一株石油烃降解菌dlfj3-3及其应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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一株石油烃降解菌dlfj3-3及其应用的制作方法
【专利摘要】一株石油烃降解菌DLFJ3-3及其应用,涉及环境石油污染生物处理。所述石油烃降解菌(Citreicella?sp.)DLFJ3-3,登记入册编号为CGMCC?No.9014。所述石油烃降解菌(Citreicella?sp.)DLFJ3-3可在降解石油烃类化合物中应用。所述石油烃类化合物包括但不限于柴油、液态烷烃等烃类化合物。该菌含有与石油烃降解相关的基因,这些基因在该菌降解石油时发挥重要作用。所述石油烃降解菌(Citreicella?sp.)DLFJ3-3能利用石油∶柴油=1∶1作为能源和碳源生长繁殖,该菌6天能将无机盐培养基中的5g/L的石油∶柴油=1∶1降解65.17%。
【专利说明】—株石油轻降解菌DLFJ3-3及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境石油污染生物处理,尤其是涉及一株石油烃降解菌DLFJ3-3及其应用。
【背景技术】
[0002]当前,海洋的污染正在日趋加剧,其中海洋的石油污染尤为严重(HeadI M,Jones D M,F.Rff.Marine microorganisms make a meal of oil.[J].Nat RevMicrobiol.2006, 4:173-182.)。目前,世界所需石油的2/3经海路运输,经常运行在航道上的油轮大约有7000艘之多(李德生,罗群.石油一人类文明社会的血液[M]:清华大学出版社,2002.)。大型油轮失事以后,其中的原油部分或全部流入海洋中,从而造成严重的海洋石油污染。石油污染给海洋环境和海洋生态系统带来了严重的危害,直接或间接的影响着人类的生存和可持续发展(龙绍桥.海上溢油行为与归宿数值模拟及其对环境的影响研究[D]:中国海洋大学;2006.)。其主要表现在以下几个方面:1)影响海气系统间物质和能量的交换。2)破坏海洋生态系统。3)制约人类社会和环境的可持续发展。
[0003]目前,常用的海洋石油污染的治理方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。与化学、物理方法相比,生物修复对人和环境造成的影响小,且修复费用仅为传统物理、化学修复的30 %~50 % (Bragg JR, Prince RC, Harner EJ etal.Effectiveness of Bioremediation for the Exxon-Valdez Oi1-Spi 11 [J].Nature.1994,368(6470):413-418.)。生物修复以其投入小,无二次污染的优势被视为最有前途的环境治理手段(Juhasz AL, Naidu R.Bioremediation of high molecular weightpolycyclic aromatic hydrocarbons:a review of the microbial degradation of benzo [a]pyrene [J].1nternational Biodeterioration&Biodegradation.2000, 45(1): 57-88.)。在海洋环境中生活着各种各样的石油烃降解菌,海洋石油烃降解菌早在一个世纪前就已经被分离到。目前,大概有79个细菌属、9个蓝细菌属、103个真菌属以及12个蓝藻属能利用烃类物质作为唯一的碳源和能源。在这些种类繁多的烃类降解细菌中,大概只有1/4(19个属)的细菌类降解者是海洋专属的烃类降解者(Head IM, Jones DM, Roling WF.Marinemicroorganisms make a meal of oil [J].Nat Rev Microbiol.2006, 4 (3): 173-182.)。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一株石油烃降解菌(Citreicella sp.)DLFJ3_3。
[0005]本发明的另一个目的是提供一株石油烃降解菌(Citreicella sp.)DLFJ3_3在降解石油烃类化合物中的应用。
[0006] 所述石油烃降解菌(Citreicella sp.)DLFJ3_3,已于2014年04月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101,登记入册编号为CGMCC N0.9014。该菌来源于大连新港溢油事件发生地的表层海水,经人工富集培养、分离纯化得到。该菌是革兰氏染色阴性的柠檬胞菌属(Citreicella sp.)的菌株DLFJ3-3,生物学特性为触酶阴性,氧化酶阳性,非发酵型,专性需氧,菌体形态为无芽孢杆菌,菌落圆形、乳白色不透明、表面光滑湿润、边缘规则,无晕环,中央凸起,直径5~6_。通过对该菌基因组的测序,发现该菌含有很多与石油烃降解相关的基因。该菌的最适生长条件为:pH = 6.5~8.5,温度25~28°C。
[0007]所述石油烃降解菌(Citreicella sp.)DLFJ3_3可在降解石油烃类化合物中应用。所述石油烃类化合物包括但不限于柴油、液态烷烃等烃类化合物。
