一种注射级α-环糊精的制备方法
一种注射级α-环糊精的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种注射级α-环糊精的制备方法，采用环氧基树脂作载体制备α-CGTase固定化酶，将淀粉制成淀粉乳，加入α-CGTase固定化酶进行淀粉液化，再转入用装填有α-CGTase固定化酶的填充反应器中反应，转化液经超滤收集透出液；透出液经α-淀粉酶和糖化酶处理、活性炭脱色、反渗透膜浓缩、重结晶，过滤去除β-环糊精，母液再进一步经反渗透膜浓缩，结晶，过滤，烘干研磨即得注射级α-环糊精。本发明制得的固定化酶具有稳定性好、可以重复利用，且极易与产物、底物分离，酶的利用效率高、可连续操作及自动化控制，工艺简便，生产成本低等优点。采用无溶剂过程生产α-环糊精，生产设备简单，反应条件温和，能耗低，无溶剂残留污染，更加环保节能。
【专利说明】一种注射级Ct -环糊精的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学【技术领域】，具体涉及一种注射级α -环糊精的制备方法。
技术背景
[0002]环糊精是由环糊精葡萄糖基转移酶酶解淀粉或淀粉类基质产生的由D-吡喃型葡萄糖单元通过α-1，4-糖苷键连接而形成的一类环状低聚化合物。根据葡萄糖单元数目的不同，环糊精可以分为α _、β _、Y _、δ -环糊精等，其中最常见的是聚合度为6、7、8的α -、β Y _环糊精。
[0003]环糊精的立体结构是中空圆筒形，在它的圆筒内部有非极性的C3和C5上的氢以及通过醚键连接的氧原子，故圆筒内腔呈疏水性；而葡萄糖的C2和C3上的仲羟基位于圆筒的宽侧开口处，C6上的伯羟基位于圆筒的窄侧开口处，故圆筒外部呈亲水性。由于这种结构，使它具有容纳与其形状和大小适合的疏水性分子或基团嵌入圆筒内而形成包合物的特性。环糊精在包合物中作为“主分子”，在其圆筒内腔将其它物质作为“客分子”包合起来。这种包合物与 尿素和硫脲的分子与分子间晶格空洞形成的包合物不同，因环糊精形成的包合物是在空腔内，而不是在晶格中，所以它在水中溶解时，包合物仍然稳定，并不分裂。而且α-环糊精在水中的溶解度大(25°C达到127g/L)，且空腔较小，因此在药物包合中有着重要的作用，并广泛应用于食品、农业、化学工业等领域。
[0004]目前α-环糊精的生产主要采用酶法制备，菌种发酵后，从菌液中通过离心或者板框过滤分离得到α-环糊精葡萄糖基转移酶(a-CGTase )。同时将淀粉与水调浆制成淀粉乳后升温至90°C ±1°C糊化至固体状，再加入α-淀粉酶或者a-CGTase搅拌液化。液化后降温至50°C ±1°C，加入环糊精葡萄糖基转移酶和癸醇，搅拌反应生成α-环糊精-癸醇复合物。过滤除去滤液后，α-环糊精-癸醇复合物经过水蒸汽蒸馏去除癸醇，经过浓缩结晶干燥即得α-环糊精。在此工艺制备过程中，环糊精葡萄糖基转移酶在水溶液中不稳定，一次性使用难以回收利用，很难连续化生产，且在后续的反应过程中需要对其进行灭活，增加生产成本。在转化过程中，需要加入不同的有机溶剂，如癸醇等，使α-环糊精包合沉淀下来，再通过水蒸汽蒸馏去除癸醇，但由于癸醇的沸点高达229°C，很难从水溶液中去除。采用水蒸汽蒸馏法需高压饱和蒸汽蒸馏10至15小时，该法需使用高温高压手段，存在能耗过高、危险系数较大、操作复杂、费时(多达15h)、溶媒无法回收利用、有机溶剂易残留于样品中等缺点，为实验室分析和实际生产操作带来诸多不便。且国内在实际生产过程中，α -环糊精产品的质量较差，尚未有符合注射级药用标准产品的生产，不利于α -环糊精在医药产品的应用。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种注射级α -环糊精的制备方法，其采用环氧基树脂作为固定化载体得到稳定的a-CGTase固定化酶，并采用无溶剂方法制备α-环糊精，能够有效地克服现在技术中存在的能耗大，反应强烈，有机溶剂残留，产品质量低的问题。[0006]本发明所采取的技术方案为:
一种注射级α -环糊精的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
(a)a -CGTase产生菌的诱导表达:
a -CGTase产生菌经发酵培养后离心，收集上清液即为粗酶液；粗酶液经过超滤浓缩得到浓缩粗酶液；
(b)a -CGTase固定化酶的制备:
将环氧基树脂加入磷酸缓冲溶液浸泡至溶胀后，加入上述浓缩粗酶液，经振荡固定化反应后离心，弃去上清液，加入巯基乙醇封闭剩余的环氧基团，过滤，洗涤，直至洗出液无酶活性，即得a-CGTase固定化酶，4°C保存，备用；
(C)淀粉的液化:
