基于肠上皮细胞对76nm的纳米银生物安全性的评价方法
基于肠上皮细胞对76nm的纳米银生物安全性的评价方法
【专利摘要】本发明基于肠上皮细胞对76nm的纳米银生物安全性的评价方法选取人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株作为研究对象，采用细胞毒性较强的纳米氧化锌（90.81nm）为阳性对照，不加入纳米材料的正常细胞为空白对照，通过AO/EB双染法、CCK-8法初步探究究纳米材料的细胞毒性。使用氧化应激的方法，通过检测Caco-2细胞内ROS、SOD、GSH释放量的影响，来探讨纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。结果表明76.29nm的银粒子（<200μg/ml）对Caco-2细胞的活性没有明显影响，对Caco-2细胞没有氧化应激损伤,但是使细胞的抗氧化力增强，在纳米银浓度为50μg/ml，细胞抗氧化能力达到最高水平。
【专利说明】基于肠上皮细胞对76nm的纳米银生物安全性的评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全领域，具体是一种基于肠上皮细胞对76. 29nm的纳米银生物 安全性的评价方法。
【背景技术】
[0002] 纳米银的抗菌性比常规银更强，微量纳米银可以产生很强的杀菌效应。纳米银凭 借优异的抗菌性，在食品产业的应用越来越广泛，成为近年来研究的热点之一。但是，应用 于食品领域的纳米银粒子能发生迁移，通过消化道侵入人体，并可能在深部蓄积。因此，纳 米银的食品安全问题值得引起关注。
[0003] 近年来，商品化纳米材料主要集中在银、碳、氧化锌、硅、二氧化钛和金等材料上， 其中大部分纳米商品涉及金属银，占所有纳米材料制品的50%以上，呈现出逐年递增的趋 势。
[0004] 纳米技术使银的杀菌能力产生了质的飞跃，纳米银在很短的时间内，可以杀死650 多种细菌，并且对细菌、霉菌及有害孢子的生长也会起到有效的抑制作用。Choi等研究了纳 米银、银离子、氯化银胶体三种含银产品的抗菌性强度，得到了纳米银抗菌性最强的研究结 果。
[0005] 近年来，科研工作者，对纳米银的抗菌原理进行了系统的探究，通过研究纳米银在 形态、结构、生理变化方面对微生物的影响，初步了解其抗菌规律，进一步从蛋白质和转录 水平上研究其抗菌性，最终得到了纳米银抗菌的毒性机制。当纳米银与细菌接触时，会依 附在细胞膜表面，通过与细胞外膜上蛋白、多糖等屏障物质的作用，破坏细胞膜的结构和功 能，使细胞膜的电势和渗透性发丝变化，纳米银进入细胞后，造成了 ATP大量水解。另外，纳 米银在遇到含水的环境时，可以释放银离子进入细胞内，诱导其产生活性氧自由基，最终导 致细胞氧化应激和细胞膜损伤，引发细胞凋亡和坏死。
[0006] 食品及食品相关产品通过纳米添加剂来提高产品的加工性能、稳定性和功效性。 纳米材料可以用于食品添加剂、食品包装等食品相关产品抗菌性能的优化。根据2011年伍 德罗·威尔逊对纳米技术消费产品的统计，在消费类产品中银纳米粒子是最常用的纳米级 别添加剂。
[0007] 银离子抗菌剂不仅抗菌性好、不易产生抗药性，而且安全性高。银离子具有高反映 活性，容易与一系列带负电荷的分子结合，包括无机阴离子、DNA分子、RNA分子和蛋白质。 Shahverdi A R等的研究表明，纳米银在浓度低于2Pg/ml时也能表现出抗菌性，并且，其对 真菌和病毒也有杀伤力。Sun R W Y等发现纳米银能够有效抑制细胞内病毒复制，减少与 HIV相关的细胞凋亡。
[0008] 目前，食品用纳米银已成为国内外研究的热点。纳米包装材料与传统的聚乙烯包 装材料相比，具有较高的机械性能优良的理化性能加工性能以及较好的生态安全性。添 加纳米银的包装材料在延长食品货架期上具有潜在应用。何强等发现，在保鲜包装材料中 的纳米银能减少乙烯含量，提高保鲜效果。杨燕婷等发现，纳米材料能显著保持金针菇在贮 藏过程中的感官品质和营养成分，可维持较低的膜透性和氧化程度，延缓金针菇的劣变。苏 晶等利用新型纳米材料包装对柿果货架品质进行了研究，结果表明纳米材料能有效起到果 蔬保鲜作用。Fernandez A等研究了新开发的纤维素一银（cellulose - silver)纳米 粒混合材料在Piel de Sapo加工贮藏期间的抗菌活性，发现纤维素一银纳米复合材料被瓜 汁浸渍时，释放出的银离子对于控制腐败微生物作用明显，微生物的滞后期被延长。此外， 银的存在可延迟有切口瓜的衰老。
[0009] 纳米材料可用于饮用水消毒，有研究报道，研制出了可以用于饮用水消毒的载银 活性碳纤维。今年来，含纳米银的抗菌塑料逐渐受到人们的青睐，已经生产出含纳米银的食 品保鲜膜(袋)、盆、罐、菜板、餐具等抗菌塑料制品。
[0010] 认识和了解纳米材料的毒理学效应，不仅有助于纳米材料的广泛应用，改善人们 的生活品质，而且对维持人类身体健康也非常重要。纳米材料在体内可能会导致难以预测 的生物学反应。纳米材料与许多催化和氧化反应有关，并且可能诱导更强的细胞的毒性。
