一种利用重组Bacillussubtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法
一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法
【专利摘要】一种利用重组Bacillus?subtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先获得新金色分枝杆菌中胆固醇氧化酶(ChoM)的基因扩增，然后利用pMA5质粒，实现了该基因在模式菌株枯草芽孢杆菌168中的过量表达。本发明构建以胆固醇为底物全细胞转化为方法的高产胆甾-4-烯-3-酮的枯草芽孢杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现胆固醇氧化酶的活力较出发菌株有了明显提高，以0.1％(w/v)胆固醇为底物，全细胞转化24h，底物摩尔转化率达到67％和83％，是出发菌株相对转化率的20和25倍。本发明为微生物一步发酵法生产胆甾-4-烯-3-酮的工业化提供了有益的指导。
【专利说明】—种利用重组Baci I Ius subti I is全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法
【技术领域】
[0001]一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾_4_烯_3_酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。
技术背景
[0002]留体药物可通过全合成或对天然留体化合物的降解和其官能团的转化获得，甾体药物具有很强的抗感染、刚过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年留体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6%。
[0003]甾体激素类药物分类:肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等。可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。 [0004]早期合成留体药物的原料大多从动物组织液中直接提取，由于这些原料的含量低、来源少、合成路线复杂、回收率低、代价高昂，不能满足生产的需要。薯蓣皂素的发现和应用，为留体药物的工业化生产提供了丰富而又廉价的原料，但是生产过程需要消耗大量的薯蓣皂素，使皂素价格不断上升，增加了生产成本，且生产过程严重污染环境。
[0005]胆甾-4-烯-3-酮，作为胆固醇的氧化产物，可作为减肥食品添加剂或抗高脂血症药物抑制人体内脂肪的积累防止发生肥胖及相应的一些症状，而且不会出现临床上的异常现象和致癌特征。在治疗肝病和防止皮肤角质化抵抗衰老也具有一定的价值，还可作为合成一些药物激素的重要原料。其合成方法有化学合成法和微生物转化法。微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家目前进行留体药物制备，大多以动植物留醇为起始原料进行微生物转化，得到留体药物中间体后，再进一步制备。
[0006]胆固醇氧化酶(Cholesteroloxidase, ChOx, ECl.1.3.6)又称 3_β -羟基氧化还原酶，是胆固醇代谢过程中的关键酶，属于黄素蛋白酶类，以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基，能专一性地催化胆固醇转化为胆留-4-烯-3-酮，它作为一种检测用酶，应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、医疗保健、临床监测、生物农药等方面具有广泛应用价值。对胆固醇氧化酶(ChOx)的深入研究对整个留体药物行业的发展意义深远。生产更高附加值的胆留-4-烯-3-酮最直接有效的方法就是以胆固醇为底物，通过微生物一步转化。
[0007]近年来，众多学者成功实现了来源于不同菌株的ChOx的外源表达。不同来源的ChOx在大肠杆菌系统中表达时，由于大肠杆菌菌株本身为条件致病菌,所以将ChOx在大肠杆菌中进行异源表达存在一定的安全隐患。
[0008]本发明通过质粒ρΜΑ5,实现了分枝杆菌胆固醇氧化酶ChoMl和ChoM2在Bacillussubtilisl68中的可溶性过量表达，酶活分别达到5.27U/mg和7.44U/mg，全细胞转化胆固醇24h后转化率达67%和83%。分枝杆菌ChoM在枯草系统中表达及全细胞转化胆固醇均为首次报道，且重组子表达的酶活及胆固醇的转化率均较高。枯草芽孢杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物留醇发酵工业潜在生产菌株。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供:通过基因工程手段来获得具有全细胞转化生产胆甾-4-烯-3-酮能力的微生物的方法。对构建的重组菌株进行酶活力及发酵性能进行研究发现胆固醇氧化酶ChoMl和ChoM2活力分别为出发菌的5.2和7.3倍左右，并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产胆留-4-烯-3-酮的工业化提供了有益的指导。
[0010]本发明的技术方案:是以基因工程为手段构建一株全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮B.subti I is，以TLC及HPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本发明成功构建了一株以胆固醇为底物全细胞转化为方法的高产胆留-4-烯-3-酮的枯草芽孢杆菌工程菌株，其胆固醇氧化酶活力和底物转化率较出发菌株有较大提高。