在分批搅拌罐中加入淀粉制成淀粉乳，加入CaCl2后，调整pH，加入a -CGTase固定化酶并搅拌反应得到淀粉液化液；
Cd)淀粉的转化: 将a-CGTase固定化酶填充在填充反应柱中，两端用玻璃纤维塞隔离，拧紧两端旋帽使填充反应柱内部呈密封状态；将液化储罐中的淀粉液化液用恒流泵输入填充反应柱进行转化反应；得到的转化液经超滤，透过液为α-环糊精溶液，截留液继续打入填充反应柱进行转化反应；α -环糊精溶液加入固定化α -淀粉酶和固定化糖化酶反应，以除去未转化的淀粉，并改善转化液的滤过性；转化液通砂芯漏斗过滤回收固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶，滤液储存于储液罐中；
Ce)精制纯化:
滤液中加入活性炭搅拌后过滤，经反渗透膜浓缩，5°C~15°C搅拌，待β-环糊精重结晶后，过滤弃晶体，母液经过进一步反渗透膜浓缩至α -环糊精含量在40%~50%时，(TC~5°C搅拌结晶得α-环糊精，烘干研磨即得注射级α-环糊精。
[0007]步骤(a)中,所述a-CGTase产生菌为软化芽孢杆菌(ifeci77i/5.?acera/75.)、嗜热脂肪芽孢菌iB.Siearo?Α6?τ?ο/7ΑΗ".5)、产酸克雷伯氏菌{Klebsiella oxytoca )等,优选基因工程菌万.co7i现(DE3)/pet24a (+)(中国典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)。
[0008]步骤(b)中，所述环氧基载体为所有含有环氧基功能基的载体，优选环氧基树脂Eupergit C250L。
[0009]优选的，步骤(b)中，所述的环氧基树脂和酶在pH6~9的磷酸缓冲液中，4°C至室温反应2~24h，将酶固定于树脂上，制成固载量为10~200mg酶/g树脂。
[0010]优选的，步骤(C)中，液化反应控制ρΗ5.0~7.0，优选6.5，反应温度40°C~70°C，优选55°C，控制液化D.E值为2.5~4.5，优选3.0。
[0011]优选的，步骤(d)中所述填充反应柱的高径比为6~9，优选7.8;反应液流速为1.0ml/min~2.0ml/min,优选1.5ml/min ;反应温度30 V~50 °C,优选35 V ;反应时间IOmin~60min ;固定化α -淀粉酶与固定化糖化酶酶活比例为1:0.5~1:0.8，优选比例为1:0.7 ;添加量为投料淀粉量干重的0.03%~0.05%，优选的0.03%。
[0012]优选的，步骤(e)中，加入活性炭3%~8%，优选5% ;反渗透膜采用热性螺旋反渗透膜，截留分子量为150~300，操作压力为3.5~5.5MPa，工作温度为30°C~40°C，流速为20L/h。[0013]更进一步的，步骤(e)中，加入活性炭5%，反渗透膜采用热性螺旋反渗透膜，截留分子量为200，操作压力为4.0MPa，工作温度为35°C，流速为20L/h。
[0014]相对于现有技术，本发明具有以下优点:
1、本发明的环氧基树脂Eupergit C250l直径约100-250 μ m,具有化学、机械性能稳定，可长期存放的特点；具有较高的反应活性，可以和蛋白质上的氨基、巯基、羟基等集团反应形成稳定多点共价键；固定化后未反应的环氧基团易于使用巯基乙醇或二硫苏糖醇进行封闭等优点。目前还未有以Eupergit C250l固定化a -CGTase的报道。
[0015]2、本发明首次采用环氧基树脂作为固定化载体制备a -CGTase固定化酶，制得的固定化酶具有很好的化学稳定性且结构稳定、有很好的机械操作强度，可以反复重复利用，且极易与产物、底物分离，酶的利用效率高、可连续操作及自动化控制，工艺简便，生产成本低等优点。具体表现在以下几个方面:1)本发明将ΡΗ6.0~9.0的磷酸缓冲溶液预先浸泡Eupergit C25%，促进了载体对酶的吸附，并加快了固定化的反应历程以减少固定化造成的酶损失，本发明的酶活回收率为50%以上。2) a -CGTase经过固定化后稳定性明显提高，试验表明经过30个批次的重复使用，其相对酶活依然可达初始酶活的55%以上。固定化酶4°C保存14 个月后活力还在80%以上，说明固定化后a-CGTase有较好的贮存稳定性。3)与游离酶相比，使用固定化酶对底物进行转化，淀粉转化生成环糊精的时间明显缩短从原来的24h缩短到2~3h。
[0016]3、本发明采用无溶剂过程生产α-环糊精，采用固定化酶液化淀粉，通过填充式反应器进行转化反应，反应液通过超滤膜机组不断收集产品，并通过反渗透膜浓缩样品，低温结晶过滤后得到产品，整个反应过程条件温和，无任何有机溶剂，所用生产设备简单，可连续化生产。传统的添加有机溶剂的方法，需要液化罐、蒸馏罐、高效旋转蒸发薄膜器等，并要通往饱和的高压水蒸汽和1-癸醇，反应条件剧烈，能耗高，溶剂易残留污染。
