同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的试剂盒及检测方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒和同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法。该同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒包括有分别特异性扩增呼吸道合胞病毒基因、腺病毒基因、人博卡病毒基因的如SEQ?ID?NO:1、2、4、5、7、8引物基因序列,用于检测呼吸道合胞病毒基因、腺病毒基因、人博卡病毒基因的如SEQ?ID?NO:1、6、9的分子信标探针。本发明同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒采用能同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒,且检测周期短,效率高。另外,还能保证两两荧光信号之间无相互干扰,其灵敏度高。
【专利说明】同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的试剂盒 及检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于卫生防预病毒检测【技术领域】,具体的涉及一种同时检测呼吸道合胞病 毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒及检测方法。

【背景技术】
[0002] 急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infactions,ARTIs)是世界范围内 影响儿童健康的主要问题,是导致小于5岁儿童死亡的第二大病因。引起呼吸道感染的病 原体主要包括病毒、细菌、支原体和衣原体。病毒是导致呼吸道感染的重要病原体。引起 呼吸道感染症状的病毒主要包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒、腺病毒。 至2001年之后,又相继研究发现,人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV) (Van den Hoogen et al,2001)、人冠状病毒 NL63 (van der Hoek 儿童 al,2005)、HKU1 (Woo et al,2005)、 人博卡病毒 HB〇V (A1 lander et al,2005)。
[0003] 腺病毒(HAV)是一种没有包膜的DNA病毒,基因组长约25-45kb,理论上可编码 22-40个基因。HAV引起的症状一般表现为呼吸道感染、眼部感染、胃肠炎、儿童出血性膀胱 炎、女性宫颈炎和男性尿道炎等。HAV主要在冬春季节流行。
[0004] 呼吸道合胞病毒HRSV是属于副粘病毒科,主要有A和B两个亚型。在分子生物学 诊断技术出现之后,HRSV在成人获得性下呼吸道感染发挥的重要作用才被发现。在呼吸道 疾病感染的病原体中,最常见的是人呼吸道合胞病毒HRSV尤其在患有细支气管疾病的患 儿中,70%是由HRSV引起的。在患有慢性阻塞性肺炎的患者中,HRSV -般会使这些病患的 症状加重。
[0005] 随着分子生物学检测方法的改进,HB0V在呼吸道感染样本中才被发现,即2005年 8月,瑞典科学家Allander运用分子生物学技术,首次在儿童呼吸道分泌物中发现。目前 人博卡病毒的感染在亚洲、欧洲、北美洲、非洲和大洋洲等18个国家和地区都有发现。人博 卡病毒是一种无包膜、单链DNA病毒,基因组DNA长度大约为5299nt。人博卡病毒主要的 感染人群是儿童。据统计,在患有急性呼吸道疾病的儿童中,3-19%是由HB0V造成的,但是 目前HB0V的病理学特点还不是很清楚,因为在HB0V的阳性样本中,一般有其它病原体的存 在。人博卡病毒会使婴幼儿感染肺炎、支气管炎和支气管肺炎等疾病,临床症状上表现为咳 嗽、发热、喘息和腹泻等,高发人群为6个月至3岁的婴幼儿,高发季节为秋冬季。2012年9 月份在深圳口岸连续发现了四个人感染博卡病毒病例。人博卡病毒在受感染的儿童呼吸道 中普遍存在,但是研究者还在血清、粪便以及尿液的标本中也检测到了人博卡病毒,推测该 病毒可能与胃肠道疾病相关。
[0006] 呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒是儿童呼吸道感染的常见病原体,对其检 测的常规方法包括:细胞培养和直接荧光抗体实验、固相免疫测定,其中细胞培养和直接荧 光抗体实验的灵敏度低,并且费时费力。固相免疫测定价格低廉迅速,但是它只限于单病毒 感染的样本,灵敏度和特异性较低。免疫学检测方法只限于对一些病毒某个亚型的检测,例 如腺病毒、肠道病毒和鼻病毒。传统的PCR和实时PCR与上述检测相比,灵敏度和特异性显 著提高,但是该方法只能检测单一的病毒感染,对于多种病毒的检测显得过程繁琐,成本较 商。
[0007] 越来越多的研究和实验证实,引起呼吸道感染症状的病原体往往是由多种病原体 共同感染,混合感染引起的症状往往显著严重于单一病原体感染,特别是死亡或者超死亡 病例都是由多种病原体混合感染的结果。传统的检测方法,一般情况下获得结果周期较长, 需要数周甚至数月;而且每次实验只能鉴定一种病原体,不能满足快速应急的病原诊断, 不利于即时采取措施控制传播,所以必须将高通量快速检测技术应用于呼吸道病原体的检 测,以便为治疗疾病、控制疫情为政府决策提供可靠的依据。


