一种源于灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌的温度调控型启动子的制作方法
一种源于灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌的温度调控型启动子的制作方法
【专利摘要】本课题组前期筛选获得一株灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌JNB5-1，该菌株合成灵菌红素受温度的影响，即在相对低温(28℃)条件下发酵培养时产灵菌红素，而相对高温(37℃)条件下发酵培养不产灵菌红素。本发明在2DE的基础上首次研究了一种与灵菌红素合成受温度调控相关的温控型启动子，即灵菌红素合成途径中的氧甲基转移酶(PigF)基因上游的启动子。将该启动子导入大肠杆菌在不同温度条件(28℃和37℃)处理下，能够促进下游基因的表达，并且在28℃时的强度是37℃时的2.1倍。本发明中的温控型启动子为粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度影响的原因提供了新线索；为构建高产灵菌红素菌株、提高菌株产灵菌红素的温度适应性提供了理论指导。
【专利说明】一种源于灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌的温度调控型启 动子
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程【技术领域】，涉及一种源于灵菌红素高产菌株粘 质沙雷氏菌的温度调控型启动子。
【背景技术】
[0002] 启动子（promoter)是一段RNA聚合酶识别、结合和起始转录的特定DNA序列。启 动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达的空间、时间和表达强度等；是人们定向改 造生物的重要限制因素。生物在生长发育中可以根据自身和环境来定时、定位和定量的表 达特定基因，这种能力是通过生物体的DNA顺式作用元件（启动子、增强子、沉默子）、反式 作用因子和光、热等外界环境因素的相互作用来实现的，其中启动子的作用尤为关键。因 此，研究启动子的功能对于生物的生长发育和探讨生物适应环境的机制等均有重要意义。
[0003] 报告基因（r印orter gene)是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因，其与目的 基因融合后的表达产物可用来标定目的基因的表达调控。作为一种简便有效的方法，报告 基因在微生物检测和调控研究中正发挥着越来越重要的作用。报告基因在基因时空表达调 控中发挥着重要的作用，它是一种分析结构基因旁侧区域潜在的顺式作用元件和反式作用 因子相互作用的强有力的工具。其优点是简单方便、可靠、灵敏度高、适用于大规模的检测。 报告基因主要有氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶和荧光蛋白 等。目前，在动物、植物、微生物和医学等领域广泛应用的有氯霉素乙酰转移酶、半乳糖苷酶 和荧光蛋白。其中，氯霉素乙酰转移酶最早应用于检测生物体基因表达，其表达产物较稳 定，且在活性很低的水平就能被检测出来。
[0004] 本课题组前期从土壤中筛选获得一株灵菌红素（prodigiosin，PG)高产菌株粘质 沙雷氏菌（Serratia marcecens)JNB5-l，其灵菌红素的产量为6. 14g/L，达国内最高产量之 一。研究发现该菌株合成灵菌红素受温度的影响：在相对低温（28°C )条件下发酵培养时 产灵菌红素，而相对高温（37°C)条件下发酵培养不产灵菌红素。并且利用双向电泳和质谱 鉴定初步探究了温度对该菌合成灵菌红素受温度影响的原因，结果发现了灵菌红素合成途 径中的氧甲基转移酶（PigF)在不同温度（28°C和37°C )条件下的表达水平具有显著差异 性。
[0005] 本发明在以上基础上首次利用氯霉素乙酰转移酶（CAT)基因作为报告基因，通 过克隆氧甲基转移酶基因（pigF)上游启动子序列、构建启动子探测载体、转化大肠杆 菌。获得重组菌后对启动子进行功能验证，结果发现：携带氧甲基转移酶基因上游启动子 (P-p igF)的重组大肠杆菌在28 °C条件下CAT酶活力是5. 02U/mg ; 37 °C条件下CAT酶活力是 2. 39U/mg。因此，P-pigF具有启动子的活性，并且28°C条件下比37°C条件下的强度高2. 1 倍，即P-pigF受温度的调控。