[0008]对所述石油烃降解菌(Citreicella sp.)DLFJ3_3进行基因组测序发现,该菌含有与石油烃降解相关的基因,这些基因在该菌降解石油时发挥重要作用。
[0009]实验证明,所述石油烃降解菌(Citreicella sp.)DLFJ3_3能够利用石油:柴油=I: I作为能源和碳源生长繁殖,该菌6天能将无机盐培养基中的5g/L的石油:柴油=I: 1(体积比)降解65.17%。
【专利附图】

【附图说明】
[0010]图1为DLFJ3-3在石油:柴油=I: 1、柴油以及液态烷烃中的降解图。在图1中,标记a为原油:柴油,b为柴油,c为液态烧烃。
【具体实施方式】
[0011]实例一:Citreicella sp.DLFJ3-3 的分离与鉴定
[0012]现场采集大连新港溢油地区表层海水,采用海水培养基加入I %石油:柴油=I: I在28°C 180r/min条件下进行富集培养。一周后,在固体培养基(M2)中稀释涂布平板,得到多株纯菌,纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解石油烃的能力,最后得到一株石油烃的高效降解菌DLFJ3-3,该菌经16S rDNA鉴定为柠檬胞菌属(Citreicella sp.);选取其中相似序列,用MEGA5.0计算出序列的系统进化距离,构建系统进化树。进化树显示,与其相似度最高的菌株都为Citreicella sp.菌株。结合菌株的16S rDNA的测定结果,将其归属于朽1檬胞菌属(Citreicella sp.)。固体培养基(M2)的成分:乙酸钠5g/L,柠檬酸钠0.05g/L,普通肉汤培养基0.5g/L,蛋白胨0.lg/L,酵母粉0.lg/L,苹果酸0.05g/L,葡萄糖lg/L,鹿糖0.5g/L,硝酸铵lg/L,氯化铵0.2g/L,酒石酸钠0.05g/L,可溶性淀粉0.5g/L,琼脂粉15g/L,加海水至1L,调pH7.5,115°C高压蒸汽灭菌30min后补加I %体积已灭菌的KH2PO4 溶液(10g/L, ρΗ6.7)及 0.1%体积 0.22 μ m 滤膜除菌的 FeSO4 (0.4g/L)。
[0013]实例二:Citreicella sp.DLFJ3-3降解石油烃的性能
[0014]将Citreicella sp.DLFJ3-3接种至含I %石油:柴油=I: I的人工海水培养基(MMC)中,在180r/min、28°C摇床中避光培养,每隔一天分别取样利用重量法测定培养液中石油烃的降解率,实验结果见图1。由图1可以看出Citreicella sp.DLFJ3-3在第3~5天之间对于石油:柴油=I: I的降解较快,且该菌在7天内对于1%石油:柴油=I: I的降解率达到了 65.17 %。人工海水培养基(MMC):NaC124g/L, MgSO4.7H207g/L, NH4NO3Ig/L,KC10.7g/L, KH2P042g/L,Na2HP043g/L, pH7.4。灭菌后补加适量微量元素混合液,微量元素经0.22 μ M滤膜过滤除菌。MMC微量元素混合液=CaCl2, 2mg/L ;FeCl3.6H20, 50mg/L ;CuSO4, 0.5mg/L ;MnCl2.4H20, 0.5mg/L ;ZnSO4.7H20, 10mg/L。
[0015]实例三:Citreicella sp.DLFJ3-3的底物降解实验[0016]将Citreicella sp.DLFJ3-3接种至不同碳源(液态烷烃、固态烷烃、PAH以及柴油)的海水培养基中,同时设置底空白对照(只加底物不加菌),在180r/min、28°C摇床中避光培养,每隔一天(PAH每隔两天取一次样)分别取样利用重量法测定培养液中底物的降解率,其中Citreicella sp.DLFJ3-3在PAH以及固态烷烃中不降解PAH和固态烷烃,Citreicella sp.DLFJ3-3对于柴油以及液态烷烃的降解实验结果见图1。
[0017]实例四Citreicella sp.DLFJ3-3相关石油烃降解基因的应用
[0018]将Citreicella sp.DLFJ3-3 进行基因组测序;
[0019]表1 DLFJ3-3基因组中与烷烃降解相关的基因
【权利要求】
1.一株石油烃降解菌(Citreicella sp.)DLFJ3-3,已于2014年04月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,登记入册编号为CGMCC N0.9014。
2.如权利要求1所述一株石油烃降解菌(Citreicellasp.)DLFJ3_3在降解石油烃类化合物中的应用。
3.如权利要求2所述应用,其特征在于所述石油烃类化合物包括但不限于柴油、液态烷烃。
4.如权利要求1所述一株石油烃降解菌(Citreicellasp.)DLFJ3-3,其特征在于其具有与烷烃降解相关的单加氧酶、P450基因; 表1 DLFJ3-3基因组中与烷烃降解相关的基因
5.如权利要求4所述一株石油径降解菌(Citreicellasp.)DLFJ3-3,其特征在于所述基因在石油烃污染环境监测和生物修复中应用。
【文档编号】C12R1/01GK104004683SQ201410247867
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】邵宗泽, 王万鹏, 张荣秋 申请人:国家海洋局第三海洋研究所

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