一种ssr核心引物组及其鉴定茶树品种的方法
一种ssr核心引物组及其鉴定茶树品种的方法
【专利摘要】一种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法，属于生物【技术领域】。其特征在于包括：（1）材料选取；（2）基因组DNA提取；（3）目标产物的PCR扩增；（4）PCR产物的电泳分离；（5）银染显色；（6）数据分析；（7）结果判定。上述一种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法，具有操作简便、结果准确、重复性强、鉴别能力强和成本低等特点，适合用于茶树品种的鉴定。
【专利说明】—种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体为一种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法。【背景技术】
[0002]茶是我国重要的经济作物，截至2010年底，我国共有国家级审定品种121个，省级审定品种100余个。实现每个品种间的有效鉴定，有助于保护品种权、防止假冒伪劣或者不纯的品种进入市场。目前，通常根据茶树品种间的形态学差异进行品种鉴别，但是不同立地条件下同一品种可能会表现出某些性状的差异，不同品种间也可能有某些性状比较相似，根据形态学差异很难获得准确的结论。而茶树新品种特异性、一致性和稳定性(简称DUS)测试能够准确鉴别不同的茶树品种，但需要测试植株、新稍、叶片等35个性状，费时费力。目前茶树品种鉴定中存在的工作量大、效率低且鉴定结果准确性差等问题。
[0003]分子标记技术近年来被广泛应用于植物的种质资源鉴别领域，其中，SSR标记具有重复性好、多态性高、共显性、易于检测、鉴别能力强和不受环境条件影响等优点，是一种行之有效的品种鉴别手段。目前，在玉 米和水稻中，我国已经颁布了基于SSR标记的品种鉴定技术国家标准。因此，SSR技术在茶树品种保护、假品种判别、纯度检测和品系鉴定领域具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法的技术方案，结合差异引物对的数量和品种间的遗传距离两个指标，对茶树品种进行鉴定，能够提高鉴定的效率和准确率，具有操作简便、结果准确、重复性强、鉴别能力强和成本低等特点，适合用于茶树品种的鉴定。
[0005]所述的一种SSR核心引物组，其特征在于包括10对核心鉴定引物、24对备用鉴定引物，所述的 10 对核心鉴定引物为 1057、1604、1622、1624、1633、1651、1696、5053、5077、5094，如表1所示；所述的24对备用鉴定引物为1052、1056、1058、1088、1605、1608、1616、1628、1639、1683、1701、3011、3110、4012、4042、4048、4102、5033、5043、5062、5082、 5091、5102、5110，如表2所示；
表1 10对核心鉴定引物信息
【权利要求】
1.一种SSR核心引物组，其特征在于包括10对核心鉴定引物、24对备用鉴定引物，所述的 10 对核心鉴定引物为 1057、1604、1622、1624、1633、1651、1696、5053、5077、5094，如表I所示；所述的 24 对备用鉴定引物为 1052、1056、1058、1088、1605、1608、1616、1628、1639、1683、1701、3011、3110、4012、4042、4048、4102、5033、5043、5062、5082、 5091、5102、5110，如表2所示； 表1 10对核心鉴定引物信息
2.使用权利要求1所述的SSR核心引物组鉴定荼树品种的方法，其特征在于包括以下步骤: O以不同品种荼树的嫩叶为材料； 2)荼树基因组DNA的提取； 3)目标产物的PCR扩增:①以步骤2)所得基因组DNA为模板； ②使用10对核心鉴定引物进行PCR扩增； ③使用IOyLPCR反应体系，具体包括:上游和下游引物各0.2 μ L，IOXBuffer (Mg2+plus) I μ L, dNTP 0.2 μ L, rTaq 酶 0.5U,加 ddH20 至 10 μ L ; ④PCR反应程序为:首先，94-95°C变性2-4分钟；然后，按照如下程序进行30个循环:94-95°C变性 25-35 秒、55-60。。退火 25-30 秒、72°C延伸 25-30 秒；然后，72°C延伸 2-4 分钟；最后，3-5°C保存； 4)PCR产物的电泳分离 ①在步骤3)所得PCR反应产物中，加入2-3μ L6 X loading buffer,混匀； ②用移液器吸2-3μ L混合液加到配制好的10%聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中； ③160-180V电压，电泳110-130分钟； 5)银染显色 ①步骤4)结束后，小心取下胶片，放入染色专用的塑料盒中； ②加400-450mL固定液，摇床65_75rpm震荡5_7分钟，倒出固定液，蒸馏水冲洗2_3次； ③加350-450mL染色液，65_75rpm震荡8_12分钟，倒出AgN03溶液，蒸馏水冲洗2_3次； ④加400-450mL显色液，70-75rpm振荡至条带清晰可见，用蒸馏水冲洗2_3次； ⑤拍照记录； 6)数据分析 ①人工判读电泳图上的条带，由大到小按A、B、C、D、E等依次赋值，缺失条带以.”表示，制成基因型矩阵； ②比对品种间的核心鉴定引物差异对数； ③使用Popgene软件计算遗传距离； ④使用Mega5.0软件构建聚类图； 7)结果判定 当两个品种的核心鉴定引物差异对数> 2时，判定为不同品种，形成判定结果；当两个品种的核心鉴定引物差异对数< I时，判定为相同品种或极相似品种，此时，应按照研究者的需要引入24对备用鉴定引物，进行以上3)、4)、5)、6)步骤，并综合10对核心鉴定引物的数据计算遗传距离进行判别，当两个品种遗传距离>0.140判定为不同品种，遗传距离(0.140判定为同一品种。