[0017]4、本发明采用固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶处理反应液，一方面降解未转化的淀粉，同时增加了反应液的滤过性，另一方面避免反应过程中酶的灭活操作。精制过程中加入活性炭脱色，再经过0.45 μ m、0.22 μ m滤膜过滤，然后再进行反渗透系统进行浓缩，在5°C~15°C进行结晶过滤除去少量的β -环糊精，继续反渗透浓缩至40%~50%时，O~5°C进行结晶过滤制得α -环糊精，烘干研磨得最终成品，纯度达99.9%以上，满足美国药典USP36中注射级药用辅料α -环糊精的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0019]图1为本发明的工艺流程图。
[0020]图2为本发明的淀粉转化和精制纯化的原理示意图；
图中，I填充反应柱，2 a -CGTase固定化酶，3液化储罐，4超滤膜机组，5固定化淀粉酶与固定化糖化酶，6恒流泵，7反应釜，8砂芯漏斗，9反渗透膜机组，10结晶储罐，11储液罐。
[0021]图3为a -CGTase固定化酶操作稳定性实验的试验批次与酶活关系图。
[0022]图4为本发明的注射级α -环糊精的HPLC色谱图。
【具体实施方式】[0023]下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利。
[0024]实施例一:
步骤1:
取基因工程菌疋coli BL21 (DE3)/pet24a (+)(中国典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)接种于LB培养基中，30~37°C培养6~12h后，转至TB培养基中，30~37 °C培养2~6h后，加入0.01%的IPTG并降温至20~28 V培养30~36h得到发酵液。取发酵液，经高速冷冻离心机6000rpm离心20min后得上清液。取上清液按文献ASpectrophotometric Assay for the Cyclization Activity of Cyclomaltohexaose(a -Cyclodextrin) Glucanotransferase 方法测定酶活，以环化活力计为 50U/ml。
[0025]取上清液，调节超滤膜机组膜前压力为IMPa，膜后压力为0.4MPa，下进入超滤膜过滤系统(超滤膜截留孔径为10000)，工作温度30°C~40°C，水和一些小分子物质通过膜，而α-环糊精糖基转移酶被截留并返回料液罐进一步浓缩，直至料液呈浆状。检测其酶活为 50000U/ml。
[0026]步骤2:
称取IOg Eupergit C25tllj(多孔丙烯酸微球，由甲基丙烯酰氨，N, N,-亚甲基-双-(甲基丙烯酰氨)缩水甘油甲基丙烯酸酯形成的含有环氧官能团的聚合物，孔径为100~250 μ m，德国Rohm Pharma公司产品),加入pH6.5的磷酸缓冲液100mL浸泡至溶胀。加入步骤I中得到的浓缩粗酶液20ml ，30°C水浴摇床中反应6至15小时，摇床转速为50至200rpm。反应完成后，4000rpm离心20min,弃上清液,加入50ml 2%~5%的巯基乙醇封闭剩余的环氧基团，充分反应10~15h后过滤，磷酸缓冲液洗涤，冲洗巯基乙醇及游离的未固定的酶，直至洗出液无酶活性，即得固定化α-环糊精葡萄糖基转移酶，4°C保存。测定固定化后的α-环糊精葡萄糖基转移酶酶活，与原酶液对比，计算酶的酶活力回收率为55.54%。取固定化酶进行操作稳定性实验，结果如附图4所示，从图可以看出，经过30个批次的重复使用，其相对酶活依然可达初始酶活的55%以上。
[0027]步骤3:
取食品级马铃薯淀粉，加入水后调成浓度为15%的马铃薯淀粉乳，置于分批搅拌罐反应器中，加入0.02%的CaCl2，维持温度在40°C~55°C之间，加入步骤2中的固定化酶搅拌反应。当淀粉乳变澄清时，每隔IOmin取样检测液化淀粉的D.E值(反应液中还原糖量/干物质量)，检测结果如下表，当达到2.4~4.5时用碘显本色时即停止液化。经外观检查，马铃薯淀化液呈淡黄色，液化完全，流动性较好，无淀粉固体残留。经4000rpm离心20min后，上清液即为转化完全的马铃薯淀粉，固体即为回收的固定化酶，经磷酸缓冲液冲洗后于4°C保藏。
[0028]表1液化淀粉的D.E值检测结果表
【权利要求】