[0006] 以上研究为粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度影响的原因提供了新线索；为进一 步研究粘质沙雷氏菌灵菌红素合成代谢奠定了基础；也为构建高产灵菌红素菌株、提高菌 株产灵菌红素的温度适应性提供了理论指导。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种温控型启动子，即氧甲基转移酶基因上游的启动子。 该启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，在本发明中简称为P-pigF。P-pigF能在不 同温度（28°C和37°C )条件下驱动报告基因（cat)的表达；并且该启动子受温度的调控，即 它在28°C时的强度是37°C时的2. 1倍。本发明还提供了含有目标启动子的核苷酸编码序 列的重组载体，它是通过将氧甲基转移酶基因上游的启动子插入载体的多克隆位点而得。
[0008] 本发明的技术方案：
[0009] 主要试剂：乙酰辅酶4仏〇6七71-(：(^)和5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）（0了他）等 购于Sigma公司。
[0010] 氧甲基转移酶（PigF)基因上游启动子重组探测载体的构建：
[0011] 1.粘质沙雷氏囷基因组DNA的提取
[0012] 1)挑取粘质沙雷氏菌单菌落接种于10mL LB培养基中，28°C 200r/min培养至对数 生长期。
[0013] 2)取上述菌液1. 5mL于离心管中，8000Xg离心5min，去上清。
[0014] 3)用0. 5mL TE缓冲液（pH8. 0)洗涤细胞2次，重悬细胞。
[0015] 4)加 20 μ L(10mg/mL)溶菌酶，混勻，37°C水浴 30min。
[0016] 5)加 100μ L10% SDS，混匀，37°C水浴 30min。
[0017] 6)加50 μ L蛋白酶K，65°C反应3h (每隔半小时混匀1次）。
[0018] 7)加入等体积的饱合酚，混匀，离心。上层溶液移入新的离心管中。
[0019] 8)重复上步骤1次，然后加入等体积的氯仿抽提2次，离心。
[0020] 9)上层溶液移入新的离心管中（注：尽量不要带入下层液体）。加入2倍体积的 无水乙醇沉淀，同时加入1/lOKAc。等待沉淀。
[0021] 10)离心去上清，用70%乙醇悬浮洗涤1次，离心，空离除尽液体，晾干。
[0022] 11)用50 μ LTE缓冲液溶解，_20°C保藏。
[0023] 2.目标启动子片段的克隆及序列分析
[0024] 利用 S. marcecens JNB5-1 染色体 DNA 和 pACYCDuet-1，P-pigF 和 cat 的上、下游 引物进行PCR扩增（扩增条件参照Ex Taq DNA聚合酶说明书）。将扩增出的目标启动子和 cat基因片段进行胶回收（参照胶回收试剂盒说明书），然后将回收产物分别与pMDIS-T载 体连接，转化E.coli JM109感受态细胞，筛选阳性转化子。提取重组质粒，酶切验证后送上 海生工测序。登陆 http://www. fruitfly. org/seq-tools/promoter. html，利用在线软件 (Berkeley Drosophila Genome Project)检测可能的启动子功能区域并分析其保守序列。
[0025] 3.携带目标启动子重组探测载体的构建
[0026] 将pMD18-T_cat用Pst I和Hind III双酶切后，胶回收cat片段与经相同限制性 内切酶线性化的质粒pMD18-T-PpigF经T4DNA连接酶连接过夜。转化E. coli JM109感受 态细胞，筛选阳性转化子。重组质粒进行酶切和PCR验证。
[0027] 4.大肠杆菌感受态细胞的制备及热击转化
[0028] 1)将E. coli JM109和E. coli BL21(DE3)过夜活化，然后转接并在37°C震荡培养 至 〇D6QQ 约为 0. 3-0. 4。
[0029] 2)将上述菌液置于冰上，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约lOmin (注：甘油和CaCl2溶 液同样置于冰上）。
[0030] 3)冷却后的菌液分装至1. 5mL离心管中（装液量约1. 2mL)，离心管迅速置于冰上 10min〇
