一株多环芳烃降解菌s21-t17(H)-N3及其应用的制作方法
一株多环芳烃降解菌s21-t17(H)-N3及其应用的制作方法
【专利摘要】一株多环芳烃降解菌s21-t17(H)-N3及其应用，涉及环境污染物生物处理。所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter?sp.)s21-t17(H)-N3，登记入册编号为CGMCC?No.9030。可在降解各种有机化合物中的应用。所述有机化合物为多环芳烃类化合物，所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，蒽，荧蒽，屈，芘，苯并芘等化合物。对所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter?sp.)s21-t17(H)-N3进行基因组测序发现，该菌含有与多环芳烃相关的双加氧酶基因。所述双加氧酶基因在该菌降解多环芳烃时发挥重要作用。
【专利说明】—株多环芳烃降解菌s21-t17(H)-N3及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及环境污染物生物处理，尤其是涉及一株多环芳烃降解菌s21-tl7(H) -N3 及其应用。
【背景技术】
[0002]多环芳经(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)是一类含有至少 I 个苯环的芳香化合物，化学结构十分稳定，疏水性强，不易降解，包括萘、菲、芘等在内，有200多种。PAHs具有高毒性，有很强的“三致”作用，即:致癌、致畸和致突变作用(Sato H, Aoki Y.Mutagenesis by environmental pollutants and bio-monitoring ofenvironmental mutagens[J].Curr Drug Metab.2002,3(3):311-319 ；Phillips DH.Fiftyyears of benzo(a)pyrene[J].Nature.1983, 303(5917):468-472 ; Sternberg SS.Thecarcinogenesi s, mutagenesis and teratogenesis of insecticides.Review of studies inanimals and man [J].Pharmacology&Therapeutics.1979, 6 (I): 147-166.)。PAHs 是环境致癌化学物质中最大的一类，其中，苯并[α ]芘、苯并[α ]蒽等是危害最大的，苯并[α ]芘是第一个被发现的环境化学致癌物，被国际癌症研究机构指定为一级致癌物质，已列为国内外环境监测的常规项目之一。PAHs已受到各国环境保护组织的重视，美国环境保护署将16种未带取代基的PAHs列入了优先治理的污染物黑名单(Autrup H, Harris CC, Trump BF etal.Metabolism of benzo (a) pyrene and identification of the major benzo (a) pyrene-DNAadducts in cultured human colon [J].Cancer Res.1978, 38 (IlPtl): 3689-3696.)。
[0003]大气中的大部分PAHs来源于煤和石油的不完全燃烧，而陆地环境中则主要来源于固体废物、工业漏渗和大气沉降。海洋环境主要PAHs来源是海底原油渗漏、海上运输、油井渗漏、油轮事故等。PAHs是石油中除烷烃以外的主要组分。全世界平均每天开采出七千万加仑石油，其中有一半需要通过海洋来运输，在石油的生产运输过程中不可避免地会发生油井自然渗漏、海上运输泄漏等。更为严重的是由于油轮事故导致的大范围污染，污染物中易挥发的成分通过蒸发进入大气中，难溶解难挥发的成分少数可以通过光氧化等途径降解，而多数则通过黏附于海洋沉积物经年累月地在海洋中积累，PAHs就属于后者。残留在海洋中的PAHs可能会在海洋生物体内富集从而毒害海洋生物。更甚的是，这种难降解的化合物可能会经过食物链累积作用直接影响到人类健康(Shiaris MP, D.J-S.Polycyclicaromatic hydrocarbons in surficial sediments of Boston Harbour, MA, USA.[J].MarPoll Bull.1986, 17:469 ~472.；Baumard, Budzinski, Garrigues.Polycyclic aromatichydrocarbons in sediments and mussels of the western Mediterranean Sea[J].EnvironToxicol&Chem.1998，15:765-776.)。
[0004]环境中的PAHs可以通过多种方式去除，包括自然挥发、光降解、化学降解、生物降解、颗粒吸附等，微生物转化与降解被认为是环境中PAHs去除最为彻底有效的方式(Dua M,Singh, A., Sethunathan, N., Johri, A.Κ..Biotechnology and bioremediation: successesand limitations[J].ApplMicrobiolBiotechnol.2002，59 (2-3):143-152.)。 目前，已知的环境中PAHs降解微生物有许多，包括细菌、放线菌、真菌、藻类等。PAHs的细菌降解已有广泛的研究，许多细菌被分离鉴定为PAH s降解菌，这些菌株主要包括Pseudomonas、Sphingomonas、Cycloclasticus、Burkholderia、Rhodococcus、Polaromonas、Neptunomonas> Janibacter> Nocardia、Bacillus、Mycobacterium 等属。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)_N3。