[0011] 目前，随着纳米银的商业化和工业化生产，其在食品上(例如：抗菌包装材料）的应 用越来越广泛，容易通过摄取、皮肤接触、呼吸吸入等途径进入人体，因此其对食品安全的 潜在威胁开始逐渐引起人们的重视。我国香港食物环境卫生署食物安全中心报告指出，人 体食入的纳米材料，经过肠道进入毛细血管，然后传送到肝脏或者进入淋巴系统。较小粒径 的纳米粒子可以在体内的组织和器官积聚，甚至可以被个别细胞吸收。传统的IS010993标 准所规定生物安全性评价方法，主要对试验动物急性经口毒性、皮肤刺激、眼刺激、遗传毒 性、皮肤过敏等进行常规毒理学检查。一些研究结果表明纳米银对生物体没有毒性。目前， 纳米银毒性研究方法主要有动物实验和细胞试验。
[0012] 纳米银可通过呼吸道、皮肤、消化道以及其它途径进入人体，具有潜在的毒性效 应。经口摄入的银，经过肝脏的首过效应，被排泄到胆汁中，从而降低了纳米银在生物体组 织中的系统分布。未被清除的银会沉积在肾小球基膜和肾小球膜以及肝脏的肝窦内皮细胞 和Kupffer细胞中。Tang等对小鼠进行纳米银皮下注射，结果显示，纳米银可以以粒子的形 式进入血液循环，进而分布在主要的器官中，如肾、脑、肝、脾、和肺中。在食品领域应用的小 粒径纳米银，可通过消化道，进入血液和肝脏等器官，并在其他组织和器官内蓄积，当达到 一定量后，会对人体产生肾毒性、神经毒、性肝毒性等毒性反应。
[0013] 目前有关纳米银对细胞结构和功能的影响，以及纳米银与细胞相互作用的研究很 少，可用于研究的细胞株体系主要有肺泡巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞、血管平滑肌细 胞、肾细胞、肝细胞、角化细胞以及人类癌细胞等。细胞是大多数生物体的基本单位，其变化 大体上可反映生物机体功能与结构的变化，而当机体功能与结构未发生变化时，细胞功能 与结构也可能发生改变。细胞毒理学主要是通过体外细胞技术手段研究环境中生物、化学 和物理等多种污染物对细胞的损伤效应与规律，从而获得该物质的细胞毒效应、与剂量有 关的暴露特征(如暴露时间、暴露途径、暴露频率)、毒作用机理等诸多信息。以细胞为研究 对象进行纳米颗粒生物效应研究，主要是应用体外培养的细胞株对纳米颗粒进行毒效应监 测，评价纳米颗粒对人体可能产生的危害。
[0014] 纳米银作为食品用抗菌材料，应用前景广泛。但目前纳米银的安全性问题仍存在 争议。目前纳米银的毒理学研究多为医药领域，研究对象为医用纳米银，研究方法多为动物 实验和体外细胞培养，针对食品用纳米银安全性评价的研究很少。因此，针对为了解决纳米 银在食品中应用所存在潜在安全性问题，迫切需要深入研究食品用纳米银的安全性。
[0015] 纳米材料安全性研究可以采用体内和体外两种实验方法，两者各有利弊，虽然体 外细胞实验模型不能模拟银在复杂动物体内所产生的效应，但是体外实验可以方便快捷地 评价化学试剂的毒性，不受临床实验个体差异的限制，可以为进一步深入研究化学暴露的 潜在危险打下基础。
[0016] 随着纳米技术的发展，纳米材料的生产工艺越来越发达，进一步研究不同形状、大 小纳米银的细胞毒性变化规律，结合物理化学方法，探究无毒或低毒性纳米银的生产方法。 进一步建立和完善食品用纳米材料的体外安全性评价方法，探索高校准确的毒理学筛选方 法。通过系统科学完善的纳米材料毒理学数据，使人们对纳米材料的安全性有一个全面清 晰的认识，为纳米材料的广泛应用和纳米科学的进一步发展提供条件。
【发明内容】
[0017] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于肠上皮细胞对76. 29nm的纳米银 生物安全性的评价方法。
[0018] 一种基于肠上皮细胞对76. 29nm的纳米银生物安全性的评价方法，其特征在于包 括如下步骤： 1) 细胞培养：将人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株加入含10%胎牛血清的DMEM培养基 中，在培养箱内培养，细胞生长2~3 d换1次液，取对数生长期细胞进行后续实验； 2) 细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3?4 d，细胞生长至单层809Γ95%时，弃掉上 清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0. 