[0031] 4)上述菌液4°C 5000Xg离心30s，迅速置于冰上静置2min。弃上清，用400yL 预冷的CaCl2重悬菌体，然后置于冰上放置15min。
[0032] 5)重复4)步骤一次。
[0033] 6)4°C 5000Xg离心30s，弃上清。用80yL预冷的CaCl2重悬菌体，然后加 40 μ L50%甘油，混匀，-40°C保藏备用。
[0034] 7)将基因连接产物（约10 μ L)和感受态细胞混匀，迅速置于冰上放置45min。
[0035] 8)将上述混合物进行热击（42°C水浴lmin30s)，冰上放置5min。
[0036] 9)加入800yL LB培养基，37°C震荡培养60min。5000Xg离心2min，弃上清（保 留约200 μ L细胞培养物）。涂布抗生素平板，筛选阳性转化子。
[0037] 启动子功能分析（不同温度下启动子强度分析）：
[0038] 挑取上述重组大肠杆菌菌落（在100 μ g/mL的氨苄青霉素平板上生长）接到 10mL LB培养基中，37°C 160r/min培养12h，然后转接到50mL培养基中，分别在28°C和 37°C，160r/min培养12h，收集发酵液。4°C 5000Xg离心5min收集菌体，用100mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)洗涤2遍。重悬细胞后在冰浴中超声破碎（（工作3秒间歇2秒））5min， 离心，取上清用于CAT酶活的测定。E. coli JM109作为阴性对照。
[0039] CAT 酶活测定参考文献，反应体系包括 250mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)，0· lmmol/ L aCetyl-C〇A，0.4mg/mL DTNB和适量的粗酶液。将上述反应混合物置于37°C水浴中温育 2min，加入氯霉素至终浓度为0. lmmol/L，混勻后立即测定光吸收值A412 ;以未加氯霉素的 反应液为对照。CAT酶活单位定义：在上述条件下，每分钟乙酰化1 μ mol氯霉素所需的酶 量为一个活力单位（U)。总蛋白含量采用Bradford法测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1启动子和报告基因 PCR产物电泳图；
[0041] 图 2pMD18_T-PpigF_cat 的酶切验证
[0042] 图3启动子重组探测载体PCR验证
[0043] 图4CAT酶活测定的结果
【具体实施方式】
[0044] 实施例1 :pigF上游启动子序列分析
[0045] 根据GenBank中报道的序列确定pigF的转录起始点，选取其上游579bp的序列， 并将其命名为 P_pigF。登陆 http: //www. fruitf ly. org/seq-tools/promoter. html，利用 在线软件（Berkeley Drosophila Genome Project)预测可能的启动子功能区域并分析其 保守序列。分析结果表明，一段得分为0.79的核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示
[0046] (gcgcctttgccacggtgtgcgaggaactctccacctttttatacttagggagccagcaatg)中存在 与细菌标准的-10区（TATAAT)和-35区（TTGACA)相似的序列，说明核心启动子区的可靠 性很高。目标启动子序列越接近上述保守序列，启动子的强度可能越高。
[0047] 实施例2 :启动子和报告基因的克隆
[0048] 根据启动子和报告基因的序列设计PCR引物。以S.marcecens JNB5-1染色体DNA 为模版，利用P-pigF上下游引物进行PCR扩增，得到大小约为579bp的目的基因片段（图 1);以pACY⑶uet-Ι为模版，利用cat基因上下游引物进行PCR扩增，得到大小约654bp的 cat片段（图1)。
[0049] P-pigF 引物序列为：F :5' -ACCCGTCTAGAAAAAAGCCTATGGCACGGCGG-3'
[0050] R :5, -CGCCTGCAGTGCTGGCTCCCTAGTCTAAAAAGG-3'
[0051] cat 引物序列为：F : 5 ' -CGCCTGCAGATGGAGAAAAAAATCACTGG-3 '
[0052] R :5, -CCCAAGCTTTCATTCTTCG TCACCTCC-3，
