基于连接酶反应的杂交高通量dna测序方法

xiaoxiao2020-6-24  3

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基于连接酶反应的杂交高通量dna测序方法
【专利摘要】本发明属生物技术和医学领域,涉及一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,能克服传统的杂交测序方法假阳性高的缺陷,并解决现有方法探针合成量大、成本高昂、杂交探针短等问题,实现高通量,低成本,高灵敏度和快速测定短片段DNA序列。
【专利说明】基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DNA测序方法,具体是一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测 序方法。

【背景技术】
[0002] 当前正在发展的新型DNA测序技术主要集中在非电泳的手段上。从总体上来看, 这类技术可以分成四大类:第一类是合成测序,在碱基加入到延伸的DNA链的过程中进行 检测;第二类是杂交测序法,通过制备一组高密度寡核昔酸微阵列芯片的杂交信号,进行目 标基因的序列鉴定;第三类为分子影像技术,一系列可以在单分子的水平上进行测序的技 术;最后一类技术是诱导DNA分子蜿蜒通过非常细微的小孔,在这个过程当中借助于电子 学或者光学的方法对碱基进行读出,也称作纳米孔测序。
[0003] 传统的杂交测序方法,是把一系列长度为K个碱基共4k条序列固定在芯片上,然 后把标记的待测DNA模板去杂交,通过检测杂交信号来确定该序列的杂交序列谱。如果要 测定长DNA序列,那么需要合成的探针需要量很大,成本倍数增加。更重要的是该方法有假 阳性商的缺点。
[0004] 我们之前公开的的"一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法"(专利号: ZL200710131536),先把待测模板固定于芯片上,然后用一套杂交探针进行杂交,同时加入 DNA聚合酶引物荧光标记的碱基同,达到平行地测定大批量的DNA序列。但是该方法仍然存 在一些缺点:DNA聚合酶对未端倒数第五个碱基开始的识别能力比较差。