【发明内容】

[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种能同时检测呼吸道合胞病 毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒及其同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方 法。旨在解决现有检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法存在的效率低,周期 长,成本高的技术问题。
[0009] 为了实现上述发明目的,本发明实施例的技术方案如下:
[0010] 一种同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒,所述试剂盒包括:
[0011] 特异性扩增呼吸道合胞病毒基因的引物和用于检测呼吸道合胞病毒基因的分子 信标探针,所述引物碱基序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示;所述分子信标探针碱基 序列如SEQ ID N0 :3所示;
[0012] 特异性扩增腺病毒基因的引物和用于检测腺病毒基因的分子信标探针,所述引物 碱基序列如SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示;所述分子信标探针碱基序列如SEQ ID N0 :6 所示;
[0013] 特异性扩增人博卡病毒基因的引物和用于检测人博卡病毒基因的分子信标探针, 所述引物碱基序列如SEQ ID N0 :7和SEQ ID N0 :8所示;所述分子信标探针碱基序列如SEQ ID N0 :9 所示。
[0014] 以及,一种同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法,包括如下步 骤:
[0015] 提取待测样本RNA;
[0016] 以所述提取待测样本RNA为模板,采用如权利要求1-5任一所述的同时检测呼吸 道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒进行RT-PCR处理后收集荧光数据;
[0017] 将荧光信号检测结果与阳性对照组比较判断。
[0018] 本发明与现有技术相比,具有以下优异技术效果:
[0019] 上述同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒以及同时检测呼 吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法采用祀序列富集多重PCR (Target enriched multiplex PCR, Tem-PCR)技术原理,采用相同标签辅助无二聚体(Homo-Tag Assisted Non-Dimer,HAND)和多色组合探针编码技术(Multicolor Combination Probe Coding, MCPC)实现单管对呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒三种病原体进行同时检测。
[0020] 因此,上述同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒采用上述 Tem-PCR技术原理和采用HAND和多色组合探针编码技术设计呼吸道合胞病毒、腺病毒和人 博卡病毒基因引物和探针的设计,使得该试剂盒能同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人 博卡病毒,且检测周期短,效率高。另外,还能保证两两荧光信号之间无相互干扰,其灵敏度 商。
[0021] 上述同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒方法采用上述Tem-PCR技术 原理和采用HAND和多色组合探针编码技术,有效克服了目前所有荧光PCR仪检测信号通道 的同时,大大提高了检测效率和检测质量,弥补了目前应急应对预防和控制呼吸道合胞病 毒、腺病毒和人博卡病毒感染症候病因学确认等领域存在的缺陷和不足,具有重要的实用 价值和现实推广意义。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1是本发明实施例2中阳性对照腺病毒HAV的扩增曲线;
[0023] 图2是本发明实施例2中阳性对照腺病毒HAV扩增制得的标准曲线;
[0024] 图3是本发明实施例2中阳性对照呼吸道合胞病毒HRSV的扩增曲线;
[0025] 图4是本发明实施例2中阳性对照呼吸道合胞病毒HRSV扩增制得的标准曲线;
[0026] 图5是本发明实施例2中阳性对照人博卡病毒HB0V的扩增曲线;
[0027] 图6是本发明实施例2中阳性对照人博卡病毒HB0V扩增制得的标准曲线;
[0028] 图7是本发明实施例3中待测样的扩增制得的曲线。