3.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤2)中茶树基因组DNA的提取采用以下方法: 1)取100mg茶树嫩叶，加液氮研磨； 2)使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取茶树基因组DNA； 3)使用分光光度计测定基因组DNA浓度，使用ddH20稀释到28-32ng/μ L，在_20°C保存备用。
4.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤3)的④PCR反应程序中:首先，94-95°C变性3分钟；然后，按照如下程序进行30个循环:94_95°C变性28-30秒、56-58°C退火28秒、72°C延伸26-28秒；然后，72°C延伸3分钟；最后，4°C保存。
5.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤4)的③中:电压为170V，电泳时间为120分钟。
6.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤5)的②中:所述的固定液按照100mL乙醇溶液、5mL冰醋酸、加蒸懼水定容至I L配制。
7.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤5)的③中:所述染色液按照2g AgNO3加蒸懼水定容至IL配制。
8.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤5)的④中:所述显色液按照15g NaOH溶液并加入5mL 37%甲醒加蒸懼水定容至I L配制。
【文档编号】C12Q1/68GK104004756SQ201410249326
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】张成才, 成浩, 王丽鸳, 韦康, 吴立赟, 刘圆 申请人:中国农业科学院茶叶研究所
【专利摘要】一种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法，属于生物【技术领域】。其特征在于包括：（1）材料选取；（2）基因组DNA提取；（3）目标产物的PCR扩增；（4）PCR产物的电泳分离；（5）银染显色；（6）数据分析；（7）结果判定。上述一种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法，具有操作简便、结果准确、重复性强、鉴别能力强和成本低等特点，适合用于茶树品种的鉴定。
【专利说明】—种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体为一种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法。【背景技术】
[0002]茶是我国重要的经济作物，截至2010年底，我国共有国家级审定品种121个，省级审定品种100余个。实现每个品种间的有效鉴定，有助于保护品种权、防止假冒伪劣或者不纯的品种进入市场。目前，通常根据茶树品种间的形态学差异进行品种鉴别，但是不同立地条件下同一品种可能会表现出某些性状的差异，不同品种间也可能有某些性状比较相似，根据形态学差异很难获得准确的结论。而茶树新品种特异性、一致性和稳定性(简称DUS)测试能够准确鉴别不同的茶树品种，但需要测试植株、新稍、叶片等35个性状，费时费力。目前茶树品种鉴定中存在的工作量大、效率低且鉴定结果准确性差等问题。
[0003]分子标记技术近年来被广泛应用于植物的种质资源鉴别领域，其中，SSR标记具有重复性好、多态性高、共显性、易于检测、鉴别能力强和不受环境条件影响等优点，是一种行之有效的品种鉴别手段。目前，在玉 米和水稻中，我国已经颁布了基于SSR标记的品种鉴定技术国家标准。因此，SSR技术在茶树品种保护、假品种判别、纯度检测和品系鉴定领域具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种SSR核心引物组及其鉴定茶树品种的方法的技术方案，结合差异引物对的数量和品种间的遗传距离两个指标，对茶树品种进行鉴定，能够提高鉴定的效率和准确率，具有操作简便、结果准确、重复性强、鉴别能力强和成本低等特点，适合用于茶树品种的鉴定。
[0005]所述的一种SSR核心引物组，其特征在于包括10对核心鉴定引物、24对备用鉴定引物，所述的 10 对核心鉴定引物为 1057、1604、1622、1624、1633、1651、1696、5053、5077、5094，如表1所示；所述的24对备用鉴定引物为1052、1056、1058、1088、1605、1608、1616、1628、1639、1683、1701、3011、3110、4012、4042、4048、4102、5033、5043、5062、5082、 5091、5102、5110，如表2所示；
