制得植物表达载体； (3)步骤(2)制得的植物表达载体利用农杆菌侵染法转化花生，获得转基因植株，经育繁后，收获第二代转基因花生纯合体的花生种子，经纯化，制得人Insulin蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下: 模板 1μ 1，2XLA Taq mixlO μ 1，10 μ M 正向引物 0.5 μ 1，10 μ M 反向引物 0.5 μ 1，ddH208.0 μ I ο PCR反应程序如下: 94°C预变性5min ;94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，30个循环;72°C再延伸IOmin0
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的测序为将PCR产物连接到T载体，经人工测序正确，即得。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵的载体为pCAMBIA2301-Ah01eosin载体，通过在载体pCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的终止子获得。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中农杆菌为LBA4404。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中纯化的步骤如下:将花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀，回收上层的油相，清洗后、离心，再取上层的油相，加入肠肽酶进行酶消化反应，然后离心去掉上层的油相，回收水相，提取得到人Insulin蛋白。
【文档编号】C12N15/17GK104017809SQ201410247746
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】毕玉平, 郑玲, 彭振英, 边斐, 焦其庆, 陈高 申请人:山东省农业科学院生物技术研究中心
【专利摘要】本发明涉及一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法。在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造：将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。本发明采用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白，利用花生种子含油量丰富的特点，使油体蛋白占种子总蛋白的10％以上，人Insulin蛋白表达基因经过密码子优化与花生油体蛋白融合表达实现了Insulin蛋白的高水平积累。
【专利说明】改造的人Insul in蛋白表达基因及表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法,尤其涉及Insulin序列的改造、密码子优化和利用油体蛋白表达系统在花生种子中表达人Insulin的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]“糖尿病”是一种血液中的葡萄糖容易堆积过多的疾病，四十岁以上的中年人染患率特别高。据统计2010年我国的糖尿病患者人数居全球之冠，达到了 9240万。Insulin是机体内唯一降低血糖的激素，在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位。我国有近亿人的糖尿病患者，所以对Insulin的需求量巨大。
[0003]临床用Insulin最早主要从动物胰脏中提取，存在人畜共患病原菌和朊病毒污染的风险。随着DNA重组技术研究深入，已成功在大肠杆菌和酵母如毕赤酵母中表达了重组Insulin，不过，原核大肠杆菌和低等真核生物酵母表达重组Insulin存在内毒素污染和无法完成蛋白修饰等系统固有缺陷，而用植物系统表达Insulin具有易于规模化安全和低成本优势，可以弥补原核和酵母系统的不足。
[0004]植物生物反应器成本低，不存在转基因动物细胞或微生物发酵中存在的细胞培养困难、培养基昂贵、在规模化生产时需要严格的培养条件避免污染、成本加大等问题(Liuand Jia, 2003 ；Gomord et al, 2004);安全性高，不存在病原菌的污染的风险(Commandeuret al, 2003 ；Cai et al, 2004);生产的产品一般含有较高的生物活性及免疫活性(Daniellet al, 2001);遗传稳定性高，通过自交和分离能很快获得转基因纯合体(Verwoerd etal, 1995 ；Liu et al, 2000);并且植物转基因技术成熟。利用植物反应器生产有用蛋白，即为“分子农业(molecular farming) ” (Commandeur et al, 2003),是一种非常安全的生产方式。目前已有多种植物用作生物反应器，如烟草(McCormick et al, 1999 ；Ma et all995)、大豆(Giddings et al, 2000)、拟南芥(Potera, 1999)、玉米、油菜(Arakawa et al, 1998 ；Witcher et al, 1998).、马铃薯(Richter et al, 2000 ；Artsaenko et al, 1998)、番爺(Chenet al, 2009)等，其表达产物也是多种多样的，如具有重要价值的药物蛋白、疫苗、抗体等(Yang et al,2009)。
[0005]国际上在转基因马铃薯块茎中表达人Insulin的融合蛋白，Insulin只占马铃薯块茎中可溶性蛋白的0.022%。SemBioSys生物工程公司利用油体蛋白表达系统在红花中表达人Insulin,每亩红花所产的红花籽中能提取到165克Insulin,