[0006]本发明的另一个目的是提供一株多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.)s21-t 17 (H) -N3在降解各种有机化合物中的应用。
[0007]所述多环芳经降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)-N3,已于 2014 年 04 月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101，登记入册编号为CGMCCN0.9030。所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)-N3来源于南大西洋的海底表层沉积物，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌为革兰氏染色阴性的赤细菌属(Erythrobacter sp.)的菌株s21_tl7 (H) -N3,生物学特性为接触酶阴性,氧化酶阳性,非发酵型，专性需氧，菌体形 态为呈圆形，橘黄色不透明，边缘规则，表面光滑凸起，无晕环，直径3~4mm。该菌的最适生长条件为:pH = 6.5~8.5，温度25~28°C。
[0008]所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)-N3可在降解各种有机化合物中的应用。
[0009]所述有机化合物为多环芳烃类化合物，所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘，苯并芘等化合物。
[0010]对所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)-N3进行基因组测序发现，该菌含有与多环芳烃相关的双加氧酶基因。这些双加氧酶基因在该菌降解多环芳烃时发挥重要作用。
[0011]实验证明，所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)-N3能够利用混合PAHs，萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘等多环芳烃以及柴油作为唯一能源和碳源生长繁殖，该菌20天能将无机盐培养基中的混合PAHs，萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘，苯并芘以及柴油降解 67.24%,68.26%, 71.54%, 39.44%, 35.12%, 22.14%, 27.34%, 25.46%,50.47%。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为s21-tl7(H)_N3在各种碳源中的降解率。
【具体实施方式】
[0013]实例一:Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3的分离与降解混合多环芳烃的性能
[0014]现场采集南大西洋的海底表层沉积物，采用IOOmL海水培养基加入萘、菲、芘混合多环芳烃在25°C 180r/min条件下进行富集培养。两周后，在固体培养基(M2)中稀释涂布平板，得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解石油烃的能力，最后得到一株多环芳烃烃的高效降解菌s21-tl7(H)-N3，该菌经16S rDNA鉴定为赤细菌属(Erythrobactersp.)。固体培养基(M2)的成分:乙酸钠5g/L,梓檬酸钠0.05g/L,普通肉汤培养基0.5g/L,蛋白胨0.lg/L,酵母粉0.lg/L,苹果酸0.05g/L,葡萄糖lg/L,鹿糖0.5g/L,硝酸铵lg/L，氯化铵0.2g/L，酒石酸钠0.05g/L，可溶性淀粉0.5g/L，琼脂粉15g/L，加海水至1L，调pH7.5，115°C高压蒸汽灭菌30min后补加1%体积已灭菌的腿#04溶液(IOg/L, ρΗ6.7)及 0.1% 体积 0.22 μ m 滤膜除菌的 FeSO4 (0.4g/L)。
[0015]将Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3接种至含萘、菲、花混合多环芳烃的人工海水培养基(MMC)中，在180r/min、25°C摇床中培养20天后，测定该菌对于混合多环芳烃的降解能力，经过测定得到，该菌对含萘、菲、芘混合多环芳烃的降解率为67.24%(图1)。人工海水培养基(MMC):NaC124g/L, MgSO4.7H207g/L，NH4NO3lg/L, KC10.7g/L，KH2P042g/L, Na2HP043g/L, pH7.4。灭菌后补加适量微量元素混合液,微量元素经0.22 μ M滤膜过滤除菌。MMC 微量元素混合液:CaCl2，2mg/L ；FeCl3.6H20, 50mg/L ；CuSO4, 0.5mg/L ；MnCl2.4H20, 0.5mg/L ；ZnSO4.7H20, 10mg/L。
[0016]实例二:Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3单多环芳烃的降解性能测定