[0011]主要试剂:胆固醇购自国药集团化学试剂有限公司，胆甾-4-烯-3-酮购自美国SIGMA公司重组菌株构建方法:
[0012](I)胆固醇氧化酶(ChOx)基因全序列的克隆
[0013]根据GENBANK 网站公布的 Mycobacterium neoaurum strain NWIBL-0IchoMl 和choM2基因序列(JQ303323.2)，以及pMA5质粒上的酶切位点设计choMl和choM2基因引物。以制备的新金色分枝杆菌染色体DNA为模板，分别以choMlF、choMIR和choM2F、choM2R为引物，通过PCR扩增出choMl和choM2全序列。
[0014]PCR 反应体系:10 XExTaq Buffer5 μ L, dNTP4 μ L，模板 DNAl μ L，上下游引物各
0.5μ L, ExTaq 酶 I μ L, ddH20 补齐至总体积 50 μ L。PCR 反应条件:94°C 5min，94°C 30s,65°C 45s, 72°C 2min，循环 35 次，72°C IOmin, 12°C IOmin0
[0015](2)重组表达载体pMA5_choMl和pMA5_choM2的构建
[0016]参照上海捷瑞公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与PMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamHI/Nde I酶切释放出大小约为2.7kb和1.7kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-choMl和pMD18-T_choM2。
[0017]提取保存于E.coli JM109 中的质粒 pMA5、pMD18-T_choMl 和 pMD18-T_choM2，质粒 pMA5、pMD18-T-choMl 和 pMD18-T_choM2 经 BamH I/Nde I 双酶切，胶回收纯化，T4DNA 连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamHI/Ndel双酶切后释放出大小约为7.2kb和1.7kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMA5-choMl和pMA5_choM2。
[0018](3)重组质粒pMA5_choMl和pMA5_choM2化学转化法转化模式菌株B.subtilisl68
[0019]将经验证构建成功的 重组质粒pMA5_choMl和pMA5_choM2用化学转化法转化至模式菌株B.subtilisl68中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。
[0020](4)重组菌株B.subtilisl68阳性转化子的筛选；
[0021]挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。
[0022](5)重组B.subtilisl68培养条件、酶活测定、TLC及HPLC分析
[0023]培养条件:LB培养基:胆固醇lg/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨10g/l,酵母膏5g/L,NaC110g/L(固体培养基加入2%琼脂粉)
[0024]酶活测定方法:采用比色法测定。具体方法如下:取培养24h的菌液50mL，4°C，8，000r/min离心5min收集菌体,用50mL pH7.0的Tris-HCl缓冲液洗漆两次,重悬于5ml的该缓冲液中。冰浴中40%功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间lOmin。10, OOOr/min离心30min获得上清液，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下:31^溶液4(4_氨基-安替比林lmmol/L ;苯酚6mmol/L ;叠氮钠0.2g/L ;过氧化物酶5000U/L ;磷酸钾缓冲液25mmol/L,pH7.5)，150 μ L 溶液 Β(胆固醇 8.26g/L ;Triton X-1004.26%;异丙醇为溶剂)，50 μ L酶液，37°C反应5min，沸水浴3min，于500nm测定吸光值OD5tltl。酶活力单位定义:37°C温度下，Imin转化I μ mol胆 固醇生成胆留~4~烯-3-酮的酶量定义为I个酶活单位(U)。
[0025]TLC分析:重组B.subtilisl68以2%接种量接种于50ml发酵液，培养24h，按
0.1% (w/v)投胆固醇和0.1% (v/v) Tween-80，继续培养24h定时取样，进行TLC分析；TLC展开剂:石油醚/乙酸乙酯(6: 4) ;TLC显色:显色剂20%硫酸溶液，均匀喷洒，100°C烘烤五分钟对产物进行定性分析。
[0026]HPLC分析:胆甾-4-烯-3-酮在210nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法测定产物浓度。色谱条件:色谱柱=DimosoilC18(5 μ I, 250mmX4.6mm),流动相:乙腈-水(V/V = 85: 15)，检测器:UV Detector，检测波长:210nm，柱温:30°C，进样量:10yL，流速:1.0ml/mirio