表1 10对核心鉴定引物信息
【权利要求】
1.一种SSR核心引物组，其特征在于包括10对核心鉴定引物、24对备用鉴定引物，所述的 10 对核心鉴定引物为 1057、1604、1622、1624、1633、1651、1696、5053、5077、5094，如表I所示；所述的 24 对备用鉴定引物为 1052、1056、1058、1088、1605、1608、1616、1628、1639、1683、1701、3011、3110、4012、4042、4048、4102、5033、5043、5062、5082、 5091、5102、5110，如表2所示； 表1 10对核心鉴定引物信息
2.使用权利要求1所述的SSR核心引物组鉴定荼树品种的方法，其特征在于包括以下步骤: O以不同品种荼树的嫩叶为材料； 2)荼树基因组DNA的提取； 3)目标产物的PCR扩增:①以步骤2)所得基因组DNA为模板； ②使用10对核心鉴定引物进行PCR扩增； ③使用IOyLPCR反应体系，具体包括:上游和下游引物各0.2 μ L，IOXBuffer (Mg2+plus) I μ L, dNTP 0.2 μ L, rTaq 酶 0.5U,加 ddH20 至 10 μ L ; ④PCR反应程序为:首先，94-95°C变性2-4分钟；然后，按照如下程序进行30个循环:94-95°C变性 25-35 秒、55-60。。退火 25-30 秒、72°C延伸 25-30 秒；然后，72°C延伸 2-4 分钟；最后，3-5°C保存； 4)PCR产物的电泳分离 ①在步骤3)所得PCR反应产物中，加入2-3μ L6 X loading buffer,混匀； ②用移液器吸2-3μ L混合液加到配制好的10%聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中； ③160-180V电压，电泳110-130分钟； 5)银染显色 ①步骤4)结束后，小心取下胶片，放入染色专用的塑料盒中； ②加400-450mL固定液，摇床65_75rpm震荡5_7分钟，倒出固定液，蒸馏水冲洗2_3次； ③加350-450mL染色液，65_75rpm震荡8_12分钟，倒出AgN03溶液，蒸馏水冲洗2_3次； ④加400-450mL显色液，70-75rpm振荡至条带清晰可见，用蒸馏水冲洗2_3次； ⑤拍照记录； 6)数据分析 ①人工判读电泳图上的条带，由大到小按A、B、C、D、E等依次赋值，缺失条带以.”表示，制成基因型矩阵； ②比对品种间的核心鉴定引物差异对数； ③使用Popgene软件计算遗传距离； ④使用Mega5.0软件构建聚类图； 7)结果判定 当两个品种的核心鉴定引物差异对数> 2时，判定为不同品种，形成判定结果；当两个品种的核心鉴定引物差异对数< I时，判定为相同品种或极相似品种，此时，应按照研究者的需要引入24对备用鉴定引物，进行以上3)、4)、5)、6)步骤，并综合10对核心鉴定引物的数据计算遗传距离进行判别，当两个品种遗传距离>0.140判定为不同品种，遗传距离(0.140判定为同一品种。
3.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤2)中茶树基因组DNA的提取采用以下方法: 1)取100mg茶树嫩叶，加液氮研磨； 2)使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取茶树基因组DNA； 3)使用分光光度计测定基因组DNA浓度，使用ddH20稀释到28-32ng/μ L，在_20°C保存备用。
4.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤3)的④PCR反应程序中:首先，94-95°C变性3分钟；然后，按照如下程序进行30个循环:94_95°C变性28-30秒、56-58°C退火28秒、72°C延伸26-28秒；然后，72°C延伸3分钟；最后，4°C保存。
5.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤4)的③中:电压为170V，电泳时间为120分钟。
6.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤5)的②中:所述的固定液按照100mL乙醇溶液、5mL冰醋酸、加蒸懼水定容至I L配制。
7.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤5)的③中:所述染色液按照2g AgNO3加蒸懼水定容至IL配制。
8.如权利要求2所述的SSR核心引物组鉴定茶树品种的方法，其特征在于步骤5)的④中:所述显色液按照15g NaOH溶液并加入5mL 37%甲醒加蒸懼水定容至I L配制。
【文档编号】C12Q1/68GK104004756SQ201410249326
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】张成才, 成浩, 王丽鸳, 韦康, 吴立赟, 刘圆 申请人:中国农业科学院茶叶研究所
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