1.一种注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (a)a -CGTase产生菌的诱导表达: a-CGTase产生菌经发酵培养后离心，收集上清液即为粗酶液；粗酶液经过超滤浓缩得到浓缩粗酶液； (b)a -CGTase固定化酶的制备: 将环氧基树脂加入磷酸缓冲溶液浸泡至溶胀后，加入上述浓缩粗酶液，经振荡固定化反应后离心，弃去上清液，加入巯基乙醇封闭剩余的环氧基团，过滤，洗涤，直至洗出液无酶活性，即得a-CGTase固定化酶，4°C保存，备用； (C)淀粉的液化: 在分批搅拌罐中加入淀粉制成淀粉乳，加入CaCl2后，调整pH，加入a -CGTase固定化酶并搅拌反应得到淀粉液化液； Cd)淀粉的转化: 将a-CGTase固定化酶填充在填充反应柱中，两端用玻璃纤维塞隔离，拧紧两端旋帽使填充反应柱内部呈密封状态；将液化储罐中的淀粉液化液用恒流泵输入填充反应柱进行转化反应；得到的转化液经超滤，透过液为α-环糊精溶液，截留液继续打入填充反应柱进行转化反应；α -环糊精溶液加入固定化α -淀粉酶和固定化糖化酶反应，以除去未转化的淀粉，并改善转化液的滤过性；转化液通砂芯漏斗过滤回收固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶，滤液储存于储液罐中； Ce)精制纯化: 滤液中加入活性炭搅拌后过滤，经反渗透膜浓缩，5°C~15°C搅拌，待β-环糊精重结晶后，过滤弃晶体，母液经过进一步反渗透膜浓缩至α -环糊精含量在40%~50%时，(TC~5°C搅拌结晶得α-环糊精，烘干研磨即得注射级α-环糊精。
2.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，所述α -CGTase产生菌为软化芽孢杆菌iBaciIlus macerans )、嗜热脂肪芽孢菌(B.StearothermophiIus)或产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
3.根据权利要求2所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，所述a-CGTase产生菌为基因工程菌疋co7i BL21 (DE3Vpet24a (W，中国典型微生物保藏中心保藏，保藏号:CCTCCM208063。
4.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(b)中，所述环氧基载体为环氧基树脂Eupergit C25tllj。
5.根据权利要求4所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(b)，所述的环氧基树脂和酶在PH6~9的磷酸缓冲液中，4°C至室温反应2~24h，将酶固定于树脂上，制成固载量为10~200mg酶/g树脂。
6.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(c)中，液化反应控制ΡΗ5.0~7.0，反应温度40°C~70°C，控制液化D.E值为2.5~4.5。
7.根据权利要求6所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(C)中，液化反应控制ΡΗ6.5，反应温度55°C，控制液化D.E值为3.0。
8.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(d)中，所述填充反应柱的高径比为6~9,反应液流速为1.0ml/min~2.0ml/min,反应温度30°C~50°C，反应时间IOmin~60min，固定化α -淀粉酶与固定化糖化酶的加入量为投料淀粉量干重的0.03%~0.05%，其中固定化α -淀粉酶与固定化糖化酶的酶活比为1:0.5~1:0.8。
9.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(e)中，加入活性炭3%~8% ;反渗透膜采用热性螺旋反渗透膜，截留分子量为150~300，操作压力为.3.5~5.5MPa，工作温度为30°C~40°C，流速为20L/h。
10.根据权利要求9所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(e)中，加入活性炭5%，反渗透膜采用热性螺旋反渗透膜，截留分子量为200，操作压力为4.0MPa，工作温度为35°C，流速为20L/h。
【文档编号】C12P19/04GK103981238SQ201410248930
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】张颖, 刘鹏, 姜寿俊, 孙健, 高国锐, 刘元鑫, 孙剑峰, 王学斌, 葛庆燕, 闫飞, 刘骏, 郭凤霞, 徐丹 申请人:济南康和医药科技有限公司
