检测a型和b型流感病毒、人偏肺病毒，nl63型、hku1型和oc43型人冠状病毒的试剂盒及检...的制作方法
检测a型和b型流感病毒、人偏肺病毒，nl63型、hku1型和oc43型人冠状病毒的试剂盒及检 ...的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，包括病原体特异性引物和病原体基因探针。本发明的上述检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
【专利说明】检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和 0C43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测试剂盒【技术领域】，具体涉及一种检测A型和B型流感病毒、人 偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是一种有囊膜的负链RNA病毒，属于正粘病毒科。流感病毒根据其核蛋 白和基质蛋白抗原性的不同，可以将其分为A、B、C三个分型，目前感染人的主要是A、B分 型。A、B型流感病毒基因组分为8个节段，为单链、负链的RNA，分别编码至少10种以上的 蛋白。A型流感病毒根据其表面细胞凝集素（HA)和神经氨酸苷酶（NA)抗原性的不同，可以 分为1-16种HA亚型和1-9种NA亚型。A型流感病毒可以感染多种动物，例如猪、鸟类、禽 类和人，A型流感病毒极易发生变异，并且传染力极强，B型流感病毒一般只感染人类。
[0003] 人偏肺病毒是一种比较常见的呼吸道感染病原体，在引起急性呼吸道疾病的所有 病原体中，人偏肺病毒占3. 9-18%，一般会引起下呼吸道感染，症状主要是咳嗽、流涕和发 热等。
[0004] 冠状病毒是一类有包膜的正链RNA病毒，在巢状病毒目里属于冠状病毒科，会引 起呼吸道疾病。目前，已被发现的冠状病毒有五种，分别是〇C43、229E、SARS、NL63和HKU1。 冠状病毒约占所有呼吸道疾病病原体的1/3,是引起呼吸道疾病最常见的一类病原体。
[0005] A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒NL63型、0C43型和HKU1型冠状病毒都是 呼吸道病原体；而呼吸道感染症候群病原体的诊断可以分为传统方法和分子生物学方法。 传统的检测方法一般有病毒分离、血清学诊断、液相芯片分析技术和酶联免疫反应等。随 着分子生物学技术的快速发展，越来越多的呼吸道病原体检测手段趋向于采用分子生物 鉴别中，比如 PCR、RT_PCR、Multiplex RT_PCR、MDD(molecular differential diagnoses，分 子鉴别诊断）、Real-time RT_PCR、Duplex real time PCR等等。这些方法各有优缺点，比如 PCR、RT-PCR只针对某个病原体单个型别和亚型的分子甄别，而Multiplex RT-PCR虽然能完 成几个病毒型别和亚型的分子甄别。其中发展最快的是Real-time PCR。Real-time PCR是 一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Real-time PCR灵敏度高、特异性强、操作方便，目 前已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。
[0006] 但是在实临床中，引起感染症状的病原体可能多达几十种，如果采用传统单一的 Real-time PCR方法，则要重复多次对每一种病原体进行PCR反应，工作量巨大，耗时较长， 很可能会耽误控制疾病蔓延的时机。因此多重荧光定量PCR是一种快速有效的检测多重呼 吸道疾病的方法。2006年，旅美华人韩健博士发明了 Tem-PCR(Target enriched multiplex PCR，靶序列富集多重PCR技术）能在一次反应中对多重靶序列进行高灵敏度和特异性的扩 增和检测，实现了一次PCR可以检测几种病原体。但Tem-PCR仍有一些不足之处，有待改进， 例如灵敏度略低于real-time PCR，扩增时间较传统PCR长，检测时打开PCR反应管盖会造 成实验室污染和假阳性，以及靶基因的检测和扩增尚未一体化等。因此，在A型流感病毒、 B型流感病毒、人偏肺病毒NL63型、0C43型和HKU1型冠状病毒等呼吸道病原体的检测中并 无能够一次直接快速精确检测的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种检测时长只需2个 小时左右、操作方便、成本低、杜绝交叉污染，并能突破常规PCR仪器荧光检测通道限制实 现一次同时检测A和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病 毒的试剂盒及检测方法。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0009] 一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病 毒的试剂盒，包括病原体特异性引物和病原体基因探针；
[0010] 所述病原体特异性引物包括：
[0011] A 型流感病毒上游引物：5' -GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3' ；
[0012] A 型流感病毒下游引物：5' -GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3' ；
[0013] B 型流感病毒上游引物：5' -TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG3' ；
[0014] B 型流感病毒下游引物：5' -CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3' ；
[0015] 人偏肺病毒上游引物：5' -CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3' ；
[0016] 人偏肺病毒下游引物：5' -CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG-3' ；
[0017] NL63 型人冠状病毒上游引物：5' -GGCCATAAGATTGCTACTCGTG-3' ；
[0018] NL63 型人冠状病毒下游引物：5' -CTCCTGAGAGGCAACACCA-3' ；
[0019] HKU1 型人冠状病毒上游引物：5' -ATTCACTGTGTCTACTCAACCAC-3' ；
[0020] HKU1 型人冠状病毒下游引物：5' -CCGAAAGCAATGGGAACTCC-3' ；
[0021] 0C43 型人冠状病毒上游引物：5' -GGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGG-3' ；
[0022] 0C43 型人冠状病毒下游引物：5' -TGGCTCTACTACGCGATCCT-3' ；
[0023] 所述病原体基因探针包括：
[0024] A型流感病毒基因探针
[0025] 5, -TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3,；
[0026] B型流感病毒基因探针
[0027] 5' -CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-3' ；
[0028] 人偏肺病毒基因探针
[0029] 5, -TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-3,；
[0030] NL63型人冠状病毒基因探针
[0031] 5' -GAATGCCCAACCAGTCTGGC-3' ；
[0032] HKU1型人冠状病毒基因探针
[0033] 5, -ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-3,；
[0034] 0C43型人冠状病毒基因探针
[0035] 5 ' -GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-3 '。
[0036] 本发明的上述检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和 0C43型人冠状病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设 计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的 TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和 检测灵敏度低的问题。
[0037] 针对上述现有技术的缺陷，本发明进一步还提出一种利用检测A型和B型流感病 毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒进行检测的方法，包括如下 步骤：
[0038] 提取病患标样中的病原体核酸；
[0039] 将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾；
[0040] 将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基 因探针上标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相 同；
[0041] 将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异 性引物混合、并添加缓冲液制成混合反应系；
[0042] 将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。
[0043] 而且采用本发明的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒试剂盒进行检测的方法，以试剂盒为基础，采用荧光对探针进行多色组合探 针编码，替代现有的单色荧光标记探针方法，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从 而提高实时PCR单管中能够检测的靶的数目；然后进一步在检测过程中用特异性引物同源 加尾通用引物形成加尾引物进行RT-PCR反应，且特异性引物设计其两端存在互补tag序 列，因此引物的各单链两端互补会各自形成一个稳定的发夹结构，而不会随着PCR过程的 进行成为通用引物扩增的模板，从而大大的降低了引物二聚体的产生；不仅可以同时进行 检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒；而且提升 了反应效率，也使得用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决 了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0045] 图1为本发明实施例阳性对照检测中PCR循环中六重荧光标记的扩增曲线；
[0046] 图2为本发明实施例阳性对照检测中A型流感病毒随PCR循环的扩增曲线图；
[0047] 图3为阳性对照检测中A型流感病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0048] 图4为本发明实施例阳性对照检测中B型流感病毒随PCR循环的扩增曲线；
[0049] 图5为阳性对照检测中B型流感病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0050] 图6为本发明实施例阳性对照检测中人偏肺病毒随PCR循环的扩增曲线；
[0051] 图7为阳性对照检测中人偏肺病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0052] 图8为本发明实施例阳性对照检测中NL63型人冠状病毒随PCR循环的扩增曲线；
[0053] 图9为阳性对照检测中NL63型人冠状病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0054] 图10为本发明实施例阳性对照检测中HKU1型人冠状病毒随PCR循环的扩增曲 线. -^4 ，
[0055] 图11为阳性对照检测中HKU1型人冠状病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0056] 图12为本发明实施例阳性对照检测中0C43型人冠状病毒随PCR循环的扩增曲 线.