25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微 镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用 吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量 培养基，放入培养箱中培养3-4 d后，进行下一次传代培养； 3) 将纳米银和纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度的纳米 银、纳米氧化锌悬液，放入4 °C冰箱中备用，因为这两种纳米材料易发生团聚，使得该分散 体系不稳定，因此每次使用前，需使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚； 4) 通过Α0/ΕΒ双染法、CCK-8法进行细胞毒性分析，使用氧化应激法，通过Caco-2细胞 内ROS、SOD、GSH水平检测，来分析纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。
[0019] 所述的方法，其特征在于步骤4)中所述Α0/ΕΒ双染法包括如下步骤：将Caco-2细 胞种在6孔细胞培养板中，培养1-2天，每孔中细胞长满80%以后，分别与10 Pg/ml、25 Pg/ ml、50 Pg/ml、100 Pg/ml和200 Pg /ml的纳米银和纳米氧化锌悬液接触培养48 h,纳 米材料浓度为〇的孔为阳性对照组，加入含有吖啶橙和溴化乙锭的PBS，染色3分钟，染色 结束后用加入适量PBS洗脱1-2次，用荧光倒置显微镜检测染色结果，并拍照保存。
[0020] 所述的方法，其特征在于步骤4)中所述CCK-8法包括如下步骤：选择对数期的细 胞传代，将细胞培养在96孔细胞培养板中，每孔加入20〇μ1相同的细胞悬液，细胞培养1-2 天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入〇Μ? /ml、l〇Pg /ml、25Pg /ml、5〇Pg /ml、 10〇μ8 /ml和200 /ml的纳米银和纳米氧化锌，纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组， 每个样品有5个重复孔，与细胞接触培养24h后，分别用CCK-8试剂盒进行细胞增值测定， 在450nm波长处测定吸光度，根据吸光值计算细胞活性，通过spss数据分析软件计算细胞 半致死率和差异显著性，计算细胞存活率的公式如下：
【权利要求】
1. 一种基于肠上皮细胞对76. 29nm的纳米银生物安全性的评价方法，其特征在于包括 如下步骤： 1) 细胞培养：将人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株加入含10%胎牛血清的DMEM培养基 中，在培养箱内培养，细胞生长2~3 d换1次液，取对数生长期细胞进行后续实验； 2) 细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3~4 d，细胞生长至单层809Γ95%时，弃掉上 清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0. 25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微 镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用 吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量 培养基，放入培养箱中培养3-4 d后，进行下一次传代培养； 3) 将纳米银和纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度的纳米 银、纳米氧化锌悬液，放入4 °C冰箱中备用，因为这两种纳米材料易发生团聚，使得该分散 体系不稳定，因此每次使用前，需使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚； 4) 通过AO/EB双染法、CCK-8法进行细胞毒性分析，使用氧化应激法，通过Caco-2细胞 内ROS、SOD、GSH水平检测，来分析纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中所述A0/EB双染法包括如下步骤： 将Caco-2细胞种在6孔细胞培养板中，培养1-2天，每孔中细胞长满80%以后，分别与10 Kg/ml、25 Pg/ml、50 Pg/ml、100 Pg/ml和200 Pg /ml的纳米银和纳米氧化锌悬液接触培 养48 h，纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组，加入含有吖啶橙和溴化乙锭的PBS，染色3 分钟，染色结束后用加入适量PBS洗脱1-2次，用荧光倒置显微镜检测染色结果，并拍照保 存。