【具体实施方式】
[0029] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对 本发明作进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不 用于限定本发明。
[0030] 本发明实施例提供了一种效率高、灵敏度高的能同时检测呼吸道合胞病毒、腺病 毒和人博卡病毒试剂盒。该试剂盒包括RT-PCR处理的常规必要的酶、反应液等组分。其还 包括如下必要的引物和探针:
[0031] 1.特异性扩增呼吸道合胞病毒基因的正向引物P1和反向引物P2,该正向引物P1 的喊基序列如SEQ ID N0 :1所不;该反向引物P2的喊基序列如SEQID N0 :2所不。
[0032] 2.用于检测呼吸道合胞病毒基因的分子信标探针T1,该分子信标探针T1的碱基 序列如SEQ ID N0 :3所示;
[0033] 3.特异性扩增腺病毒基因的正向引物P3和反向引物P4,该正向引物P3的碱基序 列如SEQ ID N0 :4所示;该反向引物P4的碱基序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0034] 4.用于检测腺病毒基因的分子信标探针T2,该分子信标探针T2的碱基序列如SEQ ID N0 :6 所示;
[0035] 5.特异性扩增人博卡病毒基因的正向引物P5和反向引物P6,该正向引物P5的碱 基序列如SEQ ID N0 :7所不;该反向引物P6的喊基序列如SEQ ID N0 :8所不。
[0036] 6.用于检测腺病毒基因的分子信标探针T3,该分子信标探针T2的碱基序列如SEQ ID N0 :9 所示。
[0037] 上述各引物和分子信标探针的碱基序列如下表1所示:
[0038] 表1引物与探针列
[0039]

【权利要求】
1. 一种同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒,其特征在于:所述试 剂盒包括: 特异性扩增呼吸道合胞病毒基因的引物和用于检测呼吸道合胞病毒基因的分子信标 探针,所述引物喊基序列如SEQ ID NO : 1和SEQ ID NO :2所不;所述分子彳目标探针喊基序列 如 SEQ ID NO :3 所示; 特异性扩增腺病毒基因的引物和用于检测腺病毒基因的分子信标探针,所述引物碱基 序列如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示;所述分子信标探针碱基序列如SEQ ID NO :6所示; 特异性扩增人博卡病毒基因的引物和用于检测人博卡病毒基因的分子信标探针,所述 引物喊基序列如SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所不;所述分子彳目标探针喊基序列如SEQ ID NO :9所示。
2. 根据权利要求1所述的同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒, 其特征在于:用于检测呼吸道合胞病毒基因的分子信标探针的5'端连接有标记荧光基团 R0X。
3. 根据权利要求1所述的同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒,其 特征在于:用于检测腺病毒基因的分子信标探针的5'端连接有标记荧光基团HEX。
4. 根据权利要求1所述的同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒,其 特征在于:用于检测人博卡病毒基因的分子信标探针的5'端连接有标记荧光基团FAM。
5. 根据权利要求1-4任一所述的同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂 盒,其特征在于:还包括呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的阳性对照物。
6. 根据权利要求5所述的同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒,其 特征在于:所述阳性对照物分别为连有所述呼吸道合胞病毒基因片段的大肠杆菌、连有所 述腺病毒基因片段的大肠杆菌、连有所述人博卡病毒基因片段的大肠杆菌。
7. -种同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法,包括如下步骤: 提取待测样本RNA ; 以所述提取待测样本RNA为模板,采用如权利要求1-6任一所述的同时检测呼吸道合 胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒进行RT-PCR处理后收集荧光数据; 将荧光信号检测结果与对照组比较判断。
8. 根据权利要求7所述的同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法,其 特征在于:所述RT-PCR处理的反应体系包括: ? χ buffer 25 μ? RNA模板 5 μ? SEQ ID NO: 1 0.4 μΜ SEQ IDNC): 2 0,4 μΜ SEQ ID NO: 4 0.4 μΜ SEQ ID NO: 5 0.4 μΜ SEQ ID NO: 7 0.4 μΜ SEQ ID NO: 8 0.4 μΜ SEQ ID NO: 3 0.2 μΜ SEQ ID NO: 6 0.2 μΜ SEQ ID NO; 7 0.2 μΜ〇
9.根据权利要求7或8所述的同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法, 其特征在于:所述RT-PCR处理的反应条件为:42°C、10min ; 95〇C>10s ; 95°C、5s,60°C、lmin,共 40 个循环; 在60°C退火阶段收集FAM、HEX和R0X荧光数据。
【文档编号】C12Q1/70GK104059995SQ201410248109
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】房师松, 张然, 张仁利 申请人:深圳市疾病预防控制中心

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