[0057] 图13为阳性对照检测中0C43型人冠状病毒随PCR循环的扩增的标准曲线。
【具体实施方式】
[0058] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0059] 本发明实例提供了一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1 型和0C43型人冠状病毒的试剂盒，包括：
[0060] 阳性对照：连有A型流感病毒基因片段的大肠杆菌、连有B型流感病毒基因片段的 大肠杆菌、连有偏肺病毒HMPV基因片段的大肠杆菌、冠状病毒NL63基因片段的大肠杆菌、 连有冠状病HKU1基因片段的大肠杆菌、连有冠状病毒0C43基因片段的大肠杆菌。
[0061] 根据A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病 毒特异性设计的RT-PCR引物，包括 ：
[0062] A型流感病毒特异性引物
[0063] 上游引物：GACCRATCCTGTCACCTCTGAC(5' -3'）；
[0064] 下游引物：GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG(5' -3'）；
[0065] B型流感病毒特异性引物
[0066] 上游引物：TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG (5，-3，）；
[0067] 下游引物：CGGTGCTCTTGACCAAATTGG(5' -3'）；
[0068] 人偏肺病毒特异性引物
[0069] 上游引物：CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC (5，-3，）；
[0070] 下游引物：CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG(5' -3'）；
[0071] NL63型人冠状病毒特异性引物
[0072] 上游引物：GGCCATAAGATTGCTACTCGTG(5' -3'）；
[0073] 下游引物：CTCCTGAGAGGCAACACCA(5, -3,）；
[0074] HKU1型人冠状病毒特异性引物
[0075] 上游引物：ATTCACTGTGTCTACTCAACCAC(5' -3'）；
[0076] 下游引物：CCGAAAGCAATGGGAACTCC(5' -3'）；
[0077] 0C43型人冠状病毒特异性引物
[0078] 上游引物：GGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGG(5, -3,）；
[0079] 下游引物：TGGCTCTACTACGCGATCCT(5, -3,）；
[0080] 以及针对A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠 状病毒的靶基因特异性设计的基因探针，包括：
[0081] A型流感病毒基因探针
[0082] 5, -TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3,；
[0083] B型流感病毒基因探针
[0084] 5' -CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-3' ；
[0085] 人偏肺病毒基因探针
[0086] 5, -TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-3,；
[0087] NL63型人冠状病毒基因探针
[0088] 5, -GAATGCCCAACCAGTCTGGC-3,；
[0089] HKU1型人冠状病毒基因探针
[0090] 5, -ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-3,；
[0091] 0C43型人诞状病毒基因探针
[0092] 5，-GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-3，。
[0093] 荧光标记物；
[0094] buffer 缓冲液。
[0095] 采用本发明的试剂盒，在进行检测过程中可以利用多色组合探针编码 (Multicolor Recombination Probe Coding，MCPC)技术的基本原理，将针对祀基因特异性 设计的基因探针用不同的荧光组合进行标记，使其获得一个独特编码，不同编码的探针可 以置于同一反应管，通过实时PCR给出的编码探针信号进行靶的检测。
[0096] 特异性引物在使用中用通用引物进行同源加尾，使上游引物和下游引物分别加上 相同的标签，然后进行PCR反应。原本在HAND系统进行PCR反应时，不同的引物用通用引 物加尾之后容易形成引物二聚体，使不同的荧光探针无法继续保持较高的扩增效率。但是 本发明中特异性引物设计时其两端存在互补tag序列，因此引物的各单链两端互补会各自 形成一个稳定的发夹结构，而不会随着PCR过程的进行成为通用引物扩增的模板，从而大 大的降低了引物二聚体的产生。因此有效抑制引物二聚体的机制，使得多色组合探针编码 体系能保持较高的扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检 测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
[0097] 本发明上述试剂盒进行检测，荧光标记物中的荧光报告基团包括FAM，HEX，J0E， R0X和CYS中的一种或者多种；在本发明中除了特异性的引物和探针的设计之外，检测中采 用荧光对探针进行多色组合探针编码，目的是在荧光的种类不增加的情况下，提高可以在 检测中识别的标记探针的种类；其原理是将靶特异的检测探针用不同的荧光报告基团组合 进行标记，使其获得一个独特编码，不同编码的探针可以置于同一反应管，荧光所标记的探 针便可以进行区分。因为若将每种荧光看成基本元素，通过相互组合可以形成多种不同的 类型，例如，有A、B和C三种元素，可以分别构成A、B、C、A+B、A+C、B+C、A+B+C共七种组合， 依据数学上的组合规则，对于η种荧光基本元素，总共可以得到N = (^+(；2+···+(；η = Σ C:， Q = i?n) = 2n-l种荧光组合。其中的任何一种荧光组合都可以标记一种靶特异的检测 探针，若以一二进制进行编码，就可以得到N种具有不同编码的荧光探针，故就可以检测N 种不同的靶序列。
[0098] 因此在本发明中如果采用上述五种荧光报告基团中的四种如FAM、HEX、R0X和CYS 时，如果用现有的单色荧光标记探针方法，仅可以标记C； 1 = 4种探针，每种探针可以检测一 种靶序列；当用两种基本荧光元素组合进行探针标记时，具有FAM+HEX，FAM+R0X，FAM+CYS， HEX+R0X，HEX+CYS和R0X+CYS共C 42 = 6种不同的荧光组合，故可以编码6种探针，就可以 区分6种靶序列。依次类推，因此采用四种荧光元素进行探针标记编码时，共可以编码15 种探针，实现区分15种靶序列。而目前的实时PCR都是采用单色荧光标记探针的模式，故 能标记的探针的数量只占组合编码的其中一项即(V。本发明的多色组合探针编码用荧光组 合标记探针来代替传统的单色荧光标记探针，提高了单一反应管中可识别的探针的数目， 从而提高实时PCR单管中能够检测的靶的数目。当然，在上述荧光标记物中，在实时荧光 PCR过程中，还需要在引物的末端标记与荧光报告基团配合的荧光淬灭基团，用于抑制荧光 报告基团发出的荧光信号，其中荧光淬灭基团的选择可以采用现有的淬灭基团即可实现。
[0099] 本发明的上述同时检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型 和0C43型人冠状病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性 设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通 的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低 和检测灵敏度低的问题。
[0100] 在上述实施方式中，阳性对照中采用的大肠杆菌其目的是作为病原体的靶基因的 片段的载体，大肠杆菌由于获得便易性、酶切位点成熟、拷贝数比较多，因此在本发明中优 选在阳性对照组中采用大肠杆菌作为载体；当然，在实施也可以采用其他的载体进行，只要 能实现相同的目的即可。
[0101] 进一步地，本发明进一步提出采用上述检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒， NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒进行病原体检测方法，可以参考如下步骤进 行：
[0102] S10,采集待测标样：
[0103] S20,提取病患标样中的病原体核酸；
[0104] S30,将A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠状 病毒的特异性引物用通用引物进行同源加尾；
[0105] S40,用荧光标记物中的一种或者多种混合，对A型流感病毒基因探针、B型流感病 毒基因探针、人偏肺病毒基因探针、NL63型人冠状病毒基因探针、HKU1型人冠状病毒基因 探针和0C43型人冠状病毒基因探针进行多色组合探针编码，并且使不同病原体基因探针 上的荧光标记不相同；
[0106] S50,用加尾后的A型流感病毒特异性引物、B型流感病毒特异性引物、人偏肺病毒 特异性引物、NL63型人冠状病毒特异性引物、HKU1型人冠状病毒特异性引物和0C43型人冠 状病毒特异性引物，以及标记后的基因探针与病原体核酸组成RT-PCR反应系进行RT-PCR 扩增；其中控制条件可以参考下述：
[0107] 42°C下反应 lOmin ;
[0108] 95°C 下反应 10s;
[0109] 40次循环：95°C下变性5s、然后60°C下退火lmin。
[0110] S60、在RT-PCR过程中，检测荧光的变化量，并对扩增结果进行检测。
[0111] 其中步骤S10中的待测标样，基于本发明试剂盒的主要目的，可以采集病患的离 体组织（比如咽拭子、痰液、或者患处的组织细胞）进行的检测，然后间接地辅助疾病的分 析和参考。当然，出于本发明的试剂盒所能实现的功能，所检测的待测标样也可以拓展到类 似的食品检疫等领域；只要是功能和目的相同，均可以采用本发明的试剂盒和检测方法进 行实施，并不仅仅限定于辅助疾病的检测。