[0017]将Erythrobactersp.s21_tl7 (H)-N3接种至不同碳源(萘，菲，蒽，突蒽，屈(四环)，芘，柴油)的人工海水培养基(MMC)中，同时设置底空白对照(只加底物不加菌)，在180r/min、28°C摇床中培养20天后观察菌株的生长状况，并测定该菌对各底物的降解率。结果表明该菌株能够利用萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘，苯并芘，柴油生长，降解率分别为68.26%, 71.54%, 39.44%, 35.12%, 22.14%, 27.34%, 25.46%, 50.47% (图1)。
[0018]实例三:Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3多环芳烃降解相关基因的应用
[0019]将Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3进行基因组测序,从基因组中寻找与多环芳烃降解相关基因，发现许多芳香烃降解相关基因(表1);
[0020]表1 Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3基因组中多环芳经降解相关基因
【权利要求】
1.多环芳径降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H) -N3，已于2014年04月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCC N0.9030。
2.如权利要求1所述多环芳径降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)-N3在降解各种有机化合物中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述有机化合物为多环芳烃类化合物。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘，苯并芘。
5.如权利要求1所述一株多环芳径降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)-N3，其特征在于其具有与多环芳烃降解相关的双加氧酶基因； 表1 EirthiObactersp.s21_tl7 (H)-N3基因组中多环芳烃降解相关基因
6.如权利要求5所述一株多环芳烃降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)_N3,其特征在于所述基因在多环芳烃污染环境监测和生物修复中应用。
7.如权利要求5所述一株多环芳烃降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)_N3,其特征在于所述基因在降解多环芳烃中应用。
【文档编号】C12N1/20GK104004686SQ201410248117
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】邵宗泽, 王万鹏, 庄玲萍, 王淋 申请人:国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会
【专利摘要】一株多环芳烃降解菌s21-t17(H)-N3及其应用，涉及环境污染物生物处理。所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter?sp.)s21-t17(H)-N3，登记入册编号为CGMCC?No.9030。可在降解各种有机化合物中的应用。所述有机化合物为多环芳烃类化合物，所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，蒽，荧蒽，屈，芘，苯并芘等化合物。对所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter?sp.)s21-t17(H)-N3进行基因组测序发现，该菌含有与多环芳烃相关的双加氧酶基因。所述双加氧酶基因在该菌降解多环芳烃时发挥重要作用。
【专利说明】—株多环芳烃降解菌s21-t17(H)-N3及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及环境污染物生物处理，尤其是涉及一株多环芳烃降解菌s21-tl7(H) -N3 及其应用。
【背景技术】
[0002]多环芳经(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)是一类含有至少 I 个苯环的芳香化合物，化学结构十分稳定，疏水性强，不易降解，包括萘、菲、芘等在内，有200多种。PAHs具有高毒性，有很强的“三致”作用，即:致癌、致畸和致突变作用(Sato H, Aoki Y.Mutagenesis by environmental pollutants and bio-monitoring ofenvironmental mutagens[J].Curr Drug Metab.2002,3(3):311-319 ；Phillips DH.Fiftyyears of benzo(a)pyrene[J].Nature.1983, 303(5917):468-472 ; Sternberg SS.Thecarcinogenesi s, mutagenesis and teratogenesis of insecticides.Review of studies inanimals and man [J].Pharmacology&Therapeutics.1979, 6 (I): 147-166.)。PAHs 是环境致癌化学物质中最大的一类，其中，苯并[α ]芘、苯并[α ]蒽等是危害最大的，苯并[α ]芘是第一个被发现的环境化学致癌物，被国际癌症研究机构指定为一级致癌物质，已列为国内外环境监测的常规项目之一。PAHs已受到各国环境保护组织的重视，美国环境保护署将16种未带取代基的PAHs列入了优先治理的污染物黑名单(Autrup H, Harris CC, Trump BF etal.Metabolism of benzo (a) pyrene and identification of the major benzo (a) pyrene-DNAadducts in cultured human colon [J].Cancer Res.1978, 38 (IlPtl): 3689-3696.)。
