改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法
【专利摘要】本发明涉及一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法。在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段,将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化,并进行如下改造:将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸,同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。本发明采用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白,利用花生种子含油量丰富的特点,使油体蛋白占种子总蛋白的10%以上,人Insulin蛋白表达基因经过密码子优化与花生油体蛋白融合表达实现了Insulin蛋白的高水平积累。
【专利说明】改造的人Insul in蛋白表达基因及表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法,尤其涉及Insulin序列的改造、密码子优化和利用油体蛋白表达系统在花生种子中表达人Insulin的方法,属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]“糖尿病”是一种血液中的葡萄糖容易堆积过多的疾病,四十岁以上的中年人染患率特别高。据统计2010年我国的糖尿病患者人数居全球之冠,达到了 9240万。Insulin是机体内唯一降低血糖的激素,在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位。我国有近亿人的糖尿病患者,所以对Insulin的需求量巨大。
[0003]临床用Insulin最早主要从动物胰脏中提取,存在人畜共患病原菌和朊病毒污染的风险。随着DNA重组技术研究深入,已成功在大肠杆菌和酵母如毕赤酵母中表达了重组Insulin,不过,原核大肠杆菌和低等真核生物酵母表达重组Insulin存在内毒素污染和无法完成蛋白修饰等系统固有缺陷,而用植物系统表达Insulin具有易于规模化安全和低成本优势,可以弥补原核和酵母系统的不足。
[0004]植物生物反应器成本低,不存在转基因动物细胞或微生物发酵中存在的细胞培养困难、培养基昂贵、在规模化生产时需要严格的培养条件避免污染、成本加大等问题(Liuand Jia, 2003 ;Gomord et al, 2004);安全性高,不存在病原菌的污染的风险(Commandeuret al, 2003 ;Cai et al, 2004);生产的产品一般含有较高的生物活性及免疫活性(Daniellet al, 2001);遗传稳定性高,通过自交和分离能很快获得转基因纯合体(Verwoerd etal, 1995 ;Liu et al, 2000);并且植物转基因技术成熟。利用植物反应器生产有用蛋白,即为“分子农业(molecular farming) ” (Commandeur et al, 2003),是一种非常安全的生产方式。目前已有多种植物用作生物反应器,如烟草(McCormick et al, 1999 ;Ma et all995)、大豆(Giddings et al, 2000)、拟南芥(Potera, 1999)、玉米、油菜(Arakawa et al, 1998 ;Witcher et al, 1998).、马铃薯(Richter et al, 2000 ;Artsaenko et al, 1998)、番爺(Chenet al, 2009)等,其表达产物也是多种多样的,如具有重要价值的药物蛋白、疫苗、抗体等(Yang et al,2009)。
[0005]国际上在转基因马铃薯块茎中表达人Insulin的融合蛋白,Insulin只占马铃薯块茎中可溶性蛋白的0.022%。SemBioSys生物工程公司利用油体蛋白表达系统在红花中表达人Insulin,每亩红花所产的红花籽中能提取到165克Insulin,
[0006]油体蛋白系统比其他表达系统Insulin的含量高,可能由于油体蛋白在种子中高水平表达并大量积累(Y1-hui and Sh1-rong,2003),并且利用油体蛋白脂溶性的特点很容易将融合蛋白分离纯化,长时间的忙存仍能保持结构稳定(Frandsen et al, 2001),其应用前景非常广泛。目前利用油体蛋白系统已经成功获得了有生物活性的水蛭素、纳豆激酶、β -葡聚糖醛酸酶、木聚糖酶、表皮生长因子等多种蛋白(Zhao et al, 2009)。
[0007]花生(Arachis hypogaea)作为我国最重要的油料作物之一,既可以榨油和深加工,又可以生食,而且花生产量高,如果在花生中生产Insulin,按照每亩600斤花生,如果Insulin占种子总蛋白的1%算,每亩花生生产的Insulin约900克,为红花的5倍多。人Insulin蛋白具有广阔的临床应用前景,经检索,目前还没有关于在花生种子中利用油体蛋白表达系统表达人Insulin蛋白的方法的报道。

【发明内容】

[0008]本发明针对现有技术的不足,提供一种改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法,实现Insulin在花生种子中高水平的表达积累。
[0009]本发明技术方案如下:
[0010]—种在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段,将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化,并进行如下改造:将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸,同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。