[0112] 在步骤S50中，其原理过程基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术，在RT-PCR过 程中除了本发明上述所需要用到的物质成分之外，还需要添加各种反应的酶液（比如反 转录酶、DNA聚合酶等等）、通用引物、缓冲液等等。而在步骤S60中利用Takara One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)在 ABI Viia7 构建六重荧光 RT-PCR 体系， 通过调整体系内各组分的浓度以及反应条件，使RT-PCR扩增曲线更好，并监控荧光的变 化；RT-PCR扩增体系中个组分的终浓度参考如下：
[0113] lXbuffer缓冲液；A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒型上游引物〇. 4 μ Μ ;A型流感病毒下游引物0. 4 μ Μ ;B型流感病毒上游引物 0. 4μ Μ ;B型流感病毒下游引物0. 4μ Μ ;人偏肺病毒上游引物0. 4μ Μ ;人偏肺病毒下游引 物0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒上游引物0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒下游引物0. 4 μ M ;HKU1 型人冠状病毒上游引物〇. 4μ M ;HKU1型人冠状病毒下游引物0. 4μ M ;0C43型人冠状病毒 上游引物〇. 4μΜ ;0C43型人冠状病毒下游引物0. 4μΜ ;A型流感病毒基因探针0. 2μΜ ;A 型流感病毒基因探针〇. 2 μ Μ ;人偏肺病毒基因探针0. 2 μ M ;NL63型人冠状病毒基因探针 0. 2 μ M ;HKU1型人冠状病毒基因探针0. 2 μ M ;0C43型人冠状病毒基因探针0. 2 μ M。最后控 制RNA为0. 5uL。这里的RNA可以是患者的细胞中提取的RNA、或者是阳性对照的标准RNA 样本。
[0114] 将体系内的各物质浓度调整至上述浓度后，进行RT-PCR并检测随着循环数Ct的 增加荧光标记探针所标记的病原体的荧光变化量，在实施过程中本发明中选用荧光标记的 基本元素可以选择上述五种荧光标记物或者任意组合中，对6种病原体一一对应进行特异 性标记；RT-PCR完成后进行灵敏度及扩增效率测定，步骤S60可以进一步包括：
[0115] S61，采用质粒作为基因运载体，与从扩增产物中提取的病原体核酸进行重组，获 取重组质粒；
[0116] S62,用Sal I内切酶使病原体重组质粒线性化；
[0117] S63,对线性化处理后得到的线性病原体基因，利用RiboMaxT7Express In Vitro Transcription System(Promega，Madison, WI)对A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病 毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人冠状病毒、0C43型人冠状病毒目的基因进行体外转录，并 搜集转录后的RNA ;
[0118] S64,用 BioPhotometer (Eppendorf，Hamburg，Germany)在 260nm 波长下测定各病 原体的RNA浓度，并通过公式Copies = (RNA ng数X 1(Γ9Χ6. 02X 1023V(RNA碱基数X345) 计算各病原体的拷贝数；
[0119] S65,将A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人 冠状病毒、0C43型人冠状病毒的RNA用缓冲液按照10倍稀释梯度稀释至10 6-102,对每个稀 释度RNA按构建的体系作3个重复，做标准曲线并计算扩增效率和变异系数。
[0120] 为了使本发明的试剂盒产品和测量方法更加的利于理解，并且使采用本发明试剂 盒产品和检测方法的优点更加明确，以下通过多个实施例进行举例说明：
[0121] 实施例1
[0122] 本发明的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型 人冠状病毒的试剂盒，包括
[0123] 阳性对照：连有A型流感病毒基因片段的大肠杆菌、连有B型流感病毒基因片段的 大肠杆菌、连有偏肺病毒HMPV基因片段的大肠杆菌、冠状病毒NL63基因片段的大肠杆菌、 连有冠状病HKU1基因片段的大肠杆菌、连有冠状病毒0C43基因片段的大肠杆菌。
[0124] 根据A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病 毒特异性设计的RT-PCR引物，参考上述，再次不再赘述：
[0125] 以及针对A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠 状病毒的靶基因特异性设计的基因探针。
[0126] 还包括多重荧光RT-PCR中所需要的通用引物；
[0127] 荧光标记物中包括：FAM、ROX、HEX这三种荧光标记基团，以及分别对应的这三种 标记基团的荧光淬灭集团。
[0128] Buffer 缓冲液；
[0129] RC-PCR反应酶；其中该RC-PCR反应酶中包含RNA转录酶、DNA聚合酶等RC-PCR反 应中所包括的酶类。
[0130] 用上述试剂盒中的试剂，以阳性对照作为RNA模板，进行标准检测试验，参考如下 步骤：
[0131] S10,取标准阳性对照的菌液5ul ;
[0132] S20,提取阳性对照菌液中病原体的RNA;在这一步骤中，可以采用实验室中常用 的TROzlo法进行；
[0133] S30,采用通用引物对A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和 0C43型人冠状病毒的特异性引物进行同源加尾；
[0134] S40,用多色组合探针编码方式对A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、 HKU1型和0C43型人冠状病毒的基因探针进行标记，具体可以参考如下：
[0135] A型流感病毒基因探针5'端用FAM荧光基团标记，3'端上标记荧光淬灭集团；B 型流感病毒基因探针5'端用HEX荧光基团标记，3'端上标记荧光淬灭集团；人偏肺病毒基 因探针5'端用R0X荧光基团标记，3'端上标记荧光淬灭集团；HKU1型人冠状病毒基因探针 5'端用FAM和R0X两种荧光基团同时标记，3'端上对应标记这两种的荧光淬灭集团；NL63 型人冠状病毒基因探针5 '端用FAM和HEX两种荧光基团同时标记，3 '端上对应标记这两种 的荧光淬灭集团；0C43型人冠状病毒用R0X和HEX两种荧光基团同时标记，3'端上对应标 记这两种的荧光淬灭集团；标记后的基因探针如下：
[0136] A型流感病毒基因探针
[0137] 5, FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-ECLIPSE-3,；
[0138] B型流感病毒基因探针
[0139] 5, HEX-CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-ECLIPSE-3,；
[0140] 人偏肺病毒基因探针
[0141] 5, R0X-TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-ECLIPSE-3,；
[0142] NL63型人冠状病毒基因探针
[0143] 5' -FAM/HEX-GAATGCCCAACCAGTCTGGC-ECLIPSE-3' ；
[0144] HKU1型人冠状病毒基因探针
[0145] 5' -FAM/R0X-ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-ECLIPSE-3' ；
[0146] 0C43型人诞状病毒基因探针
[0147] 5 ' -ROX/HEX-GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-ECLIPSE-3 '。
[0148] S50,将所提取的阳性对照的RNA、同源加尾后的A型流感病毒特异性引物、B型流 感病毒特异性引物、人偏肺病毒特异性引物、NL63型人冠状病毒特异性引物、HKU1型人冠 状病毒特异性引物和0C43型人冠状病毒特异性引物，以及标记后的基因探针于Takara One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)在 ABI Viia7 构建六重荧光 RT-PCR 体系；并控制浓度如下：
[0149] lXbuffer缓冲液；A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒型上游引物〇. 4 μ Μ ;A型流感病毒下游引物0. 4 μ Μ ;B型流感病毒上游引物 0. 4μ Μ ;B型流感病毒下游引物0. 4μ Μ ;人偏肺病毒上游引物0. 4μ Μ ;人偏肺病毒下游引 物0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒上游引物0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒下游引物0. 4 μ M ;HKU1 型人冠状病毒上游引物〇. 4μ M ;HKU1型人冠状病毒下游引物0. 4μ M ;0C43型人冠状病毒 上游引物〇. 4μΜ ;0C43型人冠状病毒下游引物0. 4μΜ ;A型流感病毒基因探针0. 2μΜ ;A 型流感病毒基因探针〇. 2 μ Μ ;人偏肺病毒基因探针0. 2 μ M ;NL63型人冠状病毒基因探针 0. 2 μ M ;HKU1型人冠状病毒基因探针0. 2 μ M ;0C43型人冠状病毒基因探针0. 2 μ M。最后控 制 RNA 为 0. 5uL。
[0150] 然后进行RT-PCR反应，并在反应过程中对机器接收的荧光信号进行设定，监控反 应过程中的荧光变化量，六重荧光标记量随RT-PCR反应的扩增曲线如图1。
[0151] S60,在上述步骤完成之后，对RT-PCR后的扩增产物进一步进行灵敏度及扩增效 率测定，具体如下：
[0152] S61，采用质粒作为基因运载体，与从扩增产物中提取的病原体核酸进行重组，获 取重组质粒；
[0153] S62,用Sal I内切酶使病原体重组质粒线性化；
[0154] S63,对线性化处理后得到的线性病原体基因，利用RiboMaxT7Express In Vitro Transcription System(Promega，Madison, WI)对A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病 毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人冠状病毒、0C43型人冠状病毒目的基因进行体外转录，并 搜集转录后的RNA ;
