一株石油烃降解菌dl5-3及其应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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一株石油烃降解菌dl5-3及其应用的制作方法
【专利摘要】一株石油烃降解菌DL5-3及其应用,涉及环境石油污染生物处理。所述石油烃降解菌(Winogradskyella?sp.)DL5-3,登记入册编号为CGMCC?No.9012。所述石油烃降解菌(Winogradskyella?sp.)DL5-3,在有石油类污染物存在的情况下,能够高效地降解石油烃污染物中的烷烃组分。以柴油、液态烷烃等烃类化合物为碳源和能源进行生长,用于含油废水、受石油类污染的水体和土壤的生物强化处理与修复。经实验证明,该菌能够利用石油∶柴油=1∶1作为能源和碳源生长繁殖,该菌6天能将无机盐培养基中的5g/L的石油∶柴油(体积比)=1∶1降解52.24%。
【专利说明】—株石油烃降解菌DL5-3及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境石油污染生物处理,尤其是涉及一株石油烃降解菌DL5-3及其应用。
【背景技术】
[0002]当前,海洋的污染正在日趋加剧,其中海洋的石油污染尤为严重(HeadI Mj Jones D Mj F.RW.Marine microorganisms make a meal of oil.Nat RevMicrobiol.2006, 4:173-182.)。目前,世界所需石油的2/3经海路运输,经常运行在航道上的油轮大约有7000艘之多(李德生,罗群.石油一人类文明社会的血液[M]:清华大学出版社,2002.)。大型油轮失事以后,其中的原油部分或全部流入海洋中,从而造成严重的海洋石油污染。石油污染给海洋环境和海洋生态系统带来了严重的危害,直接或间接的影响着人类的生存和可持续发展(龙绍桥.海上溢油行为与归宿数值模拟及其对环境的影响研究[D]:中国海洋大学;2006.)。其主要表现在以下几个方面:1)影响海气系统间物质和能量的交换。2)破坏海洋生态系统。3)制约人类社会和环境的可持续发展。
[0003]目前,常用的海洋石油污染的治理方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。与化学、物理方法相比,生物修复对人和环境造成的影响小,且修复费用仅为传统物理、化学修复的 30 % ~50 % (Bragg JR, Prince RC, Harner EJ et al.Effectiveness ofBioremediation for the Exxon-Valdez Oil-Spill.Nature.1994, 368(6470):413-418.)。生物修复以其投入小,无二次污染的优势被视为最有前途的环境治理手段(HeadIMj SwannelI RP.Bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminants inmarine habitats.CurrOpinBiotechnol.1999,10(3):234-239 ;Juhasz AL,NaiduR.Bioremediation of highmolecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: areview of the microbial degradation of benzo[a]pyrene.1nternational Biodeterioration&Biodegradation.2000,45(I):57-88.)。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一株石油烃降解菌(Winogradskyella sp.)DL5_3。
[0005]本发明的另一个目的是提供石油烃降解菌(Winogradskyella sp.)DL5_3在处理石油类污染物中的应用。[0006]所述石油经降解菌(Winogradskyella sp.)DL5-3已于2014年04月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101,登记入册编号为=CGMCC N0.9012。所述石油烃降解菌(Winogradskyella sp.)DL5_3来源于大连新港溢油事件发生地的表层海水,经人工富集培养、分离纯化得到。该菌是革兰氏染色阴性的维诺格拉斯基氏菌属(Winogradskyella sp.)的菌株DL5-3,生物学特性为非发酵型,专性需氧,菌体形态为无芽孢杆菌,菌落呈圆形,橙黄色不透明,表面光滑湿润,边缘规则,无晕环,中央凸起,直径1_。该菌的最适生长条件为:pH = 7.0~8.5,温度25~28°C。
[0007] 所述石油烃降解菌(Winogradskyella sp.)DL5_3,在有石油类污染物存在的情况下,能够高效地降解石油烃污染物中的烷烃组分。