[0006]油体蛋白系统比其他表达系统Insulin的含量高，可能由于油体蛋白在种子中高水平表达并大量积累(Y1-hui and Sh1-rong，2003)，并且利用油体蛋白脂溶性的特点很容易将融合蛋白分离纯化，长时间的忙存仍能保持结构稳定(Frandsen et al, 2001),其应用前景非常广泛。目前利用油体蛋白系统已经成功获得了有生物活性的水蛭素、纳豆激酶、β -葡聚糖醛酸酶、木聚糖酶、表皮生长因子等多种蛋白(Zhao et al, 2009)。
[0007]花生(Arachis hypogaea)作为我国最重要的油料作物之一，既可以榨油和深加工，又可以生食，而且花生产量高，如果在花生中生产Insulin，按照每亩600斤花生，如果Insulin占种子总蛋白的1%算，每亩花生生产的Insulin约900克,为红花的5倍多。人Insulin蛋白具有广阔的临床应用前景，经检索，目前还没有关于在花生种子中利用油体蛋白表达系统表达人Insulin蛋白的方法的报道。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术的不足，提供一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法，实现Insulin在花生种子中高水平的表达积累。
[0009]本发明技术方案如下:
[0010]—种在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造:将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。
[0011]根据本发明优选的，上述人Insulin蛋白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0012]胰岛素原(Insulin蛋白)是一个含21个氨基酸的A链和30个氨基酸B链以及C连接肽，共86个氨基酸，由N端至C端的连接顺序为B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A ;将人Insulin的序列将编码区改造成花生偏好的密码子，并将A链的Asn21变为Gly21，同时B链末端添加Arg31、Arg32两 个氨基酸残基,使Insulin的结构更稳定,作用效果更持久。改造以后可以交给生物公司合成Insulin的编码序列。
[0013]一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白的方法，步骤如下:
[0014](I)将上述在花生种子中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段进行人工合成，制得改造后表达基因片段；
[0015](2)以步骤(1)制得的改造后表达基因片段为模板进行PCR扩增，扩增引物如下:
[0016]正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA；
[0017]反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA；
[0018]将经测序正确的PCR产物经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切后，与同样经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切的载体连接，制得植物表达载体；
[0019](3)步骤(2)制得的植物表达载体利用农杆菌侵染法转化花生，获得转基因植株，经育繁后，收获第二代转基因花生纯合体的花生种子，经纯化，制得人Insulin蛋白。
[0020]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下:
[0021]模板1μ 1，2XLA Taq π?χ?ομ 1，正向引物(10μΜ)0.5μ1，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，ddH208.0 μ I。
[0022]PCR反应程序如下:
[0023]94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，30 个循环；72°C再延伸IOrnin0
[0024]根据本发明优选的，所述步骤(2)中的测序为将PCR产物连接到T载体，经人工测序正确，即得。[0025]根据本发明优选的，所述步骤⑵的载体为pCAMBIA2301-Ah01eosin载体，通过在载体PCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的终止子获得。
[0026]根据本发明优选的，所述步骤(3)中纯化的步骤如下:
[0027]将花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀，回收上层的油相，清洗后、离心，再取上层的油相，加入肠肽酶进行酶消化反应，然后离心去掉上层的油相，回收水相，提取得到人Insulin 蛋白。
[0028]有益效果
[0029]1、本发明采用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白，利用花生种子含油量丰富的特点，使油体蛋白占种子总蛋白的10%以上，人Insulin蛋白表达基因经过密码子优化与花生油体蛋白融合表达实现了 Insulin蛋白的高水平积累；
[0030]2、由于花生种子便于贮藏，运输方便，而且重组蛋白在种子中的稳定性高，能在种子中长期保持活性，从而解决了人Insulin蛋白储存、运输的问题；
[0031]3、花生适应性强，种植面积广，融合表达的Insulin分离纯化简单易操作，成本低，增加了农产品的附加 值，为分子农业和生物制药的发展提供了技术支持；与微生物和动物反应器相比，植物表达系统在免疫原性、安全性、来源和成本等方面都更具有潜在的优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1、本发明构建的载体pCAMBIA2301-Aholeosin_Insulin的构建示意图；
[0033]图2、Western检测转基因花生种子中Insulin蛋白的表达结果照片；
[0034]其中:1，2:转经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生，WT:野生型，3，4:转未经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生；