[0155] S64,用 BioPhotometer (Eppendorf，Hamburg，Germany)在 260nm 波长下测定各病 原体的RNA浓度，并通过公式Copies = (RNA ng数X 1(Γ9Χ6. 02X 1023V(RNA碱基数X345) 计算各病原体的拷贝数；
[0156] S65,将A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人 冠状病毒、0C43型人冠状病毒的RNA用缓冲液按照10倍稀释梯度稀释至10 6-102,对每个稀 释度RNA按构建的体系作3个重复，做标准曲线并计算扩增效率和变异系数。
[0157] 按照上述以阳性对照为标样进行上述检测过程，所得的结果分析如下：
[0158] 从阳性对照中提取病原体RNA后用上述特异性引物和基因探针进行上述六重荧 光RT-PCR，按照上述步骤S61-S65的步骤进行扩增产物的结果测量。其中步骤S64中计算得 到A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人冠状病毒、0C43 型人冠状病毒的拷贝数分别为 2. 11X1012、L 47X1012、L 56Χ1012、2· 42X1012、L 79X1012、 2· 15X1012。
[0159] 在多色荧光RT-PCR步骤中，各中荧光标记的荧光信号变化量如下：
[0160] 其中，A型流感病毒的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表1，以及A型流感病 毒随PCR循环的扩增曲线参见附图2-3 :
[0161] 表1 :A型流感病毒实验数据（FAM标记）
[0162]
[0163]
【权利要求】
1. 一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒 的试剂盒，其特征在于，包括病原体特异性引物和病原体基因探针； 所述病原体特异性引物包括： A 型流感病毒上游引物：5' -GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3' ； A 型流感病毒下游引物：5' -GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3' ； B 型流感病毒上游引物：5' -TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG3' ； B 型流感病毒下游引物：5' -CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3' ； 人偏肺病毒上游引物：5' -CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3' ； 人偏肺病毒下游引物：5' -CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG-3' ； NL63 型人冠状病毒上游引物：5' -GGCCATAAGATTGCTACTCGTG-3' ； NL63 型人冠状病毒下游引物：5' -CTCCTGAGAGGCAACACCA-3' ； HKU1 型人冠状病毒上游引物：5' -ATTCACTGTGTCTACTCAACCAC-3' ； HKU1 型人冠状病毒下游引物：5' -CCGAAAGCAATGGGAACTCC-3' ； 0C43 型人冠状病毒上游引物：5' -GGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGG-3' ； 0C43 型人冠状病毒下游引物：5' -TGGCTCTACTACGCGATCCT-3' ； 所述病原体基因探针包括： A型流感病毒基因探针 5' -TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3' ； B型流感病毒基因探针 5' -CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-3' ； 人偏肺病毒基因探针 5, -TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-3,； NL63型人冠状病毒基因探针 5' -GAATGCCCAACCAGTCTGGC-3' ； HKU1型人冠状病毒基因探针 5' -ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-3' ； 0C43型人冠状病毒基因探针 5' -GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-3'。
2. 如权利要求1所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照； 所述阳性对照包括连有A型流感病毒基因片段的载体、连有B型流感病毒基因片段的 载体、连有偏肺病毒基因片段的载体、NL63型人冠状病毒基因片段的载体、连有HKU1型人 冠状病毒基因片段的载体、连有0C43型人冠状病毒基因片段的载体。
3. 如权利要求2所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述载体为大肠杆菌。
4. 如权利要求1至3任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、 HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光标记物，该荧 光标记物包括FAM、HEX、JOE、ROX和CYS中的一种或者多种。
5. 如权利要求1至3任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、 HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-PCR反应酶。
6. 如权利要求1至5任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、 HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 提取病患标样中的病原体核酸； 将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾； 将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基因探 针上标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相同； 将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异性引 物混合、并添加缓冲液制成混合反应系； 将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。
7. 如权利要求6所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和 0C43型人冠状病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述混合反应系中A型流感病毒下 游引物为〇. 4μΜ ;B型流感病毒上游引物为0. 4μΜ ;B型流感病毒下游引物为0. 4μΜ ;人 偏肺病毒上游引物为〇. 4 μ Μ ;人偏肺病毒下游引物为0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒上游引物 为0· 4μ M ;NL63型人冠状病毒下游弓丨物为0· 4μ M ;HKU1型人冠状病毒上游弓丨物为0· 4μ Μ ; HKU1型人冠状病毒下游引物为0. 4 μ M ;OC43型人冠状病毒上游引物为0. 4 μ M ;OC43型人 冠状病毒下游引物为〇. 4 μ Μ ;A型流感病毒基因探针为0. 2 μ Μ ;A型流感病毒基因探针为 0. 2 μ Μ ;人偏肺病毒基因探针为0. 2 μ M ;NL63型人冠状病毒基因探针为0. 2 μ M ;HKU1型人 冠状病毒基因探针为〇. 2 μ M ;OC43型人冠状病毒基因探针为0. 2 μ Μ。
【文档编号】C12Q1/70GK104059997SQ201410249864
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】房师松, 张然, 张仁利 申请人:深圳市疾病预防控制中心
【专利摘要】本发明提供了一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，包括病原体特异性引物和病原体基因探针。本发明的上述检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
【专利说明】检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和 0C43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测试剂盒【技术领域】，具体涉及一种检测A型和B型流感病毒、人 偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是一种有囊膜的负链RNA病毒，属于正粘病毒科。流感病毒根据其核蛋 白和基质蛋白抗原性的不同，可以将其分为A、B、C三个分型，目前感染人的主要是A、B分 型。A、B型流感病毒基因组分为8个节段，为单链、负链的RNA，分别编码至少10种以上的 蛋白。A型流感病毒根据其表面细胞凝集素（HA)和神经氨酸苷酶（NA)抗原性的不同，可以 分为1-16种HA亚型和1-9种NA亚型。A型流感病毒可以感染多种动物，例如猪、鸟类、禽 类和人，A型流感病毒极易发生变异，并且传染力极强，B型流感病毒一般只感染人类。
[0003] 人偏肺病毒是一种比较常见的呼吸道感染病原体，在引起急性呼吸道疾病的所有 病原体中，人偏肺病毒占3. 9-18%，一般会引起下呼吸道感染，症状主要是咳嗽、流涕和发 热等。
[0004] 冠状病毒是一类有包膜的正链RNA病毒，在巢状病毒目里属于冠状病毒科，会引 起呼吸道疾病。目前，已被发现的冠状病毒有五种，分别是〇C43、229E、SARS、NL63和HKU1。 冠状病毒约占所有呼吸道疾病病原体的1/3,是引起呼吸道疾病最常见的一类病原体。