[0027]本发明的有益效果:通过基因工程手段扩增本实验已有的具有胆固醇氧化酶能力的新金色分枝杆菌的该酶基因，借助本实验室已有的成熟的枯草表达体系，实现了胆固醇氧化酶基因在模式菌株B.subtilisl68中的过量表达。将该菌株以I %接种量接种于IOOmLLB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCl (pH7.0)缓冲液重悬，加入 0.1% (w/v)胆固醇和 0.1% (v/v)Tween-80,继续在 37°C, 160rpm 培养 24h。最终底物摩尔转化率达到67%和83%，比原始菌提高了约20和25倍。
[0028]将底物胆固醇一步转化成具有更高附加价值的胆甾-4-烯-3-酮，其具有重要的生理及医学作用，同时是重要的医药中间体；用微生物法生产胆留-4-烯-3-酮，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1胆甾-4-烯-3-酮标样HPLC检测图
[0030]图2重组菌株全细胞转化液TLC分析图[0031 ]Lane I，标样胆固醇；
[0032]Lane2，标样胆甾 _4_ 烯 _3_ 酮；
[0033]Lane3, B.subtilisl68/pMA5 全细胞转化液；
[0034]Lane4, B.subtiIis 168/pMA5-choMl 全细胞转化液；
[0035]Lane5, B.subtilisl68/pMA5_choM2 全细胞转化液。[0036]图3重组菌全细胞转化液中胆留-4-烯-3-酮的HPLC测定
[0037]具体实施方法
[0038]实施例1:重组B.subtilisl68菌株的构建
[0039]以实验室具有胆固醇氧化酶活力的新金色分枝杆菌作为出发菌株，以其染色体为模板，利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实现基因的大量扩增。将大量扩增的KSDD基因片段，纯化后连接到pMA5载体上，验证成功后，转化模式菌株枯草芽孢杆菌168。在抗性平板上筛选阳性转化子，接种摇瓶发酵，用TLC和HPLC检测发酵液中产物胆甾-4-烯-3-酮。检测到有产物胆留-4-烯-3-酮，说明构建成功了具有转化胆固醇为胆甾-4-烯-3-酮能力的重组菌株。本发明最终得到具有转化胆固醇为胆留-4-烯-3-酮的B.subtilisl68 菌株。
[0040]实施例2:重组菌株 的酶活力测定
[0041]菌株在LB培养基中过夜培养，8000rpm离心10min，pH7.0的50mM Tris-HCl缓冲液清洗3次，重悬于5ml的该缓冲液中。冰浴中40%功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间lOmin。10，OOOr/min离心30min获得上清液,上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下:3mL溶液A (4-氨基-安替比林lmmol/L ;苯酹6mmol/L ;叠氮钠0.2g/L ;过氧化物酶 5000U/L ;磷酸钾缓冲液 25mmol/L, ρΗ7.5), 150 μ L 溶液 B(胆固醇 8.26g/L ;TritonX-1004.26% ;异丙醇为溶剂)，50 μ L酶液，37°C反应5min，沸水浴3min，于500nm测定吸光值0D5(i(i。酶活力单位定义:37°C温度下，Imin转化I μ mol胆固醇生成胆甾_4_烯_3_酮的酶量定义为I个酶活单位(U)。测得重组菌株酶活为5.27U/mg和7.44U/mg。
[0042]实施例3:重组菌株全细胞转化性能检测
[0043]将该菌株以1%接种量接种于IOOmL LB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCl(pH7.0)缓冲液重悬，加入0.1% (w/v)胆固醇和0.1% (v/V) Tween-80,继续在37°C，160rpm培养24h。经HPLC检测分析后，如图3所示，最终底物摩尔转化率分别达到67%和83%，比原始菌提高了约20和25倍。
【权利要求】
1.重组表达载体pMA5-choMl和pMA5-choM2，其特征是:通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的choMl和choM2基因，分别与表达载体pMA5连接构建获得。
2.重组枯草芽孢杆菌，其特征是:将权利要求1中所述的重组载体pMA5-choMl和pMA5-choM2,用化学转化法分别转化菌株Bacillus subtilisl68,获得重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (pMA5-choMl)和Bacillus subtilis (pMA5_choM2),重组枯草芽抱杆菌ChoM酶活较基因来源菌有较大的提高。
3.将权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌全细胞转化胆固醇产胆留-4-烯-3-酮的方法，其特征是:将该菌株以I %接种量接种于IOOmL LB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗漆两次，用适当的50mM的Tris-HCl pH7.0缓冲液重新悬浮,加入0.1% (w/v)胆固醇和0.1% (v/v) Tween-80，在37 °C，160rpm培养24h。最终底物摩尔转化率达到67%和83%，比原始菌提高了约20和25 倍。
【文档编号】C12N15/75GK103981207SQ201410249906
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】饶志明, 许正宏, 邵明龙, 张显, 徐美娟, 杨套伟, 李会 申请人:江南大学