[0035]图3、转基因花生Western检测Insulin蛋白的柱状分析图；
[0036]其中:1，2:转经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生，WT:野生型，3，4:转未经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0038]实施例1、人Insulin序列进行改造和合成
[0039]根据NCBI中人Insulin的编码序列(基因登录号:ΒΤ006808.I)，将编码序列改造成花生偏好密码子，同时将Insulin A链的Asn21变为Gly21，同时B链末端添加Arg31，Arg32两个氨基酸残基，优化改造后的人Insulin蛋白表达基因片段核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，将人Insulin蛋白表达基因片段由生物公司合成。
[0040]实施例2、构建 pCAMBIA2301-Aholeosin-1nsulin 植物表达载体
[0041]构建过程如图1所示，其中Insulin序列的扩增和获得如下:
[0042]以正向引物 primer I: GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA,和反向引物 primer2:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA，用合成的序列如SEQ ID N0.1所示的人Insulin蛋白表达基因片段为模板，进行PCR反应，PCR反应体系为:模板I μ 1，2XLA Taq π?χΙΟμ 1，正向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，ddH208.0 μ I。
[0043]PCR反应的程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C再延伸IOmin。
[0044]PCR产物经1.5wt%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收300bp左右条带，连接到T载体上(pEASY T3,购自Transgen Biotech公司)，连接体系为:
[0045]回收产物4μ 1，T载体1μ 1，25°C连接15min，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。
[0046]大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备:
[0047](I)取-70°C冰冻E.coli DH5 a菌种，用划线法接种细菌于LB培养基，37°C培养过夜。
[0048](2)取一环新鲜的菌落于装有3ml LB试管中，在37°C振荡培养约16h。
[0049](3)取Iml上述菌液转接到装有30ml LB三角烧瓶中(接种量按菌液浓度而定，一般在I %左右)，剧烈振荡培养至OD6tltl值0.2-0.4。
[0050](4)将菌液冰浴IOmin,倒入冰上遇冷50ml的离心管中。4°C, 4000rpm离心5min,
弃上清，收集菌体。
[0051 ] (5)用50mmol/L预冷的CaCl2中约IOml,轻轻的悬浮细胞，冰浴IOmin, 4 V,4000rpm,离心5min,弃上清收集菌体。
[0052](6)将菌体悬浮在l_2ml的50mmol/L冷CaCl2中。置冰上作为转化用的感受态细胞。
[0053](7)用预冷的枪头，取100 μ I分装到预冷的EP管中，加入等体积的30% (体积百分比)的甘油，放入液氮速冻，_70°C保存。
[0054]大肠杆菌的转化:将上述5 μ I的连接产物加入100 μ I DH5 α感受态细胞中混匀。冰上放置30min，42°C热激90s，冰浴5min，加入800 μ I液体LB (NaC110g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37°C IOOrpm振荡培养lh，将菌液均匀涂抹布在含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基上(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂粉15g/L)，37°C培养过夜。挑取单菌落到ImL液体LB中，37°C摇菌4-6h，用primerl和primer2进行PCR检测，对阳性克隆用通用引物进行测序验证(见序列表SEQ ID N0.1)，得到克隆载体T-1nsulin质粒。
[0055]将人Insulin蛋白基因连接到pCAMBIA2301_Ah01eosin表达载体:
[0056]将花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因(序列如SEQ ID N0.2所示)以及tRUBP终止子(序列如SEQ ID N0.3所示)连接至Ij pCAMBIA2301 (Cambia公司有售)的植物表达载体，构建成 pCAMBIA2301-Ah01eosin。将 pCAMBIA2301_Ah01eosin 和 T-1nsulin质粒同时用Xba I和BamH I双酶切，回收载体和Insulin蛋白表达基因片段，T4连接酶将两个片段连接:10XT4DNA ligase buffer2y I, Insulin蛋白表达基因片段6 μ 1，pCAMBIA2301-Ah01eosin2 μ 1，T4DNA Iigasel μ 1，H209 μ 1，16°C连接过夜。
[0057]连接产物按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5 α，同样挑取单菌落PCR验证，测序验证表达载体构建成功。
[0058]表达载体的农杆菌转化:
[0059]制备农杆菌LBA4404的感受态细胞:[0060](I)将_80°C保存的根癌农杆菌LBA4404划板，28°C培养两天；
[0061](2)挑取单克隆，接种于5ml YEP液体培养基中，28°C，220rpm振荡培养过夜；