[0008]所述石油烃降解菌(Winogradskyella sp.)DL5_3,以柴油、液态烧烃等烃类化合物为碳源和能源进行生长,用于含油废水、受石油类污染的水体和土壤的生物强化处理与修复。
[0009]经实验证明,该菌能够利用石油:柴油=I: I作为能源和碳源生长繁殖,该菌6天能将无机盐培养基中的5g/L的石油:柴油(体积比)=1:1降解52.24%。
【专利附图】

【附图说明】
[0010]图1为DL5-3在原油:柴油=I: 1、柴油和液态烷烃中的的降解图。在图1中,标记a为原油:柴油,b为柴油,c为液态烧烃。
【具体实施方式】
[0011]实例一:Winogradskyella sp.DL5-3 的分离与鉴定
[0012]现场采集大连新港溢油地区表层海水,采用海水培养基加入I %石油:柴油=I: I在28°C 180r/min条件下进行富集培养。一周后,在固体培养基(M2)中稀释涂布平板,得到多株纯菌,纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解石油烃的能力,最后得到一株石油烃的高效降解菌DL5-3,该菌经16S rDNA鉴定为维诺格拉斯基氏菌属(Winogradskyellasp.);选取其中相似序列,用MEGA5.0计算出序列的系统进化距离,构建系统进化树。进化树显示,与其相似度最高的菌株都为Winogradskyella sp.菌株。结合菌株的16S rDNA的测定结果,将其归属于维诺格拉斯基氏菌属(Winogradskyella sp.)。固体培养基(M2)的成分:乙酸钠5g/L,柠檬酸钠0.05g/L,普通肉汤培养基0.5g/L,蛋白胨0.lg/L,酵母粉
0.lg/L,苹果酸0.05g/L,葡萄糖lg/L,蔗糖0.5g/L,硝酸铵lg/L,氯化铵0.2g/L,酒石酸钠
0.05g/L,可溶性淀粉0.5g/L,琼脂粉15g/L,加海水至1L,调pH7.5,115 °C高压蒸汽灭菌30min后补加I %体积已灭菌的KH2P04溶液(10g/L, ρΗ6.7)及0.1 %体积0.22 μ m滤膜除菌的 FeSO4 (0.4g/L)。
[0013]实例二:Winogradskyella sp.DL5-3 降解石油烃的性能
[0014]将维诺格拉斯基氏菌属(Winogradskyella sp.)的菌株DL5-3接种至含1%石油:柴油=I: I的人工海水培养基(MMC)中,在180r/min、28°C摇床中避光培养,每隔一天分别取样利用重量法测定培养液中石油烃的降解率,实验结果见图1。由图1可以看出Winogradskyella sp.DL5-3在第3~5天之间对于石油:柴油=1:1的降解较快。该菌在第7天时对石油:柴油=I: I的降解率为52.24%。人工海水培养基(MMC):NaC124g/L,MgSO4.7H207g/L,NH4NO3lg/L, KC10.7g/L,KH2P042g/L,Na2HP043g/L,pH7.4。灭菌后补加适量微量元素混合液,微量元素经0.22 μ M滤膜过滤除菌。MMC微量元素混合液:CaCl2, 2mg/L ;FeCl3.6H20, 50mg/L ;CuSO4, 0.5mg/L ;MnCl2.4H20, 0.5mg/L ;ZnSO4.7H20, 10mg/L。
[0015]实例三:Winogradskyellasp.DL5-3 的底物降解
[0016]将维诺格拉斯基氏菌属(Winogradskyella sp.)的菌株DL5-3接种至不同碳源(液态烷烃、固态烷烃、PAH以及柴油)的海水培养基中,同时设置底空白对照(只加底物不加菌),在180r/min、28°C摇床中避光培养,每隔一天分别取样利用重量法测定培养液中底物(PAH每隔两天取一次样)的降解率,其中Winogradskyella Sp.DL5-3在PAH以及固态烷烃中不降解PAH和固态烧烃,Winogradskyella sp.DL5-3对于柴油以及液态烧烃的降解实验结果见图1。结果表明该菌株在柴油和液态烷烃中均能生长,其中在柴油中生长良好,但是其在固态烷烃和PAH中不生长。
【权利要求】
1.一株石油经降解菌(Winogradskyella sp.) DL5-3,已于2014年04月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,登记入册编号为CGMCC N0.9012。
2.如权利要求1所述石油烃降解菌(Winogradskyellasp.)DL5-3,在有石油类污染物存在的情况下,在降解石油烃污染物中的烷烃组分的应用。
3.如权利要求1所述石油烃降解菌(Winogradskyellasp.)DL5-3,在含油废水、受石油类污染的水体和土壤的生物强化处理与修复中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK103992976SQ201410247880
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】邵宗泽, 王万鹏, 单大鹏, 张荣秋 申请人:国家海洋局第三海洋研究所

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