[0053] 扩增产物采用上海生工胶回收试剂盒回收，然后与pMDIS-T载体连接得到重组质 粒pMD18-T-PpigF和pMD18-T-cat，酶切验证后送上海生物工程有限公司测序。
[0054] 实施例3 :启动子重组探测载体的构建
[0055] 将pMD18-T_cat用Pst I和Hind III酶切，胶回收后与用相同限制性内切酶线性 化的pMD18-T-PpigF经T4DNA连接酶连接，构建重组载体pMD18-T-PpigF-cat，转化E. coli JM109感受态细胞，提取重组质粒进行酶切和PCR验证，如图2、3所示，pMD18-T-PpigF-cat 用Pst I和Hind III双酶切后得到3269bp和649bp的片段，表明启动子探测载体构建 成功。以携带启动子的重组质粒为模板进行PCR，扩增出启动子片段，与阳性对照（以 S.marcecens JNB5-1基因组DNA为模板）的片段大小一致，而阴性对照（以pMD18-T-cat 为模板）中无条带显示，表明启动子探测载体构建成功。
[0056] 实施例4 :不同温度条件下启动子强度分析
[0057] 挑取上述在100 μ g/mL的氨苄青霉素平板上生长的重组大肠杆菌菌落，接到 10mL LB培养基中，37°C 160r/min培养12h，然后转接到50mL培养基中，分别在28°C和 37°C，160r/min培养12h，收集发酵液。4°C 5000Xg离心5min收集菌体，用100mmol/L Tris-HCl (pH7. 8)洗涤2遍。重悬细胞后在冰浴中超声破碎（工作3秒间歇2秒）5min，离 心，取上清用于CAT酶活的测定。E. coli JM109作为阴性对照。
[0058] CAT 酶活测定反应体系包括 250mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)，0· lmmol/L acetyl-C〇A，0. 4mg/mL DTNB和适量的粗酶液。将上述反应混合物置于37°C水浴中温育 2min，加入氯霉素至终浓度为0. lmmol/L，混勻后立即测定光吸收值A412 ;以未加氯霉素的 反应液为对照。CAT酶活单位定义：在上述条件下，每分钟乙酰化1 μ mol氯霉素所需的酶 量为一个活力单位（U)。蛋白含量采用Bradford法测定。不同温度（28°C和37°C)条件 下测定CAT酶活力的结果如图4所示，阴性对照E. coli JM109无 CAT活性；E. coli JM109/ pMD18-T-PpigF-cat 在 28°C和 37°C 下的酶活分别为 5. 02U/mg 和 2. 39U/mg ;因此，P-pigF 具有启动子的功能，并且在28°C时的强度是37°C时的2. 1倍，即P-pigF受温度的调控。
[0001] 序列表 <110>江南大学 <120> -种高产灵歯红桌粘质沙冚氏菌温度凋控型启动了 <160> 1 <211> 61bp <212> DNA <213> Serratia marcecens <222> (1)..(61) <223>温度调控型启动了 <400> 1 1 GCGCCTTTGC CACGGTGTGC GAGGAACTCT CCACCTTTTT ATACTTAGGG AGCCAGCAAT 61 G
【权利要求】
1. PigF基因启动子，其中包含下述（a)?（d)中任意一项DNA: (a) SEQ ID NO :1 所示的 DNA ; (b) 包含SEQ ID NO :1所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA ; (c) 包含在SEQ ID NO :1所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱 基序列、并且具有启动子活性的DNA ; (d) 与SEQ ID NO :1所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性/来源 于沙雷氏菌属细菌的DNA。
2. -种质粒，其中含有权利要求1所述的PigF基因启动子。
3. 权利要求2所述的质粒，该质粒为pMD18-T-PpigF。
4. 一种质粒，将氯霉素乙酰转移酶基因 cat与权利要求3所述的质粒连接构建而获得。
5. 权利要求4所述的质粒，该质粒为pMD18-T-PpigF-cat。
6. -种转化细胞，其通过往宿主细胞中导入权利要求2、3、4或5所述的质粒而获得。
7. 权利要求6所述的转化细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。