【专利摘要】一种利用重组Bacillus?subtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先获得新金色分枝杆菌中胆固醇氧化酶(ChoM)的基因扩增，然后利用pMA5质粒，实现了该基因在模式菌株枯草芽孢杆菌168中的过量表达。本发明构建以胆固醇为底物全细胞转化为方法的高产胆甾-4-烯-3-酮的枯草芽孢杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现胆固醇氧化酶的活力较出发菌株有了明显提高，以0.1％(w/v)胆固醇为底物，全细胞转化24h，底物摩尔转化率达到67％和83％，是出发菌株相对转化率的20和25倍。本发明为微生物一步发酵法生产胆甾-4-烯-3-酮的工业化提供了有益的指导。
【专利说明】—种利用重组Baci I Ius subti I is全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法
【技术领域】
[0001]一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾_4_烯_3_酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。
技术背景
[0002]留体药物可通过全合成或对天然留体化合物的降解和其官能团的转化获得，甾体药物具有很强的抗感染、刚过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年留体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6%。
[0003]甾体激素类药物分类:肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等。可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。 [0004]早期合成留体药物的原料大多从动物组织液中直接提取，由于这些原料的含量低、来源少、合成路线复杂、回收率低、代价高昂，不能满足生产的需要。薯蓣皂素的发现和应用，为留体药物的工业化生产提供了丰富而又廉价的原料，但是生产过程需要消耗大量的薯蓣皂素，使皂素价格不断上升，增加了生产成本，且生产过程严重污染环境。
[0005]胆甾-4-烯-3-酮，作为胆固醇的氧化产物，可作为减肥食品添加剂或抗高脂血症药物抑制人体内脂肪的积累防止发生肥胖及相应的一些症状，而且不会出现临床上的异常现象和致癌特征。在治疗肝病和防止皮肤角质化抵抗衰老也具有一定的价值，还可作为合成一些药物激素的重要原料。其合成方法有化学合成法和微生物转化法。微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家目前进行留体药物制备，大多以动植物留醇为起始原料进行微生物转化，得到留体药物中间体后，再进一步制备。
[0006]胆固醇氧化酶(Cholesteroloxidase, ChOx, ECl.1.3.6)又称 3_β -羟基氧化还原酶，是胆固醇代谢过程中的关键酶，属于黄素蛋白酶类，以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基，能专一性地催化胆固醇转化为胆留-4-烯-3-酮，它作为一种检测用酶，应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、医疗保健、临床监测、生物农药等方面具有广泛应用价值。对胆固醇氧化酶(ChOx)的深入研究对整个留体药物行业的发展意义深远。生产更高附加值的胆留-4-烯-3-酮最直接有效的方法就是以胆固醇为底物，通过微生物一步转化。
[0007]近年来，众多学者成功实现了来源于不同菌株的ChOx的外源表达。不同来源的ChOx在大肠杆菌系统中表达时，由于大肠杆菌菌株本身为条件致病菌,所以将ChOx在大肠杆菌中进行异源表达存在一定的安全隐患。
[0008]本发明通过质粒ρΜΑ5,实现了分枝杆菌胆固醇氧化酶ChoMl和ChoM2在Bacillussubtilisl68中的可溶性过量表达，酶活分别达到5.27U/mg和7.44U/mg，全细胞转化胆固醇24h后转化率达67%和83%。分枝杆菌ChoM在枯草系统中表达及全细胞转化胆固醇均为首次报道，且重组子表达的酶活及胆固醇的转化率均较高。枯草芽孢杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物留醇发酵工业潜在生产菌株。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供:通过基因工程手段来获得具有全细胞转化生产胆甾-4-烯-3-酮能力的微生物的方法。对构建的重组菌株进行酶活力及发酵性能进行研究发现胆固醇氧化酶ChoMl和ChoM2活力分别为出发菌的5.2和7.3倍左右，并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产胆留-4-烯-3-酮的工业化提供了有益的指导。
[0010]本发明的技术方案:是以基因工程为手段构建一株全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮B.subti I is，以TLC及HPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本发明成功构建了一株以胆固醇为底物全细胞转化为方法的高产胆留-4-烯-3-酮的枯草芽孢杆菌工程菌株，其胆固醇氧化酶活力和底物转化率较出发菌株有较大提高。