[0011]根据本发明优选的,上述人Insulin蛋白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0012]胰岛素原(Insulin蛋白)是一个含21个氨基酸的A链和30个氨基酸B链以及C连接肽,共86个氨基酸,由N端至C端的连接顺序为B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A ;将人Insulin的序列将编码区改造成花生偏好的密码子,并将A链的Asn21变为Gly21,同时B链末端添加Arg31、Arg32两 个氨基酸残基,使Insulin的结构更稳定,作用效果更持久。改造以后可以交给生物公司合成Insulin的编码序列。
[0013]一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白的方法,步骤如下:
[0014](I)将上述在花生种子中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段进行人工合成,制得改造后表达基因片段;
[0015](2)以步骤(1)制得的改造后表达基因片段为模板进行PCR扩增,扩增引物如下:
[0016]正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA;
[0017]反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA;
[0018]将经测序正确的PCR产物经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切后,与同样经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切的载体连接,制得植物表达载体;
[0019](3)步骤(2)制得的植物表达载体利用农杆菌侵染法转化花生,获得转基因植株,经育繁后,收获第二代转基因花生纯合体的花生种子,经纯化,制得人Insulin蛋白。
[0020]根据本发明优选的,所述步骤(2)中,PCR反应体系如下:
[0021]模板1μ 1,2XLA Taq π?χ?ομ 1,正向引物(10μΜ)0.5μ1,反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1,ddH208.0 μ I。
[0022]PCR反应程序如下:
[0023]94°C预变性 5min ;94°C变性 30s,55°C退火 30s,72°C延伸 30s,30 个循环;72°C再延伸IOrnin0
[0024]根据本发明优选的,所述步骤(2)中的测序为将PCR产物连接到T载体,经人工测序正确,即得。[0025]根据本发明优选的,所述步骤⑵的载体为pCAMBIA2301-Ah01eosin载体,通过在载体PCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的终止子获得。
[0026]根据本发明优选的,所述步骤(3)中纯化的步骤如下:
[0027]将花生种子匀浆、压榨;离心后去掉沉淀,回收上层的油相,清洗后、离心,再取上层的油相,加入肠肽酶进行酶消化反应,然后离心去掉上层的油相,回收水相,提取得到人Insulin 蛋白。
[0028]有益效果
[0029]1、本发明采用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白,利用花生种子含油量丰富的特点,使油体蛋白占种子总蛋白的10%以上,人Insulin蛋白表达基因经过密码子优化与花生油体蛋白融合表达实现了 Insulin蛋白的高水平积累;
[0030]2、由于花生种子便于贮藏,运输方便,而且重组蛋白在种子中的稳定性高,能在种子中长期保持活性,从而解决了人Insulin蛋白储存、运输的问题;
[0031]3、花生适应性强,种植面积广,融合表达的Insulin分离纯化简单易操作,成本低,增加了农产品的附加 值,为分子农业和生物制药的发展提供了技术支持;与微生物和动物反应器相比,植物表达系统在免疫原性、安全性、来源和成本等方面都更具有潜在的优势。
【专利附图】

【附图说明】
[0032]图1、本发明构建的载体pCAMBIA2301-Aholeosin_Insulin的构建示意图;
[0033]图2、Western检测转基因花生种子中Insulin蛋白的表达结果照片;
[0034]其中:1,2:转经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生,WT:野生型,3,4:转未经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生;
[0035]图3、转基因花生Western检测Insulin蛋白的柱状分析图;
[0036]其中:1,2:转经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生,WT:野生型,3,4:转未经优化改造的Insulin蛋白表达基因的花生。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明,但本发明所保护范围不限于此。
[0038]实施例1、人Insulin序列进行改造和合成
[0039]根据NCBI中人Insulin的编码序列(基因登录号:ΒΤ006808.I),将编码序列改造成花生偏好密码子,同时将Insulin A链的Asn21变为Gly21,同时B链末端添加Arg31,Arg32两个氨基酸残基,优化改造后的人Insulin蛋白表达基因片段核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示,将人Insulin蛋白表达基因片段由生物公司合成。