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中所述CCK-8法包括如下步骤：选择 对数期的细胞传代，将细胞培养在96孔细胞培养板中，每孔加入20〇μ1相同的细胞悬液，细 胞培养1-2天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入〇μ 8 /mlUOPg /ml、25Pg /ml、 5(^g /mlUOOPg /ml和200 Pg /ml的纳米银和纳米氧化锌，纳米材料浓度为0的孔为阳 性对照组，每个样品有5个重复孔，与细胞接触培养24h后，分别用CCK-8试剂盒进行细胞 增值测定，在450nm波长处测定吸光度，根据吸光值计算细胞活性，通过spss数据分析软件 计算细胞半致死率和差异显著性，计算细胞存活率的公式如下：
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中细胞内R0S水平检测方法包括如 下步骤：选择对数期的细胞进行传代培养，将所得的细胞悬液加在96孔板中，每孔加入200 μ?相同的细胞悬液，使用96孔板时弃用周围一圈，在外围一圈加无菌水或PBS，并将96孔 板置于靠近水源的地方，以减小水分蒸发造成的误差，细胞培养1-2天，当细胞量达到大约 10000 个 / 孔时，分别加入 10 Pg/ml、25 Pg/ml、50 Pg/ml、75 Pg/ml 和 100 Pg /ml 的纳 米银和纳米氧化锌，另设置两组阴性对照组，第一组阴性对照组在细胞培养孔中只加入细 胞培养基，第二组阴性对照组在空白孔中只加入细胞培养基，每个样品有4个重复孔，与细 胞接触培养24 h后，用R0S试剂盒检测活性氧水平，按照1:1000用无血清培养基培养液 稀释DCFH-DA，使终浓度为10Mm〇l/ml，取出96孔板中细胞培养液，加入100 μ?稀释好的 DCFH-DA，使其盖住细胞，在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不加入Rosup， 在37°C细胞培养箱内孵育20分钟，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分除去未进入 细胞DCFH-DA，使用485nm的激发波长和525nm的发射波长，在酶标仪中检测荧光的强弱。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中细胞内SOD和GSH水平检测方法包 括如下步骤： 选取对数期生长状态良好的细胞进行传代，将相同浓度的细胞悬液加入25 cm2的细 胞培养瓶中，培养2-3天，细胞长满培养瓶细胞生长面的80%后，小心吸出细胞培养液，分别 加入5ml的0，10，25，50，75，lOOPg/ml的纳米银和纳米氧化锌，其中〇Pg/ml为阳性对 照组，接触培养24h后，取出细胞，制成细胞悬液，加入PBS混匀后，在4° C条件下4000 rpm离心4分钟，弃掉90%的上清液，再次加入PBS制成细胞悬液，重复离心步骤，弃掉大部 分上清液，保留2ml上清液和细胞沉淀，在超声波细胞粉碎仪中进行超声，获得的悬液用于 氧化应激法的进一步检测； 采用考马斯亮兰法测定蛋白含量，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定595nm的 吸光度，按以下公式计算蛋白含量：
采用超氧化物歧化酶测定试剂盒检测，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定450nm 的0D值，按以下公式计算SOD活性：
采用谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒检测，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定 405nm的0D值，按以下公式计算GSH含量：
使用SPSS 16.0软件对实验结果进行统计分析，对数据进行单因素方差分析，计算p〈 0.05和p〈 0.01的差异显著性。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)和步骤2)中培养箱内的培养条件为 37。。、5% C02。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中的超声条件为3 min，超3 s停2 s，功率 300 w。
8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于加入300 μ?含有100 Pg /ml吖啶橙和100 Kg /ml溴化乙锭的PBS。
9. 如权利要求5所述的方法，其特征在于在超声波细胞粉碎仪中进行超声2分05秒， 超声条件为300w、超5s停10s。
【文档编号】C12Q1/02GK104195210SQ201410247787