[0011]主要试剂:胆固醇购自国药集团化学试剂有限公司，胆甾-4-烯-3-酮购自美国SIGMA公司重组菌株构建方法:
[0012](I)胆固醇氧化酶(ChOx)基因全序列的克隆
[0013]根据GENBANK 网站公布的 Mycobacterium neoaurum strain NWIBL-0IchoMl 和choM2基因序列(JQ303323.2)，以及pMA5质粒上的酶切位点设计choMl和choM2基因引物。以制备的新金色分枝杆菌染色体DNA为模板，分别以choMlF、choMIR和choM2F、choM2R为引物，通过PCR扩增出choMl和choM2全序列。
[0014]PCR 反应体系:10 XExTaq Buffer5 μ L, dNTP4 μ L，模板 DNAl μ L，上下游引物各
0.5μ L, ExTaq 酶 I μ L, ddH20 补齐至总体积 50 μ L。PCR 反应条件:94°C 5min，94°C 30s,65°C 45s, 72°C 2min，循环 35 次，72°C IOmin, 12°C IOmin0
[0015](2)重组表达载体pMA5_choMl和pMA5_choM2的构建
[0016]参照上海捷瑞公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与PMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamHI/Nde I酶切释放出大小约为2.7kb和1.7kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-choMl和pMD18-T_choM2。
[0017]提取保存于E.coli JM109 中的质粒 pMA5、pMD18-T_choMl 和 pMD18-T_choM2，质粒 pMA5、pMD18-T-choMl 和 pMD18-T_choM2 经 BamH I/Nde I 双酶切，胶回收纯化，T4DNA 连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamHI/Ndel双酶切后释放出大小约为7.2kb和1.7kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMA5-choMl和pMA5_choM2。
[0018](3)重组质粒pMA5_choMl和pMA5_choM2化学转化法转化模式菌株B.subtilisl68
[0019]将经验证构建成功的 重组质粒pMA5_choMl和pMA5_choM2用化学转化法转化至模式菌株B.subtilisl68中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。
[0020](4)重组菌株B.subtilisl68阳性转化子的筛选；
[0021]挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。
[0022](5)重组B.subtilisl68培养条件、酶活测定、TLC及HPLC分析
[0023]培养条件:LB培养基:胆固醇lg/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨10g/l,酵母膏5g/L,NaC110g/L(固体培养基加入2%琼脂粉)
[0024]酶活测定方法:采用比色法测定。具体方法如下:取培养24h的菌液50mL，4°C，8，000r/min离心5min收集菌体,用50mL pH7.0的Tris-HCl缓冲液洗漆两次,重悬于5ml的该缓冲液中。冰浴中40%功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间lOmin。10, OOOr/min离心30min获得上清液，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下:31^溶液4(4_氨基-安替比林lmmol/L ;苯酚6mmol/L ;叠氮钠0.2g/L ;过氧化物酶5000U/L ;磷酸钾缓冲液25mmol/L,pH7.5)，150 μ L 溶液 Β(胆固醇 8.26g/L ;Triton X-1004.26%;异丙醇为溶剂)，50 μ L酶液，37°C反应5min，沸水浴3min，于500nm测定吸光值OD5tltl。酶活力单位定义:37°C温度下，Imin转化I μ mol胆 固醇生成胆留~4~烯-3-酮的酶量定义为I个酶活单位(U)。
[0025]TLC分析:重组B.subtilisl68以2%接种量接种于50ml发酵液，培养24h，按
0.1% (w/v)投胆固醇和0.1% (v/v) Tween-80，继续培养24h定时取样，进行TLC分析；TLC展开剂:石油醚/乙酸乙酯(6: 4) ;TLC显色:显色剂20%硫酸溶液，均匀喷洒，100°C烘烤五分钟对产物进行定性分析。
[0026]HPLC分析:胆甾-4-烯-3-酮在210nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法测定产物浓度。色谱条件:色谱柱=DimosoilC18(5 μ I, 250mmX4.6mm),流动相:乙腈-水(V/V = 85: 15)，检测器:UV Detector，检测波长:210nm，柱温:30°C，进样量:10yL，流速:1.0ml/mirio