[0003]大气中的大部分PAHs来源于煤和石油的不完全燃烧，而陆地环境中则主要来源于固体废物、工业漏渗和大气沉降。海洋环境主要PAHs来源是海底原油渗漏、海上运输、油井渗漏、油轮事故等。PAHs是石油中除烷烃以外的主要组分。全世界平均每天开采出七千万加仑石油，其中有一半需要通过海洋来运输，在石油的生产运输过程中不可避免地会发生油井自然渗漏、海上运输泄漏等。更为严重的是由于油轮事故导致的大范围污染，污染物中易挥发的成分通过蒸发进入大气中，难溶解难挥发的成分少数可以通过光氧化等途径降解，而多数则通过黏附于海洋沉积物经年累月地在海洋中积累，PAHs就属于后者。残留在海洋中的PAHs可能会在海洋生物体内富集从而毒害海洋生物。更甚的是，这种难降解的化合物可能会经过食物链累积作用直接影响到人类健康(Shiaris MP, D.J-S.Polycyclicaromatic hydrocarbons in surficial sediments of Boston Harbour, MA, USA.[J].MarPoll Bull.1986, 17:469 ~472.；Baumard, Budzinski, Garrigues.Polycyclic aromatichydrocarbons in sediments and mussels of the western Mediterranean Sea[J].EnvironToxicol&Chem.1998，15:765-776.)。
[0004]环境中的PAHs可以通过多种方式去除，包括自然挥发、光降解、化学降解、生物降解、颗粒吸附等，微生物转化与降解被认为是环境中PAHs去除最为彻底有效的方式(Dua M,Singh, A., Sethunathan, N., Johri, A.Κ..Biotechnology and bioremediation: successesand limitations[J].ApplMicrobiolBiotechnol.2002，59 (2-3):143-152.)。 目前，已知的环境中PAHs降解微生物有许多，包括细菌、放线菌、真菌、藻类等。PAHs的细菌降解已有广泛的研究，许多细菌被分离鉴定为PAH s降解菌，这些菌株主要包括Pseudomonas、Sphingomonas、Cycloclasticus、Burkholderia、Rhodococcus、Polaromonas、Neptunomonas> Janibacter> Nocardia、Bacillus、Mycobacterium 等属。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)_N3。
[0006]本发明的另一个目的是提供一株多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.)s21-t 17 (H) -N3在降解各种有机化合物中的应用。
[0007]所述多环芳经降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)-N3,已于 2014 年 04 月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101，登记入册编号为CGMCCN0.9030。所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)-N3来源于南大西洋的海底表层沉积物，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌为革兰氏染色阴性的赤细菌属(Erythrobacter sp.)的菌株s21_tl7 (H) -N3,生物学特性为接触酶阴性,氧化酶阳性,非发酵型，专性需氧，菌体形 态为呈圆形，橘黄色不透明，边缘规则，表面光滑凸起，无晕环，直径3~4mm。该菌的最适生长条件为:pH = 6.5~8.5，温度25~28°C。
[0008]所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)-N3可在降解各种有机化合物中的应用。
[0009]所述有机化合物为多环芳烃类化合物，所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘，苯并芘等化合物。
[0010]对所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)-N3进行基因组测序发现，该菌含有与多环芳烃相关的双加氧酶基因。这些双加氧酶基因在该菌降解多环芳烃时发挥重要作用。
[0011]实验证明，所述多环芳烃降解菌(Erythrobacter sp.) s21_tl7 (H)-N3能够利用混合PAHs，萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘等多环芳烃以及柴油作为唯一能源和碳源生长繁殖，该菌20天能将无机盐培养基中的混合PAHs，萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘，苯并芘以及柴油降解 67.24%,68.26%, 71.54%, 39.44%, 35.12%, 22.14%, 27.34%, 25.46%,50.47%。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为s21-tl7(H)_N3在各种碳源中的降解率。