[0005] A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒NL63型、0C43型和HKU1型冠状病毒都是 呼吸道病原体；而呼吸道感染症候群病原体的诊断可以分为传统方法和分子生物学方法。 传统的检测方法一般有病毒分离、血清学诊断、液相芯片分析技术和酶联免疫反应等。随 着分子生物学技术的快速发展，越来越多的呼吸道病原体检测手段趋向于采用分子生物 鉴别中，比如 PCR、RT_PCR、Multiplex RT_PCR、MDD(molecular differential diagnoses，分 子鉴别诊断）、Real-time RT_PCR、Duplex real time PCR等等。这些方法各有优缺点，比如 PCR、RT-PCR只针对某个病原体单个型别和亚型的分子甄别，而Multiplex RT-PCR虽然能完 成几个病毒型别和亚型的分子甄别。其中发展最快的是Real-time PCR。Real-time PCR是 一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Real-time PCR灵敏度高、特异性强、操作方便，目 前已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。
[0006] 但是在实临床中，引起感染症状的病原体可能多达几十种，如果采用传统单一的 Real-time PCR方法，则要重复多次对每一种病原体进行PCR反应，工作量巨大，耗时较长， 很可能会耽误控制疾病蔓延的时机。因此多重荧光定量PCR是一种快速有效的检测多重呼 吸道疾病的方法。2006年，旅美华人韩健博士发明了 Tem-PCR(Target enriched multiplex PCR，靶序列富集多重PCR技术）能在一次反应中对多重靶序列进行高灵敏度和特异性的扩 增和检测，实现了一次PCR可以检测几种病原体。但Tem-PCR仍有一些不足之处，有待改进， 例如灵敏度略低于real-time PCR，扩增时间较传统PCR长，检测时打开PCR反应管盖会造 成实验室污染和假阳性，以及靶基因的检测和扩增尚未一体化等。因此，在A型流感病毒、 B型流感病毒、人偏肺病毒NL63型、0C43型和HKU1型冠状病毒等呼吸道病原体的检测中并 无能够一次直接快速精确检测的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种检测时长只需2个 小时左右、操作方便、成本低、杜绝交叉污染，并能突破常规PCR仪器荧光检测通道限制实 现一次同时检测A和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病 毒的试剂盒及检测方法。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0009] 一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病 毒的试剂盒，包括病原体特异性引物和病原体基因探针；
[0010] 所述病原体特异性引物包括：
[0011] A 型流感病毒上游引物：5' -GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3' ；
[0012] A 型流感病毒下游引物：5' -GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3' ；
[0013] B 型流感病毒上游引物：5' -TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG3' ；
[0014] B 型流感病毒下游引物：5' -CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3' ；
[0015] 人偏肺病毒上游引物：5' -CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3' ；
[0016] 人偏肺病毒下游引物：5' -CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG-3' ；
[0017] NL63 型人冠状病毒上游引物：5' -GGCCATAAGATTGCTACTCGTG-3' ；
[0018] NL63 型人冠状病毒下游引物：5' -CTCCTGAGAGGCAACACCA-3' ；
[0019] HKU1 型人冠状病毒上游引物：5' -ATTCACTGTGTCTACTCAACCAC-3' ；
[0020] HKU1 型人冠状病毒下游引物：5' -CCGAAAGCAATGGGAACTCC-3' ；
[0021] 0C43 型人冠状病毒上游引物：5' -GGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGG-3' ；
[0022] 0C43 型人冠状病毒下游引物：5' -TGGCTCTACTACGCGATCCT-3' ；
[0023] 所述病原体基因探针包括：
[0024] A型流感病毒基因探针
[0025] 5, -TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3,；
[0026] B型流感病毒基因探针
[0027] 5' -CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-3' ；
[0028] 人偏肺病毒基因探针
[0029] 5, -TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-3,；
[0030] NL63型人冠状病毒基因探针
[0031] 5' -GAATGCCCAACCAGTCTGGC-3' ；
[0032] HKU1型人冠状病毒基因探针
[0033] 5, -ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-3,；
[0034] 0C43型人冠状病毒基因探针
[0035] 5 ' -GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-3 '。
[0036] 本发明的上述检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和 0C43型人冠状病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设 计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的 TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和 检测灵敏度低的问题。
[0037] 针对上述现有技术的缺陷，本发明进一步还提出一种利用检测A型和B型流感病 毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒进行检测的方法，包括如下 步骤：
[0038] 提取病患标样中的病原体核酸；
[0039] 将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾；
[0040] 将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基 因探针上标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相 同；
[0041] 将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异 性引物混合、并添加缓冲液制成混合反应系；
[0042] 将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。
[0043] 而且采用本发明的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒试剂盒进行检测的方法，以试剂盒为基础，采用荧光对探针进行多色组合探 针编码，替代现有的单色荧光标记探针方法，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从 而提高实时PCR单管中能够检测的靶的数目；然后进一步在检测过程中用特异性引物同源 加尾通用引物形成加尾引物进行RT-PCR反应，且特异性引物设计其两端存在互补tag序 列，因此引物的各单链两端互补会各自形成一个稳定的发夹结构，而不会随着PCR过程的 进行成为通用引物扩增的模板，从而大大的降低了引物二聚体的产生；不仅可以同时进行 检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒；而且提升 了反应效率，也使得用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决 了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0045] 图1为本发明实施例阳性对照检测中PCR循环中六重荧光标记的扩增曲线；
[0046] 图2为本发明实施例阳性对照检测中A型流感病毒随PCR循环的扩增曲线图；
[0047] 图3为阳性对照检测中A型流感病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0048] 图4为本发明实施例阳性对照检测中B型流感病毒随PCR循环的扩增曲线；
[0049] 图5为阳性对照检测中B型流感病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0050] 图6为本发明实施例阳性对照检测中人偏肺病毒随PCR循环的扩增曲线；
[0051] 图7为阳性对照检测中人偏肺病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0052] 图8为本发明实施例阳性对照检测中NL63型人冠状病毒随PCR循环的扩增曲线；
[0053] 图9为阳性对照检测中NL63型人冠状病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0054] 图10为本发明实施例阳性对照检测中HKU1型人冠状病毒随PCR循环的扩增曲 线. -^4 ，
[0055] 图11为阳性对照检测中HKU1型人冠状病毒随PCR循环的扩增的标准曲线；
[0056] 图12为本发明实施例阳性对照检测中0C43型人冠状病毒随PCR循环的扩增曲 线.