【发明内容】

[0005] 本发明提供一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,目的是克服传统的 杂交测序方法假阳性高的缺陷,并解决现有方法探针合成量大、成本高昂、杂交探针短等问 题,实现高通量,低成本,高灵敏度和快速测定短片段DNA序列。
[0006] 本发明是以如下技术方案实现的:一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方 法,确定未知DNA模板的碱基信息是通过DNA模板与多条探针平行杂交并连接标记的探针, 通过检测是否有标记物连接,根据碱基互补原理确定未知DNA模板是否有对应的四个或四 个以上连续碱基的信息;即通过对DNA模板重复"杂交一连接一检测"步骤来实现,能够解 决假阳性及成本高的问题。即DNA序列确定是通过一末端为已知碱基的DNA杂交引物平行 地与待测DNA序列经过多次连接、洗脱、检测来实现,包括如下步骤:
[0007] 步骤1)连接:混合DNA杂交引物中的一条与一套标记DNA探针及连接缓冲液,在 连接酶的作用下,在DNA杂交引物的确定碱基末端连接上标记DNA探针;通过芯片扫描仪读 取延伸碱基的信息,确定未知DNA模板上的包含数个碱基的序列;
[0008] 步骤2)变性洗脱:用DNA变性试剂把待测DNA恢复单链DNA状态;
[0009] 步骤3)重复:再将另一末端已知碱基序列不同的DNA杂交引物按步骤1)与未知 DNA模板杂交并进行步骤2),确定未知DNA模板上的包含数个碱基的不同序列;用不同的 DNA杂交引物重复上述过程,直到完成DNA序列测。
[0010] 所述的确定未知DNA模板的DNA序列是根据DNA杂交引物己知碱基和所连接的 DNA荧光探针,通过碱基互补原理确定。
[0011] 所述的DNA杂交引物是指能和且只能和所有DNA模板中的一段通用特定序列杂交 的寡核酸片段。在DNA模板制备过程中,通过连接或者在扩增过程中引入与特定的DNA杂 交引物互补的一段通用序列,其中引入的该段通用序列应与模板中任何一段序列片段有区 另IJ,即模板中只有该段通用序列能够与该特定的DNA杂交引物实现杂交。
[0012] 所述的杂交DNA引物,其中有一末端的3个或3个以上碱基为已知碱基,优选3个 至5个,最优选4个;另一端带有1个或以上碱基,其中碱基为四种碱基中不限定的任意一 种,或者用通用碱基dl代替;优选1至5个。在最优选的情况下,即一末端为四个已知碱基, DNA杂交引物序列特征可以5'(N)nXYZK3'表示,其中为N为四种碱基T,A,G,C中不限定的 任意一种,或者可用通用碱基工来代替,η为2-4的整数;X,Y,Z,K均是选自T,A,G,C中的 确定的一种碱基。如此,序列XYZK有4 4 = 256种不同组合,即本发明所述的方法,最少可 以在合成256种不同DNA杂交引物的条件下实现。
[0013] 所述的未知DNA模板,是指通过常规的PCR,滚环扩增、固相扩增以及桥式扩增等 增加基因组中感兴趣的目的序列量的方法扩增后的待测DNA序列或其序列片断。扩增可以 是单重的,即一次扩增一个目的片断,也可以是多重的,即一次扩增多个目的片断。未知DNA 模板通过化学或者物理方法可以固定在平面基片上,也可以固定在"96, 384孔板"或者各种 修饰的珠子等载体上,还可以同时固定多个DNA模板,也包括固定单个DNA模板。
[0014] 探针标记采用常规方法,连接反应采用己知的通用方法,即在缓冲液中,加入四种 不同的标记DNA探针,在连接酶的作用下,在25°C条件下连接10-15分钟,使DNA杂交引物 的末端连接上标记的探针。
[0015] 所述的标记DNA探针,是指一段DNA序列上上包含可以直接或者间接检测的基团 或者粒子。可检测的基团或者粒子,即标记物,如修饰荧光基团,生物素和量子点,或者不 修饰的单体在反应中产生的光信号。所述的标记DNA探针可以是单色的,即DNA探针均标记 相同的标记物,也可以是多色的,即不同的DNA探针标记不相同或者不完全相同的标记物。
[0016] 所述的连接是指DNA杂交引物及标记DNA探针与待测模板互补配对时,在连接酶 作用下DNA杂交引物与标记DNA探针之间的连接成一条更长的DNA链。
[0017] 完成某一待测点上DNA序列中的数个碱基序列的测定后,可以将DNA杂交引物从 未知DNA模板中用变性液洗脱。所述的变性液中含有尿素、NaOH、乙二醇、丙三醇和甲酞胺 等能降低DNA变性温度的组分。
[0018] DNA杂交引物从DNA模板中分离后,可重复步骤1)至步骤2)的方法,将另一 DNA 杂交引物与未知DNA模板杂交,标记DNA探针连接,并读出待测点上未知DNA序列的碱基序 列信息。以不同的DNA杂交引物,循环上述"杂交一连接一检测"过程,直到测出未知DNA模 板的序列谱,或4 K种(K为DNA杂交引物末端已知碱基的数目)DNA杂交引物都经过上述步 骤,完成DNA序列测定。
[0019] 有益效果:本发明与现有技术相比,具有如下优点:
[0020] 1.本发明的最大优点是正确性可靠。在传统的杂交测序方法中,如果末端有一个 或多个碱基错配,也有可能读出信号,但是读出的信号是错误的。而本发明的方法,只读' 末端的最后几个碱基,而且加上连接一步(连接酶对末端错配碱基非常敏感)大大增加了 正确性。
[0021] 2.本发明的测序方法成本低,最少只需要合成4K条普通DNA杂交引物(每条长度 6-10个碱基左右)、普通的连接酶、荧光标记的探针及芯片扫描仪,就可以进行大规模DNA 序列测定。
[0022] 3.本发明可实现高通量DNA测序。通过polony或乳液PCR等方法制得的高密度 DNA芯片,利用基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,很容易读出这些芯片上的序 列。
[0023] 本发明所提出的方法,由于加入连接一步,可解决假阳性及成本高的问题。而且应 用在芯片上进行杂交延伸测序,可达到高通量水平。此外本发明不需通过破坏或者切割标 记物的方法清除DNA杂交引物,可建立快速、准确、便宜的基因组序列测定方法。
[0024] 以下将结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述。