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】关荣发, 王彦波, 吕飞, 刘明启, 伍义行, 宋益娟 申请人:中国计量学院
【专利摘要】本发明基于肠上皮细胞对76nm的纳米银生物安全性的评价方法选取人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株作为研究对象，采用细胞毒性较强的纳米氧化锌（90.81nm）为阳性对照，不加入纳米材料的正常细胞为空白对照，通过AO/EB双染法、CCK-8法初步探究究纳米材料的细胞毒性。使用氧化应激的方法，通过检测Caco-2细胞内ROS、SOD、GSH释放量的影响，来探讨纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。结果表明76.29nm的银粒子（<200μg/ml）对Caco-2细胞的活性没有明显影响，对Caco-2细胞没有氧化应激损伤,但是使细胞的抗氧化力增强，在纳米银浓度为50μg/ml，细胞抗氧化能力达到最高水平。
【专利说明】基于肠上皮细胞对76nm的纳米银生物安全性的评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全领域，具体是一种基于肠上皮细胞对76. 29nm的纳米银生物 安全性的评价方法。
【背景技术】
[0002] 纳米银的抗菌性比常规银更强，微量纳米银可以产生很强的杀菌效应。纳米银凭 借优异的抗菌性，在食品产业的应用越来越广泛，成为近年来研究的热点之一。但是，应用 于食品领域的纳米银粒子能发生迁移，通过消化道侵入人体，并可能在深部蓄积。因此，纳 米银的食品安全问题值得引起关注。
[0003] 近年来，商品化纳米材料主要集中在银、碳、氧化锌、硅、二氧化钛和金等材料上， 其中大部分纳米商品涉及金属银，占所有纳米材料制品的50%以上，呈现出逐年递增的趋 势。
[0004] 纳米技术使银的杀菌能力产生了质的飞跃，纳米银在很短的时间内，可以杀死650 多种细菌，并且对细菌、霉菌及有害孢子的生长也会起到有效的抑制作用。Choi等研究了纳 米银、银离子、氯化银胶体三种含银产品的抗菌性强度，得到了纳米银抗菌性最强的研究结 果。
[0005] 近年来，科研工作者，对纳米银的抗菌原理进行了系统的探究，通过研究纳米银在 形态、结构、生理变化方面对微生物的影响，初步了解其抗菌规律，进一步从蛋白质和转录 水平上研究其抗菌性，最终得到了纳米银抗菌的毒性机制。当纳米银与细菌接触时，会依 附在细胞膜表面，通过与细胞外膜上蛋白、多糖等屏障物质的作用，破坏细胞膜的结构和功 能，使细胞膜的电势和渗透性发丝变化，纳米银进入细胞后，造成了 ATP大量水解。另外，纳 米银在遇到含水的环境时，可以释放银离子进入细胞内，诱导其产生活性氧自由基，最终导 致细胞氧化应激和细胞膜损伤，引发细胞凋亡和坏死。
[0006] 食品及食品相关产品通过纳米添加剂来提高产品的加工性能、稳定性和功效性。 纳米材料可以用于食品添加剂、食品包装等食品相关产品抗菌性能的优化。根据2011年伍 德罗·威尔逊对纳米技术消费产品的统计，在消费类产品中银纳米粒子是最常用的纳米级 别添加剂。
[0007] 银离子抗菌剂不仅抗菌性好、不易产生抗药性，而且安全性高。银离子具有高反映 活性，容易与一系列带负电荷的分子结合，包括无机阴离子、DNA分子、RNA分子和蛋白质。 Shahverdi A R等的研究表明，纳米银在浓度低于2Pg/ml时也能表现出抗菌性，并且，其对 真菌和病毒也有杀伤力。Sun R W Y等发现纳米银能够有效抑制细胞内病毒复制，减少与 HIV相关的细胞凋亡。
[0008] 目前，食品用纳米银已成为国内外研究的热点。纳米包装材料与传统的聚乙烯包 装材料相比，具有较高的机械性能优良的理化性能加工性能以及较好的生态安全性。添 加纳米银的包装材料在延长食品货架期上具有潜在应用。何强等发现，在保鲜包装材料中 的纳米银能减少乙烯含量，提高保鲜效果。杨燕婷等发现，纳米材料能显著保持金针菇在贮 藏过程中的感官品质和营养成分，可维持较低的膜透性和氧化程度，延缓金针菇的劣变。苏 晶等利用新型纳米材料包装对柿果货架品质进行了研究，结果表明纳米材料能有效起到果 蔬保鲜作用。Fernandez A等研究了新开发的纤维素一银（cellulose - silver)纳米 粒混合材料在Piel de Sapo加工贮藏期间的抗菌活性，发现纤维素一银纳米复合材料被瓜 汁浸渍时，释放出的银离子对于控制腐败微生物作用明显，微生物的滞后期被延长。此外， 银的存在可延迟有切口瓜的衰老。
[0009] 纳米材料可用于饮用水消毒，有研究报道，研制出了可以用于饮用水消毒的载银 活性碳纤维。今年来，含纳米银的抗菌塑料逐渐受到人们的青睐，已经生产出含纳米银的食 品保鲜膜(袋)、盆、罐、菜板、餐具等抗菌塑料制品。