[0057] 图13为阳性对照检测中0C43型人冠状病毒随PCR循环的扩增的标准曲线。
【具体实施方式】
[0058] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0059] 本发明实例提供了一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1 型和0C43型人冠状病毒的试剂盒，包括：
[0060] 阳性对照：连有A型流感病毒基因片段的大肠杆菌、连有B型流感病毒基因片段的 大肠杆菌、连有偏肺病毒HMPV基因片段的大肠杆菌、冠状病毒NL63基因片段的大肠杆菌、 连有冠状病HKU1基因片段的大肠杆菌、连有冠状病毒0C43基因片段的大肠杆菌。
[0061] 根据A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病 毒特异性设计的RT-PCR引物，包括 ：
[0062] A型流感病毒特异性引物
[0063] 上游引物：GACCRATCCTGTCACCTCTGAC(5' -3'）；
[0064] 下游引物：GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG(5' -3'）；
[0065] B型流感病毒特异性引物
[0066] 上游引物：TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG (5，-3，）；
[0067] 下游引物：CGGTGCTCTTGACCAAATTGG(5' -3'）；
[0068] 人偏肺病毒特异性引物
[0069] 上游引物：CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC (5，-3，）；
[0070] 下游引物：CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG(5' -3'）；
[0071] NL63型人冠状病毒特异性引物
[0072] 上游引物：GGCCATAAGATTGCTACTCGTG(5' -3'）；
[0073] 下游引物：CTCCTGAGAGGCAACACCA(5, -3,）；
[0074] HKU1型人冠状病毒特异性引物
[0075] 上游引物：ATTCACTGTGTCTACTCAACCAC(5' -3'）；
[0076] 下游引物：CCGAAAGCAATGGGAACTCC(5' -3'）；
[0077] 0C43型人冠状病毒特异性引物
[0078] 上游引物：GGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGG(5, -3,）；
[0079] 下游引物：TGGCTCTACTACGCGATCCT(5, -3,）；
[0080] 以及针对A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠 状病毒的靶基因特异性设计的基因探针，包括：
[0081] A型流感病毒基因探针
[0082] 5, -TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3,；
[0083] B型流感病毒基因探针
[0084] 5' -CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-3' ；
[0085] 人偏肺病毒基因探针
[0086] 5, -TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-3,；
[0087] NL63型人冠状病毒基因探针
[0088] 5, -GAATGCCCAACCAGTCTGGC-3,；
[0089] HKU1型人冠状病毒基因探针
[0090] 5, -ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-3,；
[0091] 0C43型人诞状病毒基因探针
[0092] 5，-GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-3，。
[0093] 荧光标记物；
[0094] buffer 缓冲液。
[0095] 采用本发明的试剂盒，在进行检测过程中可以利用多色组合探针编码 (Multicolor Recombination Probe Coding，MCPC)技术的基本原理，将针对祀基因特异性 设计的基因探针用不同的荧光组合进行标记，使其获得一个独特编码，不同编码的探针可 以置于同一反应管，通过实时PCR给出的编码探针信号进行靶的检测。
[0096] 特异性引物在使用中用通用引物进行同源加尾，使上游引物和下游引物分别加上 相同的标签，然后进行PCR反应。原本在HAND系统进行PCR反应时，不同的引物用通用引 物加尾之后容易形成引物二聚体，使不同的荧光探针无法继续保持较高的扩增效率。但是 本发明中特异性引物设计时其两端存在互补tag序列，因此引物的各单链两端互补会各自 形成一个稳定的发夹结构，而不会随着PCR过程的进行成为通用引物扩增的模板，从而大 大的降低了引物二聚体的产生。因此有效抑制引物二聚体的机制，使得多色组合探针编码 体系能保持较高的扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检 测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
[0097] 本发明上述试剂盒进行检测，荧光标记物中的荧光报告基团包括FAM，HEX，J0E， R0X和CYS中的一种或者多种；在本发明中除了特异性的引物和探针的设计之外，检测中采 用荧光对探针进行多色组合探针编码，目的是在荧光的种类不增加的情况下，提高可以在 检测中识别的标记探针的种类；其原理是将靶特异的检测探针用不同的荧光报告基团组合 进行标记，使其获得一个独特编码，不同编码的探针可以置于同一反应管，荧光所标记的探 针便可以进行区分。因为若将每种荧光看成基本元素，通过相互组合可以形成多种不同的 类型，例如，有A、B和C三种元素，可以分别构成A、B、C、A+B、A+C、B+C、A+B+C共七种组合， 依据数学上的组合规则，对于η种荧光基本元素，总共可以得到N = (^+(；2+···+(；η = Σ C:， Q = i?n) = 2n-l种荧光组合。其中的任何一种荧光组合都可以标记一种靶特异的检测 探针，若以一二进制进行编码，就可以得到N种具有不同编码的荧光探针，故就可以检测N 种不同的靶序列。
[0098] 因此在本发明中如果采用上述五种荧光报告基团中的四种如FAM、HEX、R0X和CYS 时，如果用现有的单色荧光标记探针方法，仅可以标记C； 1 = 4种探针，每种探针可以检测一 种靶序列；当用两种基本荧光元素组合进行探针标记时，具有FAM+HEX，FAM+R0X，FAM+CYS， HEX+R0X，HEX+CYS和R0X+CYS共C 42 = 6种不同的荧光组合，故可以编码6种探针，就可以 区分6种靶序列。依次类推，因此采用四种荧光元素进行探针标记编码时，共可以编码15 种探针，实现区分15种靶序列。而目前的实时PCR都是采用单色荧光标记探针的模式，故 能标记的探针的数量只占组合编码的其中一项即(V。本发明的多色组合探针编码用荧光组 合标记探针来代替传统的单色荧光标记探针，提高了单一反应管中可识别的探针的数目， 从而提高实时PCR单管中能够检测的靶的数目。当然，在上述荧光标记物中，在实时荧光 PCR过程中，还需要在引物的末端标记与荧光报告基团配合的荧光淬灭基团，用于抑制荧光 报告基团发出的荧光信号，其中荧光淬灭基团的选择可以采用现有的淬灭基团即可实现。
[0099] 本发明的上述同时检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型 和0C43型人冠状病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性 设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通 的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低 和检测灵敏度低的问题。
[0100] 在上述实施方式中，阳性对照中采用的大肠杆菌其目的是作为病原体的靶基因的 片段的载体，大肠杆菌由于获得便易性、酶切位点成熟、拷贝数比较多，因此在本发明中优 选在阳性对照组中采用大肠杆菌作为载体；当然，在实施也可以采用其他的载体进行，只要 能实现相同的目的即可。
[0101] 进一步地，本发明进一步提出采用上述检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒， NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒进行病原体检测方法，可以参考如下步骤进 行：
[0102] S10,采集待测标样：
[0103] S20,提取病患标样中的病原体核酸；
[0104] S30,将A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠状 病毒的特异性引物用通用引物进行同源加尾；
[0105] S40,用荧光标记物中的一种或者多种混合，对A型流感病毒基因探针、B型流感病 毒基因探针、人偏肺病毒基因探针、NL63型人冠状病毒基因探针、HKU1型人冠状病毒基因 探针和0C43型人冠状病毒基因探针进行多色组合探针编码，并且使不同病原体基因探针 上的荧光标记不相同；
[0106] S50,用加尾后的A型流感病毒特异性引物、B型流感病毒特异性引物、人偏肺病毒 特异性引物、NL63型人冠状病毒特异性引物、HKU1型人冠状病毒特异性引物和0C43型人冠 状病毒特异性引物，以及标记后的基因探针与病原体核酸组成RT-PCR反应系进行RT-PCR 扩增；其中控制条件可以参考下述：
[0107] 42°C下反应 lOmin ;
[0108] 95°C 下反应 10s;
[0109] 40次循环：95°C下变性5s、然后60°C下退火lmin。
[0110] S60、在RT-PCR过程中，检测荧光的变化量，并对扩增结果进行检测。