[0040]实施例2、构建 pCAMBIA2301-Aholeosin-1nsulin 植物表达载体
[0041]构建过程如图1所示,其中Insulin序列的扩增和获得如下:
[0042]以正向引物 primer I: GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA,和反向引物 primer2:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA,用合成的序列如SEQ ID N0.1所示的人Insulin蛋白表达基因片段为模板,进行PCR反应,PCR反应体系为:模板I μ 1,2XLA Taq π?χΙΟμ 1,正向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1,反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1,ddH208.0 μ I。
[0043]PCR反应的程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸30s,30个循环;72°C再延伸IOmin。
[0044]PCR产物经1.5wt%的琼脂糖凝胶电泳,胶回收300bp左右条带,连接到T载体上(pEASY T3,购自Transgen Biotech公司),连接体系为:
[0045]回收产物4μ 1,T载体1μ 1,25°C连接15min,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。
[0046]大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备:
[0047](I)取-70°C冰冻E.coli DH5 a菌种,用划线法接种细菌于LB培养基,37°C培养过夜。
[0048](2)取一环新鲜的菌落于装有3ml LB试管中,在37°C振荡培养约16h。
[0049](3)取Iml上述菌液转接到装有30ml LB三角烧瓶中(接种量按菌液浓度而定,一般在I %左右),剧烈振荡培养至OD6tltl值0.2-0.4。
[0050](4)将菌液冰浴IOmin,倒入冰上遇冷50ml的离心管中。4°C, 4000rpm离心5min,
弃上清,收集菌体。
[0051 ] (5)用50mmol/L预冷的CaCl2中约IOml,轻轻的悬浮细胞,冰浴IOmin, 4 V,4000rpm,离心5min,弃上清收集菌体。
[0052](6)将菌体悬浮在l_2ml的50mmol/L冷CaCl2中。置冰上作为转化用的感受态细胞。
[0053](7)用预冷的枪头,取100 μ I分装到预冷的EP管中,加入等体积的30% (体积百分比)的甘油,放入液氮速冻,_70°C保存。
[0054]大肠杆菌的转化:将上述5 μ I的连接产物加入100 μ I DH5 α感受态细胞中混匀。冰上放置30min,42°C热激90s,冰浴5min,加入800 μ I液体LB (NaC110g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L),37°C IOOrpm振荡培养lh,将菌液均匀涂抹布在含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基上(NaCl 10g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,琼脂粉15g/L),37°C培养过夜。挑取单菌落到ImL液体LB中,37°C摇菌4-6h,用primerl和primer2进行PCR检测,对阳性克隆用通用引物进行测序验证(见序列表SEQ ID N0.1),得到克隆载体T-1nsulin质粒。
[0055]将人Insulin蛋白基因连接到pCAMBIA2301_Ah01eosin表达载体:
[0056]将花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因(序列如SEQ ID N0.2所示)以及tRUBP终止子(序列如SEQ ID N0.3所示)连接至Ij pCAMBIA2301 (Cambia公司有售)的植物表达载体,构建成 pCAMBIA2301-Ah01eosin。将 pCAMBIA2301_Ah01eosin 和 T-1nsulin质粒同时用Xba I和BamH I双酶切,回收载体和Insulin蛋白表达基因片段,T4连接酶将两个片段连接:10XT4DNA ligase buffer2y I, Insulin蛋白表达基因片段6 μ 1,pCAMBIA2301-Ah01eosin2 μ 1,T4DNA Iigasel μ 1,H209 μ 1,16°C连接过夜。
[0057]连接产物按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5 α,同样挑取单菌落PCR验证,测序验证表达载体构建成功。
[0058]表达载体的农杆菌转化:
[0059]制备农杆菌LBA4404的感受态细胞:[0060](I)将_80°C保存的根癌农杆菌LBA4404划板,28°C培养两天;
[0061](2)挑取单克隆,接种于5ml YEP液体培养基中,28°C,220rpm振荡培养过夜;
[0062](3)取 Iml 稀释 50ml YEP (NaC15g/L,蛋白胨 10g/L,酵母粉 10g/L)培养基中,28 0C 250rpm 震荡培养至 0D600 值 0.6 ;
[0063](4)将培养物置于冰上20min,并不时的轻摇,保证内容物充分的冷却;