8. 扩增权利要求1所述DNA分子全长或任以片段的引物对。
【文档编号】C12N15/11GK104059913SQ201410250011
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】饶志明, 杨套伟, 徐美娟, 张显, 徐虹 申请人:江南大学
【专利摘要】本课题组前期筛选获得一株灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌JNB5-1，该菌株合成灵菌红素受温度的影响，即在相对低温(28℃)条件下发酵培养时产灵菌红素，而相对高温(37℃)条件下发酵培养不产灵菌红素。本发明在2DE的基础上首次研究了一种与灵菌红素合成受温度调控相关的温控型启动子，即灵菌红素合成途径中的氧甲基转移酶(PigF)基因上游的启动子。将该启动子导入大肠杆菌在不同温度条件(28℃和37℃)处理下，能够促进下游基因的表达，并且在28℃时的强度是37℃时的2.1倍。本发明中的温控型启动子为粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度影响的原因提供了新线索；为构建高产灵菌红素菌株、提高菌株产灵菌红素的温度适应性提供了理论指导。
【专利说明】一种源于灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌的温度调控型启 动子
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程【技术领域】，涉及一种源于灵菌红素高产菌株粘 质沙雷氏菌的温度调控型启动子。
【背景技术】
[0002] 启动子（promoter)是一段RNA聚合酶识别、结合和起始转录的特定DNA序列。启 动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达的空间、时间和表达强度等；是人们定向改 造生物的重要限制因素。生物在生长发育中可以根据自身和环境来定时、定位和定量的表 达特定基因，这种能力是通过生物体的DNA顺式作用元件（启动子、增强子、沉默子）、反式 作用因子和光、热等外界环境因素的相互作用来实现的，其中启动子的作用尤为关键。因 此，研究启动子的功能对于生物的生长发育和探讨生物适应环境的机制等均有重要意义。
[0003] 报告基因（r印orter gene)是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因，其与目的 基因融合后的表达产物可用来标定目的基因的表达调控。作为一种简便有效的方法，报告 基因在微生物检测和调控研究中正发挥着越来越重要的作用。报告基因在基因时空表达调 控中发挥着重要的作用，它是一种分析结构基因旁侧区域潜在的顺式作用元件和反式作用 因子相互作用的强有力的工具。其优点是简单方便、可靠、灵敏度高、适用于大规模的检测。 报告基因主要有氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶和荧光蛋白 等。目前，在动物、植物、微生物和医学等领域广泛应用的有氯霉素乙酰转移酶、半乳糖苷酶 和荧光蛋白。其中，氯霉素乙酰转移酶最早应用于检测生物体基因表达，其表达产物较稳 定，且在活性很低的水平就能被检测出来。
[0004] 本课题组前期从土壤中筛选获得一株灵菌红素（prodigiosin，PG)高产菌株粘质 沙雷氏菌（Serratia marcecens)JNB5-l，其灵菌红素的产量为6. 14g/L，达国内最高产量之 一。研究发现该菌株合成灵菌红素受温度的影响：在相对低温（28°C )条件下发酵培养时 产灵菌红素，而相对高温（37°C)条件下发酵培养不产灵菌红素。并且利用双向电泳和质谱 鉴定初步探究了温度对该菌合成灵菌红素受温度影响的原因，结果发现了灵菌红素合成途 径中的氧甲基转移酶（PigF)在不同温度（28°C和37°C )条件下的表达水平具有显著差异 性。
[0005] 本发明在以上基础上首次利用氯霉素乙酰转移酶（CAT)基因作为报告基因，通 过克隆氧甲基转移酶基因（pigF)上游启动子序列、构建启动子探测载体、转化大肠杆 菌。获得重组菌后对启动子进行功能验证，结果发现：携带氧甲基转移酶基因上游启动子 (P-p igF)的重组大肠杆菌在28 °C条件下CAT酶活力是5. 02U/mg ; 37 °C条件下CAT酶活力是 2. 39U/mg。因此，P-pigF具有启动子的活性，并且28°C条件下比37°C条件下的强度高2. 1 倍，即P-pigF受温度的调控。