[0111] 其中步骤S10中的待测标样，基于本发明试剂盒的主要目的，可以采集病患的离 体组织（比如咽拭子、痰液、或者患处的组织细胞）进行的检测，然后间接地辅助疾病的分 析和参考。当然，出于本发明的试剂盒所能实现的功能，所检测的待测标样也可以拓展到类 似的食品检疫等领域；只要是功能和目的相同，均可以采用本发明的试剂盒和检测方法进 行实施，并不仅仅限定于辅助疾病的检测。
[0112] 在步骤S50中，其原理过程基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术，在RT-PCR过 程中除了本发明上述所需要用到的物质成分之外，还需要添加各种反应的酶液（比如反 转录酶、DNA聚合酶等等）、通用引物、缓冲液等等。而在步骤S60中利用Takara One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)在 ABI Viia7 构建六重荧光 RT-PCR 体系， 通过调整体系内各组分的浓度以及反应条件，使RT-PCR扩增曲线更好，并监控荧光的变 化；RT-PCR扩增体系中个组分的终浓度参考如下：
[0113] lXbuffer缓冲液；A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒型上游引物〇. 4 μ Μ ;A型流感病毒下游引物0. 4 μ Μ ;B型流感病毒上游引物 0. 4μ Μ ;B型流感病毒下游引物0. 4μ Μ ;人偏肺病毒上游引物0. 4μ Μ ;人偏肺病毒下游引 物0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒上游引物0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒下游引物0. 4 μ M ;HKU1 型人冠状病毒上游引物〇. 4μ M ;HKU1型人冠状病毒下游引物0. 4μ M ;0C43型人冠状病毒 上游引物〇. 4μΜ ;0C43型人冠状病毒下游引物0. 4μΜ ;A型流感病毒基因探针0. 2μΜ ;A 型流感病毒基因探针〇. 2 μ Μ ;人偏肺病毒基因探针0. 2 μ M ;NL63型人冠状病毒基因探针 0. 2 μ M ;HKU1型人冠状病毒基因探针0. 2 μ M ;0C43型人冠状病毒基因探针0. 2 μ M。最后控 制RNA为0. 5uL。这里的RNA可以是患者的细胞中提取的RNA、或者是阳性对照的标准RNA 样本。
[0114] 将体系内的各物质浓度调整至上述浓度后，进行RT-PCR并检测随着循环数Ct的 增加荧光标记探针所标记的病原体的荧光变化量，在实施过程中本发明中选用荧光标记的 基本元素可以选择上述五种荧光标记物或者任意组合中，对6种病原体一一对应进行特异 性标记；RT-PCR完成后进行灵敏度及扩增效率测定，步骤S60可以进一步包括：
[0115] S61，采用质粒作为基因运载体，与从扩增产物中提取的病原体核酸进行重组，获 取重组质粒；
[0116] S62,用Sal I内切酶使病原体重组质粒线性化；
[0117] S63,对线性化处理后得到的线性病原体基因，利用RiboMaxT7Express In Vitro Transcription System(Promega，Madison, WI)对A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病 毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人冠状病毒、0C43型人冠状病毒目的基因进行体外转录，并 搜集转录后的RNA ;
[0118] S64,用 BioPhotometer (Eppendorf，Hamburg，Germany)在 260nm 波长下测定各病 原体的RNA浓度，并通过公式Copies = (RNA ng数X 1(Γ9Χ6. 02X 1023V(RNA碱基数X345) 计算各病原体的拷贝数；
[0119] S65,将A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人 冠状病毒、0C43型人冠状病毒的RNA用缓冲液按照10倍稀释梯度稀释至10 6-102,对每个稀 释度RNA按构建的体系作3个重复，做标准曲线并计算扩增效率和变异系数。
[0120] 为了使本发明的试剂盒产品和测量方法更加的利于理解，并且使采用本发明试剂 盒产品和检测方法的优点更加明确，以下通过多个实施例进行举例说明：
[0121] 实施例1
[0122] 本发明的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型 人冠状病毒的试剂盒，包括
[0123] 阳性对照：连有A型流感病毒基因片段的大肠杆菌、连有B型流感病毒基因片段的 大肠杆菌、连有偏肺病毒HMPV基因片段的大肠杆菌、冠状病毒NL63基因片段的大肠杆菌、 连有冠状病HKU1基因片段的大肠杆菌、连有冠状病毒0C43基因片段的大肠杆菌。
[0124] 根据A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病 毒特异性设计的RT-PCR引物，参考上述，再次不再赘述：
[0125] 以及针对A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43型人冠 状病毒的靶基因特异性设计的基因探针。
[0126] 还包括多重荧光RT-PCR中所需要的通用引物；
[0127] 荧光标记物中包括：FAM、ROX、HEX这三种荧光标记基团，以及分别对应的这三种 标记基团的荧光淬灭集团。
[0128] Buffer 缓冲液；
[0129] RC-PCR反应酶；其中该RC-PCR反应酶中包含RNA转录酶、DNA聚合酶等RC-PCR反 应中所包括的酶类。
[0130] 用上述试剂盒中的试剂，以阳性对照作为RNA模板，进行标准检测试验，参考如下 步骤：
[0131] S10,取标准阳性对照的菌液5ul ;
[0132] S20,提取阳性对照菌液中病原体的RNA;在这一步骤中，可以采用实验室中常用 的TROzlo法进行；
[0133] S30,采用通用引物对A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和 0C43型人冠状病毒的特异性引物进行同源加尾；
[0134] S40,用多色组合探针编码方式对A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、 HKU1型和0C43型人冠状病毒的基因探针进行标记，具体可以参考如下：
[0135] A型流感病毒基因探针5'端用FAM荧光基团标记，3'端上标记荧光淬灭集团；B 型流感病毒基因探针5'端用HEX荧光基团标记，3'端上标记荧光淬灭集团；人偏肺病毒基 因探针5'端用R0X荧光基团标记，3'端上标记荧光淬灭集团；HKU1型人冠状病毒基因探针 5'端用FAM和R0X两种荧光基团同时标记，3'端上对应标记这两种的荧光淬灭集团；NL63 型人冠状病毒基因探针5 '端用FAM和HEX两种荧光基团同时标记，3 '端上对应标记这两种 的荧光淬灭集团；0C43型人冠状病毒用R0X和HEX两种荧光基团同时标记，3'端上对应标 记这两种的荧光淬灭集团；标记后的基因探针如下：
[0136] A型流感病毒基因探针
[0137] 5, FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-ECLIPSE-3,；
[0138] B型流感病毒基因探针
[0139] 5, HEX-CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-ECLIPSE-3,；
[0140] 人偏肺病毒基因探针
[0141] 5, R0X-TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-ECLIPSE-3,；
[0142] NL63型人冠状病毒基因探针
[0143] 5' -FAM/HEX-GAATGCCCAACCAGTCTGGC-ECLIPSE-3' ；
[0144] HKU1型人冠状病毒基因探针
[0145] 5' -FAM/R0X-ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-ECLIPSE-3' ；
[0146] 0C43型人诞状病毒基因探针
[0147] 5 ' -ROX/HEX-GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-ECLIPSE-3 '。
[0148] S50,将所提取的阳性对照的RNA、同源加尾后的A型流感病毒特异性引物、B型流 感病毒特异性引物、人偏肺病毒特异性引物、NL63型人冠状病毒特异性引物、HKU1型人冠 状病毒特异性引物和0C43型人冠状病毒特异性引物，以及标记后的基因探针于Takara One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)在 ABI Viia7 构建六重荧光 RT-PCR 体系；并控制浓度如下：
[0149] lXbuffer缓冲液；A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒型上游引物〇. 4 μ Μ ;A型流感病毒下游引物0. 4 μ Μ ;B型流感病毒上游引物 0. 4μ Μ ;B型流感病毒下游引物0. 4μ Μ ;人偏肺病毒上游引物0. 4μ Μ ;人偏肺病毒下游引 物0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒上游引物0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒下游引物0. 4 μ M ;HKU1 型人冠状病毒上游引物〇. 4μ M ;HKU1型人冠状病毒下游引物0. 4μ M ;0C43型人冠状病毒 上游引物〇. 4μΜ ;0C43型人冠状病毒下游引物0. 4μΜ ;A型流感病毒基因探针0. 2μΜ ;A 型流感病毒基因探针〇. 2 μ Μ ;人偏肺病毒基因探针0. 2 μ M ;NL63型人冠状病毒基因探针 0. 2 μ M ;HKU1型人冠状病毒基因探针0. 2 μ M ;0C43型人冠状病毒基因探针0. 2 μ M。最后控 制 RNA 为 0. 5uL。