[0010] 认识和了解纳米材料的毒理学效应，不仅有助于纳米材料的广泛应用，改善人们 的生活品质，而且对维持人类身体健康也非常重要。纳米材料在体内可能会导致难以预测 的生物学反应。纳米材料与许多催化和氧化反应有关，并且可能诱导更强的细胞的毒性。
[0011] 目前，随着纳米银的商业化和工业化生产，其在食品上(例如：抗菌包装材料）的应 用越来越广泛，容易通过摄取、皮肤接触、呼吸吸入等途径进入人体，因此其对食品安全的 潜在威胁开始逐渐引起人们的重视。我国香港食物环境卫生署食物安全中心报告指出，人 体食入的纳米材料，经过肠道进入毛细血管，然后传送到肝脏或者进入淋巴系统。较小粒径 的纳米粒子可以在体内的组织和器官积聚，甚至可以被个别细胞吸收。传统的IS010993标 准所规定生物安全性评价方法，主要对试验动物急性经口毒性、皮肤刺激、眼刺激、遗传毒 性、皮肤过敏等进行常规毒理学检查。一些研究结果表明纳米银对生物体没有毒性。目前， 纳米银毒性研究方法主要有动物实验和细胞试验。
[0012] 纳米银可通过呼吸道、皮肤、消化道以及其它途径进入人体，具有潜在的毒性效 应。经口摄入的银，经过肝脏的首过效应，被排泄到胆汁中，从而降低了纳米银在生物体组 织中的系统分布。未被清除的银会沉积在肾小球基膜和肾小球膜以及肝脏的肝窦内皮细胞 和Kupffer细胞中。Tang等对小鼠进行纳米银皮下注射，结果显示，纳米银可以以粒子的形 式进入血液循环，进而分布在主要的器官中，如肾、脑、肝、脾、和肺中。在食品领域应用的小 粒径纳米银，可通过消化道，进入血液和肝脏等器官，并在其他组织和器官内蓄积，当达到 一定量后，会对人体产生肾毒性、神经毒、性肝毒性等毒性反应。
[0013] 目前有关纳米银对细胞结构和功能的影响，以及纳米银与细胞相互作用的研究很 少，可用于研究的细胞株体系主要有肺泡巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞、血管平滑肌细 胞、肾细胞、肝细胞、角化细胞以及人类癌细胞等。细胞是大多数生物体的基本单位，其变化 大体上可反映生物机体功能与结构的变化，而当机体功能与结构未发生变化时，细胞功能 与结构也可能发生改变。细胞毒理学主要是通过体外细胞技术手段研究环境中生物、化学 和物理等多种污染物对细胞的损伤效应与规律，从而获得该物质的细胞毒效应、与剂量有 关的暴露特征(如暴露时间、暴露途径、暴露频率)、毒作用机理等诸多信息。以细胞为研究 对象进行纳米颗粒生物效应研究，主要是应用体外培养的细胞株对纳米颗粒进行毒效应监 测，评价纳米颗粒对人体可能产生的危害。
[0014] 纳米银作为食品用抗菌材料，应用前景广泛。但目前纳米银的安全性问题仍存在 争议。目前纳米银的毒理学研究多为医药领域，研究对象为医用纳米银，研究方法多为动物 实验和体外细胞培养，针对食品用纳米银安全性评价的研究很少。因此，针对为了解决纳米 银在食品中应用所存在潜在安全性问题，迫切需要深入研究食品用纳米银的安全性。
[0015] 纳米材料安全性研究可以采用体内和体外两种实验方法，两者各有利弊，虽然体 外细胞实验模型不能模拟银在复杂动物体内所产生的效应，但是体外实验可以方便快捷地 评价化学试剂的毒性，不受临床实验个体差异的限制，可以为进一步深入研究化学暴露的 潜在危险打下基础。
[0016] 随着纳米技术的发展，纳米材料的生产工艺越来越发达，进一步研究不同形状、大 小纳米银的细胞毒性变化规律，结合物理化学方法，探究无毒或低毒性纳米银的生产方法。 进一步建立和完善食品用纳米材料的体外安全性评价方法，探索高校准确的毒理学筛选方 法。通过系统科学完善的纳米材料毒理学数据，使人们对纳米材料的安全性有一个全面清 晰的认识，为纳米材料的广泛应用和纳米科学的进一步发展提供条件。
【发明内容】
[0017] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于肠上皮细胞对76. 29nm的纳米银 生物安全性的评价方法。
[0018] 一种基于肠上皮细胞对76. 29nm的纳米银生物安全性的评价方法，其特征在于包 括如下步骤： 1) 细胞培养：将人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株加入含10%胎牛血清的DMEM培养基 中，在培养箱内培养，细胞生长2~3 d换1次液，取对数生长期细胞进行后续实验； 2) 细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3?4 d，细胞生长至单层809Γ95%时，弃掉上 清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0. 