【具体实施方式】
[0013]实例一:Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3的分离与降解混合多环芳烃的性能
[0014]现场采集南大西洋的海底表层沉积物，采用IOOmL海水培养基加入萘、菲、芘混合多环芳烃在25°C 180r/min条件下进行富集培养。两周后，在固体培养基(M2)中稀释涂布平板，得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解石油烃的能力，最后得到一株多环芳烃烃的高效降解菌s21-tl7(H)-N3，该菌经16S rDNA鉴定为赤细菌属(Erythrobactersp.)。固体培养基(M2)的成分:乙酸钠5g/L,梓檬酸钠0.05g/L,普通肉汤培养基0.5g/L,蛋白胨0.lg/L,酵母粉0.lg/L,苹果酸0.05g/L,葡萄糖lg/L,鹿糖0.5g/L,硝酸铵lg/L，氯化铵0.2g/L，酒石酸钠0.05g/L，可溶性淀粉0.5g/L，琼脂粉15g/L，加海水至1L，调pH7.5，115°C高压蒸汽灭菌30min后补加1%体积已灭菌的腿#04溶液(IOg/L, ρΗ6.7)及 0.1% 体积 0.22 μ m 滤膜除菌的 FeSO4 (0.4g/L)。
[0015]将Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3接种至含萘、菲、花混合多环芳烃的人工海水培养基(MMC)中，在180r/min、25°C摇床中培养20天后，测定该菌对于混合多环芳烃的降解能力，经过测定得到，该菌对含萘、菲、芘混合多环芳烃的降解率为67.24%(图1)。人工海水培养基(MMC):NaC124g/L, MgSO4.7H207g/L，NH4NO3lg/L, KC10.7g/L，KH2P042g/L, Na2HP043g/L, pH7.4。灭菌后补加适量微量元素混合液,微量元素经0.22 μ M滤膜过滤除菌。MMC 微量元素混合液:CaCl2，2mg/L ；FeCl3.6H20, 50mg/L ；CuSO4, 0.5mg/L ；MnCl2.4H20, 0.5mg/L ；ZnSO4.7H20, 10mg/L。
[0016]实例二:Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3单多环芳烃的降解性能测定
[0017]将Erythrobactersp.s21_tl7 (H)-N3接种至不同碳源(萘，菲，蒽，突蒽，屈(四环)，芘，柴油)的人工海水培养基(MMC)中，同时设置底空白对照(只加底物不加菌)，在180r/min、28°C摇床中培养20天后观察菌株的生长状况，并测定该菌对各底物的降解率。结果表明该菌株能够利用萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘，苯并芘，柴油生长，降解率分别为68.26%, 71.54%, 39.44%, 35.12%, 22.14%, 27.34%, 25.46%, 50.47% (图1)。
[0018]实例三:Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3多环芳烃降解相关基因的应用
[0019]将Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3进行基因组测序,从基因组中寻找与多环芳烃降解相关基因，发现许多芳香烃降解相关基因(表1);
[0020]表1 Erythrobactersp.s21_tl7 (H) -N3基因组中多环芳经降解相关基因
【权利要求】
1.多环芳径降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H) -N3，已于2014年04月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCC N0.9030。
2.如权利要求1所述多环芳径降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)-N3在降解各种有机化合物中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述有机化合物为多环芳烃类化合物。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，蒽，荧蒽，屈(四环)，芘，苯并芘。
5.如权利要求1所述一株多环芳径降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)-N3，其特征在于其具有与多环芳烃降解相关的双加氧酶基因； 表1 EirthiObactersp.s21_tl7 (H)-N3基因组中多环芳烃降解相关基因
6.如权利要求5所述一株多环芳烃降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)_N3,其特征在于所述基因在多环芳烃污染环境监测和生物修复中应用。
7.如权利要求5所述一株多环芳烃降解菌(Erythrobactersp.) s21_tl7 (H)_N3,其特征在于所述基因在降解多环芳烃中应用。
【文档编号】C12N1/20GK104004686SQ201410248117
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】邵宗泽, 王万鹏, 庄玲萍, 王淋 申请人:国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会
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