[0062](3)取 Iml 稀释 50ml YEP (NaC15g/L,蛋白胨 10g/L,酵母粉 10g/L)培养基中，28 0C 250rpm 震荡培养至 0D600 值 0.6 ;
[0063](4)将培养物置于冰上20min，并不时的轻摇，保证内容物充分的冷却；
[0064](5)将菌液转移至预冷的50ml离心管中，4°C，5000rpm离心10min，弃上清液；
[0065](6)菌体用 IOml 预冷的 0.15M 的 NaCl 重悬；4°C, 5000rpm 离心 IOmin ；
[0066](7)弃上清，用Iml预冷的20mM CaCl2 (含15 %的甘油)(250 μ 160 %的甘油加750 μ ICaCl2)重悬；分装到预冷的eppendorf管中(200 μ I/管)；
[0067]重组质粒转化农杆菌:200 μ I感受态细胞中加入I μ I重组质粒，冰浴30min ;液氮冷冻Imin ;37°C水浴融化细胞2-3min ;加入1ml YEP，28°C轻轻震荡2_4h，低速离心lmin，用0.1ml YEP悬浮沉淀，将细胞悬浮液涂布于含50 μ g/ml卡那霉素，50 μ g/ml利福平的YEP (NaC15g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉15g/L)平板上28°C培养2_3天，挑取单菌落，ImlYEP摇菌，菌液用primerl和primer2PCR验证，阳性菌株_80°C保存。
[0068]实施例3、花生的遗传转化和转基因花生种子的获得:
[0069](I)花生胚轴的遗传转化
[0070]外植体的制备:将成熟荚果去果皮，先后浸于浓度为75%的酒精中lmin，在质量浓度为0.1% HgCl2溶液中浸泡15min，进行表面消毒，再用无菌水漂洗3次。将种皮剥离，放入MS0培养基，于光下培养。培养4天左右取胚轴作为外植体。
[0071 ] MS0培养基按如下步骤配制:
[0072]取母液I 50mL,母液 I1、II1、IV 各 5mL ；再取 2,4-D (2，4- 二氯苯氧乙酸)5mL、NAA(萘乙酸)ImL —起放入烧杯中，无菌水定容到1L。固体培养基再加入9g琼脂。
[0073]母液I组分如表1所示:
[0074]表1
【权利要求】
1.一种在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段，将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化，并进行如下改造:将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸，同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。
2.如权利要求1所述的人Insulin蛋白表达基因片段,其特征在于,上述人Insulin蛋白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白的方法，其特征在于，步骤如下: (1)将上述在花生种子中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段进行人工合成，制得改造后表达基因片段； (2)以步骤(1)制得的改造后表达基因片段为模板进行PCR扩增，扩增引物如下: 正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA ； 反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA ； 将经测序正确的PCR产物经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切后，与同样经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切的载体连接，制得植物表达载体； (3)步骤(2)制得的植物表达载体利用农杆菌侵染法转化花生，获得转基因植株，经育繁后，收获第二代转基因花生纯合体的花生种子，经纯化，制得人Insulin蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下: 模板 1μ 1，2XLA Taq mixlO μ 1，10 μ M 正向引物 0.5 μ 1，10 μ M 反向引物 0.5 μ 1，ddH208.0 μ I ο PCR反应程序如下: 94°C预变性5min ;94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，30个循环;72°C再延伸IOmin0
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的测序为将PCR产物连接到T载体，经人工测序正确，即得。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵的载体为pCAMBIA2301-Ah01eosin载体，通过在载体pCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的终止子获得。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中农杆菌为LBA4404。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中纯化的步骤如下:将花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀，回收上层的油相，清洗后、离心，再取上层的油相，加入肠肽酶进行酶消化反应，然后离心去掉上层的油相，回收水相，提取得到人Insulin蛋白。
【文档编号】C12N15/17GK104017809SQ201410247746
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】毕玉平, 郑玲, 彭振英, 边斐, 焦其庆, 陈高 申请人:山东省农业科学院生物技术研究中心
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