25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微 镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用 吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量 培养基，放入培养箱中培养3-4 d后，进行下一次传代培养； 3) 将纳米银和纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度的纳米 银、纳米氧化锌悬液，放入4 °C冰箱中备用，因为这两种纳米材料易发生团聚，使得该分散 体系不稳定，因此每次使用前，需使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚； 4) 通过Α0/ΕΒ双染法、CCK-8法进行细胞毒性分析，使用氧化应激法，通过Caco-2细胞 内ROS、SOD、GSH水平检测，来分析纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。
[0019] 所述的方法，其特征在于步骤4)中所述Α0/ΕΒ双染法包括如下步骤：将Caco-2细 胞种在6孔细胞培养板中，培养1-2天，每孔中细胞长满80%以后，分别与10 Pg/ml、25 Pg/ ml、50 Pg/ml、100 Pg/ml和200 Pg /ml的纳米银和纳米氧化锌悬液接触培养48 h,纳 米材料浓度为〇的孔为阳性对照组，加入含有吖啶橙和溴化乙锭的PBS，染色3分钟，染色 结束后用加入适量PBS洗脱1-2次，用荧光倒置显微镜检测染色结果，并拍照保存。
[0020] 所述的方法，其特征在于步骤4)中所述CCK-8法包括如下步骤：选择对数期的细 胞传代，将细胞培养在96孔细胞培养板中，每孔加入20〇μ1相同的细胞悬液，细胞培养1-2 天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入〇Μ? /ml、l〇Pg /ml、25Pg /ml、5〇Pg /ml、 10〇μ8 /ml和200 /ml的纳米银和纳米氧化锌，纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组， 每个样品有5个重复孔，与细胞接触培养24h后，分别用CCK-8试剂盒进行细胞增值测定， 在450nm波长处测定吸光度，根据吸光值计算细胞活性，通过spss数据分析软件计算细胞 半致死率和差异显著性，计算细胞存活率的公式如下：
【权利要求】
1. 一种基于肠上皮细胞对76. 29nm的纳米银生物安全性的评价方法，其特征在于包括 如下步骤： 1) 细胞培养：将人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株加入含10%胎牛血清的DMEM培养基 中，在培养箱内培养，细胞生长2~3 d换1次液，取对数生长期细胞进行后续实验； 2) 细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3~4 d，细胞生长至单层809Γ95%时，弃掉上 清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0. 25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微 镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用 吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量 培养基，放入培养箱中培养3-4 d后，进行下一次传代培养； 3) 将纳米银和纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度的纳米 银、纳米氧化锌悬液，放入4 °C冰箱中备用，因为这两种纳米材料易发生团聚，使得该分散 体系不稳定，因此每次使用前，需使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚； 4) 通过AO/EB双染法、CCK-8法进行细胞毒性分析，使用氧化应激法，通过Caco-2细胞 内ROS、SOD、GSH水平检测，来分析纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中所述A0/EB双染法包括如下步骤： 将Caco-2细胞种在6孔细胞培养板中，培养1-2天，每孔中细胞长满80%以后，分别与10 Kg/ml、25 Pg/ml、50 Pg/ml、100 Pg/ml和200 Pg /ml的纳米银和纳米氧化锌悬液接触培 养48 h，纳米材料浓度为0的孔为阳性对照组，加入含有吖啶橙和溴化乙锭的PBS，染色3 分钟，染色结束后用加入适量PBS洗脱1-2次，用荧光倒置显微镜检测染色结果，并拍照保 存。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中所述CCK-8法包括如下步骤：选择 对数期的细胞传代，将细胞培养在96孔细胞培养板中，每孔加入20〇μ1相同的细胞悬液，细 胞培养1-2天，当细胞量达到大约10000个/孔时，分别加入〇μ 8 /mlUOPg /ml、25Pg /ml、 5(^g /mlUOOPg /ml和200 Pg /ml的纳米银和纳米氧化锌，纳米材料浓度为0的孔为阳 性对照组，每个样品有5个重复孔，与细胞接触培养24h后，分别用CCK-8试剂盒进行细胞 增值测定，在450nm波长处测定吸光度，根据吸光值计算细胞活性，通过spss数据分析软件 计算细胞半致死率和差异显著性，计算细胞存活率的公式如下：