【专利摘要】本发明公开了一种注射级α-环糊精的制备方法，采用环氧基树脂作载体制备α-CGTase固定化酶，将淀粉制成淀粉乳，加入α-CGTase固定化酶进行淀粉液化，再转入用装填有α-CGTase固定化酶的填充反应器中反应，转化液经超滤收集透出液；透出液经α-淀粉酶和糖化酶处理、活性炭脱色、反渗透膜浓缩、重结晶，过滤去除β-环糊精，母液再进一步经反渗透膜浓缩，结晶，过滤，烘干研磨即得注射级α-环糊精。本发明制得的固定化酶具有稳定性好、可以重复利用，且极易与产物、底物分离，酶的利用效率高、可连续操作及自动化控制，工艺简便，生产成本低等优点。采用无溶剂过程生产α-环糊精，生产设备简单，反应条件温和，能耗低，无溶剂残留污染，更加环保节能。
【专利说明】一种注射级Ct -环糊精的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学【技术领域】，具体涉及一种注射级α -环糊精的制备方法。
技术背景
[0002]环糊精是由环糊精葡萄糖基转移酶酶解淀粉或淀粉类基质产生的由D-吡喃型葡萄糖单元通过α-1，4-糖苷键连接而形成的一类环状低聚化合物。根据葡萄糖单元数目的不同，环糊精可以分为α _、β _、Y _、δ -环糊精等，其中最常见的是聚合度为6、7、8的α -、β Y _环糊精。
[0003]环糊精的立体结构是中空圆筒形，在它的圆筒内部有非极性的C3和C5上的氢以及通过醚键连接的氧原子，故圆筒内腔呈疏水性；而葡萄糖的C2和C3上的仲羟基位于圆筒的宽侧开口处，C6上的伯羟基位于圆筒的窄侧开口处，故圆筒外部呈亲水性。由于这种结构，使它具有容纳与其形状和大小适合的疏水性分子或基团嵌入圆筒内而形成包合物的特性。环糊精在包合物中作为“主分子”，在其圆筒内腔将其它物质作为“客分子”包合起来。这种包合物与 尿素和硫脲的分子与分子间晶格空洞形成的包合物不同，因环糊精形成的包合物是在空腔内，而不是在晶格中，所以它在水中溶解时，包合物仍然稳定，并不分裂。而且α-环糊精在水中的溶解度大(25°C达到127g/L)，且空腔较小，因此在药物包合中有着重要的作用，并广泛应用于食品、农业、化学工业等领域。
[0004]目前α-环糊精的生产主要采用酶法制备，菌种发酵后，从菌液中通过离心或者板框过滤分离得到α-环糊精葡萄糖基转移酶(a-CGTase )。同时将淀粉与水调浆制成淀粉乳后升温至90°C ±1°C糊化至固体状，再加入α-淀粉酶或者a-CGTase搅拌液化。液化后降温至50°C ±1°C，加入环糊精葡萄糖基转移酶和癸醇，搅拌反应生成α-环糊精-癸醇复合物。过滤除去滤液后，α-环糊精-癸醇复合物经过水蒸汽蒸馏去除癸醇，经过浓缩结晶干燥即得α-环糊精。在此工艺制备过程中，环糊精葡萄糖基转移酶在水溶液中不稳定，一次性使用难以回收利用，很难连续化生产，且在后续的反应过程中需要对其进行灭活，增加生产成本。在转化过程中，需要加入不同的有机溶剂，如癸醇等，使α-环糊精包合沉淀下来，再通过水蒸汽蒸馏去除癸醇，但由于癸醇的沸点高达229°C，很难从水溶液中去除。采用水蒸汽蒸馏法需高压饱和蒸汽蒸馏10至15小时，该法需使用高温高压手段，存在能耗过高、危险系数较大、操作复杂、费时(多达15h)、溶媒无法回收利用、有机溶剂易残留于样品中等缺点，为实验室分析和实际生产操作带来诸多不便。且国内在实际生产过程中，α -环糊精产品的质量较差，尚未有符合注射级药用标准产品的生产，不利于α -环糊精在医药产品的应用。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种注射级α -环糊精的制备方法，其采用环氧基树脂作为固定化载体得到稳定的a-CGTase固定化酶，并采用无溶剂方法制备α-环糊精，能够有效地克服现在技术中存在的能耗大，反应强烈，有机溶剂残留，产品质量低的问题。[0006]本发明所采取的技术方案为:
一种注射级α -环糊精的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
(a)a -CGTase产生菌的诱导表达:
a -CGTase产生菌经发酵培养后离心，收集上清液即为粗酶液；粗酶液经过超滤浓缩得到浓缩粗酶液；
(b)a -CGTase固定化酶的制备:
将环氧基树脂加入磷酸缓冲溶液浸泡至溶胀后，加入上述浓缩粗酶液，经振荡固定化反应后离心，弃去上清液，加入巯基乙醇封闭剩余的环氧基团，过滤，洗涤，直至洗出液无酶活性，即得a-CGTase固定化酶，4°C保存，备用；
(C)淀粉的液化:
在分批搅拌罐中加入淀粉制成淀粉乳，加入CaCl2后，调整pH，加入a -CGTase固定化酶并搅拌反应得到淀粉液化液；