[0150] 然后进行RT-PCR反应，并在反应过程中对机器接收的荧光信号进行设定，监控反 应过程中的荧光变化量，六重荧光标记量随RT-PCR反应的扩增曲线如图1。
[0151] S60,在上述步骤完成之后，对RT-PCR后的扩增产物进一步进行灵敏度及扩增效 率测定，具体如下：
[0152] S61，采用质粒作为基因运载体，与从扩增产物中提取的病原体核酸进行重组，获 取重组质粒；
[0153] S62,用Sal I内切酶使病原体重组质粒线性化；
[0154] S63,对线性化处理后得到的线性病原体基因，利用RiboMaxT7Express In Vitro Transcription System(Promega，Madison, WI)对A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病 毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人冠状病毒、0C43型人冠状病毒目的基因进行体外转录，并 搜集转录后的RNA ;
[0155] S64,用 BioPhotometer (Eppendorf，Hamburg，Germany)在 260nm 波长下测定各病 原体的RNA浓度，并通过公式Copies = (RNA ng数X 1(Γ9Χ6. 02X 1023V(RNA碱基数X345) 计算各病原体的拷贝数；
[0156] S65,将A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人 冠状病毒、0C43型人冠状病毒的RNA用缓冲液按照10倍稀释梯度稀释至10 6-102,对每个稀 释度RNA按构建的体系作3个重复，做标准曲线并计算扩增效率和变异系数。
[0157] 按照上述以阳性对照为标样进行上述检测过程，所得的结果分析如下：
[0158] 从阳性对照中提取病原体RNA后用上述特异性引物和基因探针进行上述六重荧 光RT-PCR，按照上述步骤S61-S65的步骤进行扩增产物的结果测量。其中步骤S64中计算得 到A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒、NL63型人冠状病毒、HKU1型人冠状病毒、0C43 型人冠状病毒的拷贝数分别为 2. 11X1012、L 47X1012、L 56Χ1012、2· 42X1012、L 79X1012、 2· 15X1012。
[0159] 在多色荧光RT-PCR步骤中，各中荧光标记的荧光信号变化量如下：
[0160] 其中，A型流感病毒的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表1，以及A型流感病 毒随PCR循环的扩增曲线参见附图2-3 :
[0161] 表1 :A型流感病毒实验数据（FAM标记）
[0162]
[0163]
【权利要求】
1. 一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43型人冠状病毒 的试剂盒，其特征在于，包括病原体特异性引物和病原体基因探针； 所述病原体特异性引物包括： A 型流感病毒上游引物：5' -GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3' ； A 型流感病毒下游引物：5' -GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3' ； B 型流感病毒上游引物：5' -TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG3' ； B 型流感病毒下游引物：5' -CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3' ； 人偏肺病毒上游引物：5' -CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3' ； 人偏肺病毒下游引物：5' -CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG-3' ； NL63 型人冠状病毒上游引物：5' -GGCCATAAGATTGCTACTCGTG-3' ； NL63 型人冠状病毒下游引物：5' -CTCCTGAGAGGCAACACCA-3' ； HKU1 型人冠状病毒上游引物：5' -ATTCACTGTGTCTACTCAACCAC-3' ； HKU1 型人冠状病毒下游引物：5' -CCGAAAGCAATGGGAACTCC-3' ； 0C43 型人冠状病毒上游引物：5' -GGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGG-3' ； 0C43 型人冠状病毒下游引物：5' -TGGCTCTACTACGCGATCCT-3' ； 所述病原体基因探针包括： A型流感病毒基因探针 5' -TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3' ； B型流感病毒基因探针 5' -CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-3' ； 人偏肺病毒基因探针 5, -TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-3,； NL63型人冠状病毒基因探针 5' -GAATGCCCAACCAGTCTGGC-3' ； HKU1型人冠状病毒基因探针 5' -ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-3' ； 0C43型人冠状病毒基因探针 5' -GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-3'。
2. 如权利要求1所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照； 所述阳性对照包括连有A型流感病毒基因片段的载体、连有B型流感病毒基因片段的 载体、连有偏肺病毒基因片段的载体、NL63型人冠状病毒基因片段的载体、连有HKU1型人 冠状病毒基因片段的载体、连有0C43型人冠状病毒基因片段的载体。
3. 如权利要求2所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和0C43 型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述载体为大肠杆菌。
4. 如权利要求1至3任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、 HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光标记物，该荧 光标记物包括FAM、HEX、JOE、ROX和CYS中的一种或者多种。
5. 如权利要求1至3任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、 HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-PCR反应酶。
6. 如权利要求1至5任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、 HKU1型和0C43型人冠状病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 提取病患标样中的病原体核酸； 将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾； 将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基因探 针上标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相同； 将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异性引 物混合、并添加缓冲液制成混合反应系； 将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。
7. 如权利要求6所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和 0C43型人冠状病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述混合反应系中A型流感病毒下 游引物为〇. 4μΜ ;B型流感病毒上游引物为0. 4μΜ ;B型流感病毒下游引物为0. 4μΜ ;人 偏肺病毒上游引物为〇. 4 μ Μ ;人偏肺病毒下游引物为0. 4 μ M ;NL63型人冠状病毒上游引物 为0· 4μ M ;NL63型人冠状病毒下游弓丨物为0· 4μ M ;HKU1型人冠状病毒上游弓丨物为0· 4μ Μ ; HKU1型人冠状病毒下游引物为0. 4 μ M ;OC43型人冠状病毒上游引物为0. 4 μ M ;OC43型人 冠状病毒下游引物为〇. 4 μ Μ ;A型流感病毒基因探针为0. 2 μ Μ ;A型流感病毒基因探针为 0. 2 μ Μ ;人偏肺病毒基因探针为0. 2 μ M ;NL63型人冠状病毒基因探针为0. 2 μ M ;HKU1型人 冠状病毒基因探针为〇. 2 μ M ;OC43型人冠状病毒基因探针为0. 2 μ Μ。
【文档编号】C12Q1/70GK104059997SQ201410249864
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】房师松, 张然, 张仁利 申请人:深圳市疾病预防控制中心
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