[0064](5)将菌液转移至预冷的50ml离心管中,4°C,5000rpm离心10min,弃上清液;
[0065](6)菌体用 IOml 预冷的 0.15M 的 NaCl 重悬;4°C, 5000rpm 离心 IOmin ;
[0066](7)弃上清,用Iml预冷的20mM CaCl2 (含15 %的甘油)(250 μ 160 %的甘油加750 μ ICaCl2)重悬;分装到预冷的eppendorf管中(200 μ I/管);
[0067]重组质粒转化农杆菌:200 μ I感受态细胞中加入I μ I重组质粒,冰浴30min ;液氮冷冻Imin ;37°C水浴融化细胞2-3min ;加入1ml YEP,28°C轻轻震荡2_4h,低速离心lmin,用0.1ml YEP悬浮沉淀,将细胞悬浮液涂布于含50 μ g/ml卡那霉素,50 μ g/ml利福平的YEP (NaC15g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉10g/L,琼脂粉15g/L)平板上28°C培养2_3天,挑取单菌落,ImlYEP摇菌,菌液用primerl和primer2PCR验证,阳性菌株_80°C保存。
[0068]实施例3、花生的遗传转化和转基因花生种子的获得:
[0069](I)花生胚轴的遗传转化
[0070]外植体的制备:将成熟荚果去果皮,先后浸于浓度为75%的酒精中lmin,在质量浓度为0.1% HgCl2溶液中浸泡15min,进行表面消毒,再用无菌水漂洗3次。将种皮剥离,放入MS0培养基,于光下培养。培养4天左右取胚轴作为外植体。
[0071 ] MS0培养基按如下步骤配制:
[0072]取母液I 50mL,母液 I1、II1、IV 各 5mL ;再取 2,4-D (2,4- 二氯苯氧乙酸)5mL、NAA(萘乙酸)ImL —起放入烧杯中,无菌水定容到1L。固体培养基再加入9g琼脂。
[0073]母液I组分如表1所示:
[0074]表1
【权利要求】
1.一种在花生油体蛋白系统中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段,将表达人Insulin蛋白的表达基因按照花生偏好的密码子进行优化,并进行如下改造:将表达A链的基因片段中表达Asn21的核苷酸变为表达Gly21的核苷酸,同时表达B链基因片段的末端添加表达Arg31、Arg32两个氨基酸残基的核苷酸。
2.如权利要求1所述的人Insulin蛋白表达基因片段,其特征在于,上述人Insulin蛋白表达基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人Insulin蛋白的方法,其特征在于,步骤如下: (1)将上述在花生种子中易于表达的人Insulin蛋白表达基因片段进行人工合成,制得改造后表达基因片段; (2)以步骤(1)制得的改造后表达基因片段为模板进行PCR扩增,扩增引物如下: 正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA ; 反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA ; 将经测序正确的PCR产物经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切后,与同样经限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xba I双酶切的载体连接,制得植物表达载体; (3)步骤(2)制得的植物表达载体利用农杆菌侵染法转化花生,获得转基因植株,经育繁后,收获第二代转基因花生纯合体的花生种子,经纯化,制得人Insulin蛋白。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,PCR反应体系如下: 模板 1μ 1,2XLA Taq mixlO μ 1,10 μ M 正向引物 0.5 μ 1,10 μ M 反向引物 0.5 μ 1,ddH208.0 μ I ο PCR反应程序如下: 94°C预变性5min ;94°C变性30s,55。。退火30s,72。。延伸30s,30个循环;72°C再延伸IOmin0
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的测序为将PCR产物连接到T载体,经人工测序正确,即得。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤⑵的载体为pCAMBIA2301-Ah01eosin载体,通过在载体pCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油体蛋白启动子及花生油体蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的终止子获得。
7.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中农杆菌为LBA4404。
8.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中纯化的步骤如下:将花生种子匀浆、压榨;离心后去掉沉淀,回收上层的油相,清洗后、离心,再取上层的油相,加入肠肽酶进行酶消化反应,然后离心去掉上层的油相,回收水相,提取得到人Insulin蛋白。
【文档编号】C12N15/17GK104017809SQ201410247746
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】毕玉平, 郑玲, 彭振英, 边斐, 焦其庆, 陈高 申请人:山东省农业科学院生物技术研究中心

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