Cd)淀粉的转化: 将a-CGTase固定化酶填充在填充反应柱中，两端用玻璃纤维塞隔离，拧紧两端旋帽使填充反应柱内部呈密封状态；将液化储罐中的淀粉液化液用恒流泵输入填充反应柱进行转化反应；得到的转化液经超滤，透过液为α-环糊精溶液，截留液继续打入填充反应柱进行转化反应；α -环糊精溶液加入固定化α -淀粉酶和固定化糖化酶反应，以除去未转化的淀粉，并改善转化液的滤过性；转化液通砂芯漏斗过滤回收固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶，滤液储存于储液罐中；
Ce)精制纯化:
滤液中加入活性炭搅拌后过滤，经反渗透膜浓缩，5°C~15°C搅拌，待β-环糊精重结晶后，过滤弃晶体，母液经过进一步反渗透膜浓缩至α -环糊精含量在40%~50%时，(TC~5°C搅拌结晶得α-环糊精，烘干研磨即得注射级α-环糊精。
[0007]步骤(a)中,所述a-CGTase产生菌为软化芽孢杆菌(ifeci77i/5.?acera/75.)、嗜热脂肪芽孢菌iB.Siearo?Α6?τ?ο/7ΑΗ".5)、产酸克雷伯氏菌{Klebsiella oxytoca )等,优选基因工程菌万.co7i现(DE3)/pet24a (+)(中国典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)。
[0008]步骤(b)中，所述环氧基载体为所有含有环氧基功能基的载体，优选环氧基树脂Eupergit C250L。
[0009]优选的，步骤(b)中，所述的环氧基树脂和酶在pH6~9的磷酸缓冲液中，4°C至室温反应2~24h，将酶固定于树脂上，制成固载量为10~200mg酶/g树脂。
[0010]优选的，步骤(C)中，液化反应控制ρΗ5.0~7.0，优选6.5，反应温度40°C~70°C，优选55°C，控制液化D.E值为2.5~4.5，优选3.0。
[0011]优选的，步骤(d)中所述填充反应柱的高径比为6~9，优选7.8;反应液流速为1.0ml/min~2.0ml/min,优选1.5ml/min ;反应温度30 V~50 °C,优选35 V ;反应时间IOmin~60min ;固定化α -淀粉酶与固定化糖化酶酶活比例为1:0.5~1:0.8，优选比例为1:0.7 ;添加量为投料淀粉量干重的0.03%~0.05%，优选的0.03%。
[0012]优选的，步骤(e)中，加入活性炭3%~8%，优选5% ;反渗透膜采用热性螺旋反渗透膜，截留分子量为150~300，操作压力为3.5~5.5MPa，工作温度为30°C~40°C，流速为20L/h。[0013]更进一步的，步骤(e)中，加入活性炭5%，反渗透膜采用热性螺旋反渗透膜，截留分子量为200，操作压力为4.0MPa，工作温度为35°C，流速为20L/h。
[0014]相对于现有技术，本发明具有以下优点:
1、本发明的环氧基树脂Eupergit C250l直径约100-250 μ m,具有化学、机械性能稳定，可长期存放的特点；具有较高的反应活性，可以和蛋白质上的氨基、巯基、羟基等集团反应形成稳定多点共价键；固定化后未反应的环氧基团易于使用巯基乙醇或二硫苏糖醇进行封闭等优点。目前还未有以Eupergit C250l固定化a -CGTase的报道。
[0015]2、本发明首次采用环氧基树脂作为固定化载体制备a -CGTase固定化酶，制得的固定化酶具有很好的化学稳定性且结构稳定、有很好的机械操作强度，可以反复重复利用，且极易与产物、底物分离，酶的利用效率高、可连续操作及自动化控制，工艺简便，生产成本低等优点。具体表现在以下几个方面:1)本发明将ΡΗ6.0~9.0的磷酸缓冲溶液预先浸泡Eupergit C25%，促进了载体对酶的吸附，并加快了固定化的反应历程以减少固定化造成的酶损失，本发明的酶活回收率为50%以上。2) a -CGTase经过固定化后稳定性明显提高，试验表明经过30个批次的重复使用，其相对酶活依然可达初始酶活的55%以上。固定化酶4°C保存14 个月后活力还在80%以上，说明固定化后a-CGTase有较好的贮存稳定性。3)与游离酶相比，使用固定化酶对底物进行转化，淀粉转化生成环糊精的时间明显缩短从原来的24h缩短到2~3h。
[0016]3、本发明采用无溶剂过程生产α-环糊精，采用固定化酶液化淀粉，通过填充式反应器进行转化反应，反应液通过超滤膜机组不断收集产品，并通过反渗透膜浓缩样品，低温结晶过滤后得到产品，整个反应过程条件温和，无任何有机溶剂，所用生产设备简单，可连续化生产。传统的添加有机溶剂的方法，需要液化罐、蒸馏罐、高效旋转蒸发薄膜器等，并要通往饱和的高压水蒸汽和1-癸醇，反应条件剧烈，能耗高，溶剂易残留污染。