[0027]本发明的有益效果:通过基因工程手段扩增本实验已有的具有胆固醇氧化酶能力的新金色分枝杆菌的该酶基因，借助本实验室已有的成熟的枯草表达体系，实现了胆固醇氧化酶基因在模式菌株B.subtilisl68中的过量表达。将该菌株以I %接种量接种于IOOmLLB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCl (pH7.0)缓冲液重悬，加入 0.1% (w/v)胆固醇和 0.1% (v/v)Tween-80,继续在 37°C, 160rpm 培养 24h。最终底物摩尔转化率达到67%和83%，比原始菌提高了约20和25倍。
[0028]将底物胆固醇一步转化成具有更高附加价值的胆甾-4-烯-3-酮，其具有重要的生理及医学作用，同时是重要的医药中间体；用微生物法生产胆留-4-烯-3-酮，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1胆甾-4-烯-3-酮标样HPLC检测图
[0030]图2重组菌株全细胞转化液TLC分析图[0031 ]Lane I，标样胆固醇；
[0032]Lane2，标样胆甾 _4_ 烯 _3_ 酮；
[0033]Lane3, B.subtilisl68/pMA5 全细胞转化液；
[0034]Lane4, B.subtiIis 168/pMA5-choMl 全细胞转化液；
[0035]Lane5, B.subtilisl68/pMA5_choM2 全细胞转化液。[0036]图3重组菌全细胞转化液中胆留-4-烯-3-酮的HPLC测定
[0037]具体实施方法
[0038]实施例1:重组B.subtilisl68菌株的构建
[0039]以实验室具有胆固醇氧化酶活力的新金色分枝杆菌作为出发菌株，以其染色体为模板，利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实现基因的大量扩增。将大量扩增的KSDD基因片段，纯化后连接到pMA5载体上，验证成功后，转化模式菌株枯草芽孢杆菌168。在抗性平板上筛选阳性转化子，接种摇瓶发酵，用TLC和HPLC检测发酵液中产物胆甾-4-烯-3-酮。检测到有产物胆留-4-烯-3-酮，说明构建成功了具有转化胆固醇为胆甾-4-烯-3-酮能力的重组菌株。本发明最终得到具有转化胆固醇为胆留-4-烯-3-酮的B.subtilisl68 菌株。
[0040]实施例2:重组菌株 的酶活力测定
[0041]菌株在LB培养基中过夜培养，8000rpm离心10min，pH7.0的50mM Tris-HCl缓冲液清洗3次，重悬于5ml的该缓冲液中。冰浴中40%功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间lOmin。10，OOOr/min离心30min获得上清液,上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下:3mL溶液A (4-氨基-安替比林lmmol/L ;苯酹6mmol/L ;叠氮钠0.2g/L ;过氧化物酶 5000U/L ;磷酸钾缓冲液 25mmol/L, ρΗ7.5), 150 μ L 溶液 B(胆固醇 8.26g/L ;TritonX-1004.26% ;异丙醇为溶剂)，50 μ L酶液，37°C反应5min，沸水浴3min，于500nm测定吸光值0D5(i(i。酶活力单位定义:37°C温度下，Imin转化I μ mol胆固醇生成胆甾_4_烯_3_酮的酶量定义为I个酶活单位(U)。测得重组菌株酶活为5.27U/mg和7.44U/mg。
[0042]实施例3:重组菌株全细胞转化性能检测
[0043]将该菌株以1%接种量接种于IOOmL LB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCl(pH7.0)缓冲液重悬，加入0.1% (w/v)胆固醇和0.1% (v/V) Tween-80,继续在37°C，160rpm培养24h。经HPLC检测分析后，如图3所示，最终底物摩尔转化率分别达到67%和83%，比原始菌提高了约20和25倍。
【权利要求】
1.重组表达载体pMA5-choMl和pMA5-choM2，其特征是:通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的choMl和choM2基因，分别与表达载体pMA5连接构建获得。
2.重组枯草芽孢杆菌，其特征是:将权利要求1中所述的重组载体pMA5-choMl和pMA5-choM2,用化学转化法分别转化菌株Bacillus subtilisl68,获得重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (pMA5-choMl)和Bacillus subtilis (pMA5_choM2),重组枯草芽抱杆菌ChoM酶活较基因来源菌有较大的提高。
3.将权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌全细胞转化胆固醇产胆留-4-烯-3-酮的方法，其特征是:将该菌株以I %接种量接种于IOOmL LB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗漆两次，用适当的50mM的Tris-HCl pH7.0缓冲液重新悬浮,加入0.1% (w/v)胆固醇和0.1% (v/v) Tween-80，在37 °C，160rpm培养24h。最终底物摩尔转化率达到67%和83%，比原始菌提高了约20和25 倍。
【文档编号】C12N15/75GK103981207SQ201410249906
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】饶志明, 许正宏, 邵明龙, 张显, 徐美娟, 杨套伟, 李会 申请人:江南大学
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