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中细胞内R0S水平检测方法包括如 下步骤：选择对数期的细胞进行传代培养，将所得的细胞悬液加在96孔板中，每孔加入200 μ?相同的细胞悬液，使用96孔板时弃用周围一圈，在外围一圈加无菌水或PBS，并将96孔 板置于靠近水源的地方，以减小水分蒸发造成的误差，细胞培养1-2天，当细胞量达到大约 10000 个 / 孔时，分别加入 10 Pg/ml、25 Pg/ml、50 Pg/ml、75 Pg/ml 和 100 Pg /ml 的纳 米银和纳米氧化锌，另设置两组阴性对照组，第一组阴性对照组在细胞培养孔中只加入细 胞培养基，第二组阴性对照组在空白孔中只加入细胞培养基，每个样品有4个重复孔，与细 胞接触培养24 h后，用R0S试剂盒检测活性氧水平，按照1:1000用无血清培养基培养液 稀释DCFH-DA，使终浓度为10Mm〇l/ml，取出96孔板中细胞培养液，加入100 μ?稀释好的 DCFH-DA，使其盖住细胞，在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不加入Rosup， 在37°C细胞培养箱内孵育20分钟，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分除去未进入 细胞DCFH-DA，使用485nm的激发波长和525nm的发射波长，在酶标仪中检测荧光的强弱。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中细胞内SOD和GSH水平检测方法包 括如下步骤： 选取对数期生长状态良好的细胞进行传代，将相同浓度的细胞悬液加入25 cm2的细 胞培养瓶中，培养2-3天，细胞长满培养瓶细胞生长面的80%后，小心吸出细胞培养液，分别 加入5ml的0，10，25，50，75，lOOPg/ml的纳米银和纳米氧化锌，其中〇Pg/ml为阳性对 照组，接触培养24h后，取出细胞，制成细胞悬液，加入PBS混匀后，在4° C条件下4000 rpm离心4分钟，弃掉90%的上清液，再次加入PBS制成细胞悬液，重复离心步骤，弃掉大部 分上清液，保留2ml上清液和细胞沉淀，在超声波细胞粉碎仪中进行超声，获得的悬液用于 氧化应激法的进一步检测； 采用考马斯亮兰法测定蛋白含量，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定595nm的 吸光度，按以下公式计算蛋白含量：
采用超氧化物歧化酶测定试剂盒检测，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定450nm 的0D值，按以下公式计算SOD活性：
采用谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒检测，按试剂盒说明书具体步骤进行操作，测定 405nm的0D值，按以下公式计算GSH含量：
使用SPSS 16.0软件对实验结果进行统计分析，对数据进行单因素方差分析，计算p〈 0.05和p〈 0.01的差异显著性。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)和步骤2)中培养箱内的培养条件为 37。。、5% C02。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中的超声条件为3 min，超3 s停2 s，功率 300 w。
8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于加入300 μ?含有100 Pg /ml吖啶橙和100 Kg /ml溴化乙锭的PBS。
9. 如权利要求5所述的方法，其特征在于在超声波细胞粉碎仪中进行超声2分05秒， 超声条件为300w、超5s停10s。
【文档编号】C12Q1/02GK104195210SQ201410247787
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】关荣发, 王彦波, 吕飞, 刘明启, 伍义行, 宋益娟 申请人:中国计量学院
最新回复(0)