[0017]4、本发明采用固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶处理反应液，一方面降解未转化的淀粉，同时增加了反应液的滤过性，另一方面避免反应过程中酶的灭活操作。精制过程中加入活性炭脱色，再经过0.45 μ m、0.22 μ m滤膜过滤，然后再进行反渗透系统进行浓缩，在5°C~15°C进行结晶过滤除去少量的β -环糊精，继续反渗透浓缩至40%~50%时，O~5°C进行结晶过滤制得α -环糊精，烘干研磨得最终成品，纯度达99.9%以上，满足美国药典USP36中注射级药用辅料α -环糊精的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0019]图1为本发明的工艺流程图。
[0020]图2为本发明的淀粉转化和精制纯化的原理示意图；
图中，I填充反应柱，2 a -CGTase固定化酶，3液化储罐，4超滤膜机组，5固定化淀粉酶与固定化糖化酶，6恒流泵，7反应釜，8砂芯漏斗，9反渗透膜机组，10结晶储罐，11储液罐。
[0021]图3为a -CGTase固定化酶操作稳定性实验的试验批次与酶活关系图。
[0022]图4为本发明的注射级α -环糊精的HPLC色谱图。
【具体实施方式】[0023]下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利。
[0024]实施例一:
步骤1:
取基因工程菌疋coli BL21 (DE3)/pet24a (+)(中国典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)接种于LB培养基中，30~37°C培养6~12h后，转至TB培养基中，30~37 °C培养2~6h后，加入0.01%的IPTG并降温至20~28 V培养30~36h得到发酵液。取发酵液，经高速冷冻离心机6000rpm离心20min后得上清液。取上清液按文献ASpectrophotometric Assay for the Cyclization Activity of Cyclomaltohexaose(a -Cyclodextrin) Glucanotransferase 方法测定酶活，以环化活力计为 50U/ml。
[0025]取上清液，调节超滤膜机组膜前压力为IMPa，膜后压力为0.4MPa，下进入超滤膜过滤系统(超滤膜截留孔径为10000)，工作温度30°C~40°C，水和一些小分子物质通过膜，而α-环糊精糖基转移酶被截留并返回料液罐进一步浓缩，直至料液呈浆状。检测其酶活为 50000U/ml。
[0026]步骤2:
称取IOg Eupergit C25tllj(多孔丙烯酸微球，由甲基丙烯酰氨，N, N,-亚甲基-双-(甲基丙烯酰氨)缩水甘油甲基丙烯酸酯形成的含有环氧官能团的聚合物，孔径为100~250 μ m，德国Rohm Pharma公司产品),加入pH6.5的磷酸缓冲液100mL浸泡至溶胀。加入步骤I中得到的浓缩粗酶液20ml ，30°C水浴摇床中反应6至15小时，摇床转速为50至200rpm。反应完成后，4000rpm离心20min,弃上清液,加入50ml 2%~5%的巯基乙醇封闭剩余的环氧基团，充分反应10~15h后过滤，磷酸缓冲液洗涤，冲洗巯基乙醇及游离的未固定的酶，直至洗出液无酶活性，即得固定化α-环糊精葡萄糖基转移酶，4°C保存。测定固定化后的α-环糊精葡萄糖基转移酶酶活，与原酶液对比，计算酶的酶活力回收率为55.54%。取固定化酶进行操作稳定性实验，结果如附图4所示，从图可以看出，经过30个批次的重复使用，其相对酶活依然可达初始酶活的55%以上。
[0027]步骤3:
取食品级马铃薯淀粉，加入水后调成浓度为15%的马铃薯淀粉乳，置于分批搅拌罐反应器中，加入0.02%的CaCl2，维持温度在40°C~55°C之间，加入步骤2中的固定化酶搅拌反应。当淀粉乳变澄清时，每隔IOmin取样检测液化淀粉的D.E值(反应液中还原糖量/干物质量)，检测结果如下表，当达到2.4~4.5时用碘显本色时即停止液化。经外观检查，马铃薯淀化液呈淡黄色，液化完全，流动性较好，无淀粉固体残留。经4000rpm离心20min后，上清液即为转化完全的马铃薯淀粉，固体即为回收的固定化酶，经磷酸缓冲液冲洗后于4°C保藏。
[0028]表1液化淀粉的D.E值检测结果表
【权利要求】