【专利附图】

【附图说明】
[0025] 图1是本发明DNA测序方法的示意图;
[0026] 其中:1为未知DNA模板;2为杂交引物;3为荧光标记DNA探针;4为基片; i,j,k,1,m分别为芯片上的待测点。
[0027] 图2为DNA序列拼接示意图;
[0028] 其中:4为基片;1为固定在基片上的未知DNA模板,2为DNA杂交引物;3为连接 的带标记DNA探针;e为经过拼接得到的序列。
[0029] 根据DNA杂交引物结构不同,选择不同的标记DNA探针形式。
[0030] 若DNA杂交引物是这种结构:5' p-

【权利要求】
1. 一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在于确定未知DNA模板 的碱基信息是通过DNA模板与多条探针平行杂交并连接标记的探针,通过检测是否有标记 物连接,根据碱基互补原理确定未知DNA模板是否有对应的四个或四个以上连续碱基的信 息;即通过对DNA模板重复"杂交一连接一检测"步骤来实现;即DNA序列确定是通过一套 一未端含有1个或以上确定己知碱基的DNA杂交引物与一套标记DNA探针在连接酶的作用 下平行地与待测DNA序列经过多轮连接、检测来实现,包括如下步骤: 步骤1)连接:混合DNA杂交引物中的一条与一套标记DNA探针及连接缓冲液,在连接 酶的作用下,在DNA杂交引物的确定碱基末端连接上标记DNA探针;通过检测信号强度读取 连接探针的信息,确定未知DNA模板上的包含数个碱基的序列; 步骤2)变性洗脱:用DNA变性试剂把待测DNA恢复单链DNA状态; 步骤3)重复:再将另一末端已知碱基序列不同的DNA杂交引物按步骤1)与未知DNA 模板杂交并进行步骤2),确定未知DNA模板上的包含数个碱基的不同序列;用不同的DNA 杂交引物重复上述过程,直到完成DNA序列测定; 所述的确定未知DNA模板的DNA序列是根据DNA杂交引物己知碱基和所连接的DNA荧 光探针,通过碱基互补原理确定。
2. 根据权利要求1所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在于所 述的DNA杂交引物,一末端为1个或1个以上已知碱基,另端带有若干个随机碱基,同时为 使连接反应能顺利进行,根据已知碱基的位置决定5'未端是否需要磷酸化修饰。
3. 根据权利要求2所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在于,所 述的已知碱基为四种碱基dT,dA,dG,dC中的任意一种,但序列是已知。
4. 根据权利要求2所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在于,所 述随机碱基,其单链寡核苷酸DNA片段,若干个简并碱基用能够与正常碱基形成氢键的其 它碱基或者碱基类似物构成,但序列是未知。
5. 根据权利要求1或2所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在 于,所述DNA杂交引物,如果已知碱基未端为5'未端,为使连接反应能进行则该未端含有磷 酸基团;如果确定碱基未端为3'未端,为使连接反应能进行则该未端含羟基基团且5'未端 为非磷酸基团。
6. 根据权利要求1所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在于所 述的标记DNA探针,其DNA探针上非连接未端包含可以直接或者间接检测的基团或者粒子。
7. 根据权利要求1或6所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在 于所述的标记DNA探针,其序列中含有至少1个确定的碱基即在确定位置上分别含有A、G、 C、T四种碱基之一,或者不同碱基的任意组合和若干个随机组合的能跟任意目标序列互补 配对的简并碱基N即每个位置均包含能够与四个碱基互补配对的碱基组合构成;若干个简 并碱基用能够与正常碱基形成氢键的其它碱基或者碱基类似物构成。
8. 根据权利要求1或6所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在 于,所述的可检测的基团或者粒子,为修饰荧光基团、生物素或量子点,或者不修饰的单体 在反应中产生的光信号。
9. 根据权利要求1所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法,其特征在于待 分析的未知模板DNA,通过化学或者物理方法固定在平面基片、"96、384孔板"或者各种修 饰的珠子等载体上;未知单链DNA模板可以通过常规的PCR,滚环扩增、固相扩增、桥式扩增 以及固相酶连接反应的方法增加其分析用数量,扩增是单重的,即一次扩增一个目的片断, 或是多重的,即一次扩增多个目的片断。
10.根据权利要求1所述的DNA测序方法,其特征在于所述的变性试剂中含有能降低 DNA变性温度的尿素、NaOH、乙二醇、丙三醇或甲酞胺组分。
【文档编号】C12Q1/68GK104152544SQ201410249829
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】李燕强, 郭羽白, 潘志强, 曹君利 申请人:徐州医学院

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