1.一种注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (a)a -CGTase产生菌的诱导表达: a-CGTase产生菌经发酵培养后离心，收集上清液即为粗酶液；粗酶液经过超滤浓缩得到浓缩粗酶液； (b)a -CGTase固定化酶的制备: 将环氧基树脂加入磷酸缓冲溶液浸泡至溶胀后，加入上述浓缩粗酶液，经振荡固定化反应后离心，弃去上清液，加入巯基乙醇封闭剩余的环氧基团，过滤，洗涤，直至洗出液无酶活性，即得a-CGTase固定化酶，4°C保存，备用； (C)淀粉的液化: 在分批搅拌罐中加入淀粉制成淀粉乳，加入CaCl2后，调整pH，加入a -CGTase固定化酶并搅拌反应得到淀粉液化液； Cd)淀粉的转化: 将a-CGTase固定化酶填充在填充反应柱中，两端用玻璃纤维塞隔离，拧紧两端旋帽使填充反应柱内部呈密封状态；将液化储罐中的淀粉液化液用恒流泵输入填充反应柱进行转化反应；得到的转化液经超滤，透过液为α-环糊精溶液，截留液继续打入填充反应柱进行转化反应；α -环糊精溶液加入固定化α -淀粉酶和固定化糖化酶反应，以除去未转化的淀粉，并改善转化液的滤过性；转化液通砂芯漏斗过滤回收固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶，滤液储存于储液罐中； Ce)精制纯化: 滤液中加入活性炭搅拌后过滤，经反渗透膜浓缩，5°C~15°C搅拌，待β-环糊精重结晶后，过滤弃晶体，母液经过进一步反渗透膜浓缩至α -环糊精含量在40%~50%时，(TC~5°C搅拌结晶得α-环糊精，烘干研磨即得注射级α-环糊精。
2.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，所述α -CGTase产生菌为软化芽孢杆菌iBaciIlus macerans )、嗜热脂肪芽孢菌(B.StearothermophiIus)或产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
3.根据权利要求2所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，所述a-CGTase产生菌为基因工程菌疋co7i BL21 (DE3Vpet24a (W，中国典型微生物保藏中心保藏，保藏号:CCTCCM208063。
4.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(b)中，所述环氧基载体为环氧基树脂Eupergit C25tllj。
5.根据权利要求4所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(b)，所述的环氧基树脂和酶在PH6~9的磷酸缓冲液中，4°C至室温反应2~24h，将酶固定于树脂上，制成固载量为10~200mg酶/g树脂。
6.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(c)中，液化反应控制ΡΗ5.0~7.0，反应温度40°C~70°C，控制液化D.E值为2.5~4.5。
7.根据权利要求6所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(C)中，液化反应控制ΡΗ6.5，反应温度55°C，控制液化D.E值为3.0。
8.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(d)中，所述填充反应柱的高径比为6~9,反应液流速为1.0ml/min~2.0ml/min,反应温度30°C~50°C，反应时间IOmin~60min，固定化α -淀粉酶与固定化糖化酶的加入量为投料淀粉量干重的0.03%~0.05%，其中固定化α -淀粉酶与固定化糖化酶的酶活比为1:0.5~1:0.8。
9.根据权利要求1所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(e)中，加入活性炭3%~8% ;反渗透膜采用热性螺旋反渗透膜，截留分子量为150~300，操作压力为.3.5~5.5MPa，工作温度为30°C~40°C，流速为20L/h。
10.根据权利要求9所述的注射级α-环糊精的制备方法，其特征在于:步骤(e)中，加入活性炭5%，反渗透膜采用热性螺旋反渗透膜，截留分子量为200，操作压力为4.0MPa，工作温度为35°C，流速为20L/h。
【文档编号】C12P19/04GK103981238SQ201410248930
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】张颖, 刘鹏, 姜寿俊, 孙健, 高国锐, 刘元鑫, 孙剑峰, 王学斌, 葛庆燕, 闫飞, 刘骏, 郭凤霞, 徐丹 申请人:济南康和医药科技有限公司
最新回复(0)