[0006] 以上研究为粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度影响的原因提供了新线索；为进一 步研究粘质沙雷氏菌灵菌红素合成代谢奠定了基础；也为构建高产灵菌红素菌株、提高菌 株产灵菌红素的温度适应性提供了理论指导。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种温控型启动子，即氧甲基转移酶基因上游的启动子。 该启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，在本发明中简称为P-pigF。P-pigF能在不 同温度（28°C和37°C )条件下驱动报告基因（cat)的表达；并且该启动子受温度的调控，即 它在28°C时的强度是37°C时的2. 1倍。本发明还提供了含有目标启动子的核苷酸编码序 列的重组载体，它是通过将氧甲基转移酶基因上游的启动子插入载体的多克隆位点而得。
[0008] 本发明的技术方案：
[0009] 主要试剂：乙酰辅酶4仏〇6七71-(：(^)和5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）（0了他）等 购于Sigma公司。
[0010] 氧甲基转移酶（PigF)基因上游启动子重组探测载体的构建：
[0011] 1.粘质沙雷氏囷基因组DNA的提取
[0012] 1)挑取粘质沙雷氏菌单菌落接种于10mL LB培养基中，28°C 200r/min培养至对数 生长期。
[0013] 2)取上述菌液1. 5mL于离心管中，8000Xg离心5min，去上清。
[0014] 3)用0. 5mL TE缓冲液（pH8. 0)洗涤细胞2次，重悬细胞。
[0015] 4)加 20 μ L(10mg/mL)溶菌酶，混勻，37°C水浴 30min。
[0016] 5)加 100μ L10% SDS，混匀，37°C水浴 30min。
[0017] 6)加50 μ L蛋白酶K，65°C反应3h (每隔半小时混匀1次）。
[0018] 7)加入等体积的饱合酚，混匀，离心。上层溶液移入新的离心管中。
[0019] 8)重复上步骤1次，然后加入等体积的氯仿抽提2次，离心。
[0020] 9)上层溶液移入新的离心管中（注：尽量不要带入下层液体）。加入2倍体积的 无水乙醇沉淀，同时加入1/lOKAc。等待沉淀。
[0021] 10)离心去上清，用70%乙醇悬浮洗涤1次，离心，空离除尽液体，晾干。
[0022] 11)用50 μ LTE缓冲液溶解，_20°C保藏。
[0023] 2.目标启动子片段的克隆及序列分析
[0024] 利用 S. marcecens JNB5-1 染色体 DNA 和 pACYCDuet-1，P-pigF 和 cat 的上、下游 引物进行PCR扩增（扩增条件参照Ex Taq DNA聚合酶说明书）。将扩增出的目标启动子和 cat基因片段进行胶回收（参照胶回收试剂盒说明书），然后将回收产物分别与pMDIS-T载 体连接，转化E.coli JM109感受态细胞，筛选阳性转化子。提取重组质粒，酶切验证后送上 海生工测序。登陆 http://www. fruitfly. org/seq-tools/promoter. html，利用在线软件 (Berkeley Drosophila Genome Project)检测可能的启动子功能区域并分析其保守序列。
[0025] 3.携带目标启动子重组探测载体的构建
[0026] 将pMD18-T_cat用Pst I和Hind III双酶切后，胶回收cat片段与经相同限制性 内切酶线性化的质粒pMD18-T-PpigF经T4DNA连接酶连接过夜。转化E. coli JM109感受 态细胞，筛选阳性转化子。重组质粒进行酶切和PCR验证。
[0027] 4.大肠杆菌感受态细胞的制备及热击转化
[0028] 1)将E. coli JM109和E. coli BL21(DE3)过夜活化，然后转接并在37°C震荡培养 至 〇D6QQ 约为 0. 3-0. 4。
[0029] 2)将上述菌液置于冰上，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约lOmin (注：甘油和CaCl2溶 液同样置于冰上）。
[0030] 3)冷却后的菌液分装至1. 5mL离心管中（装液量约1. 2mL)，离心管迅速置于冰上 10min〇
[0031] 4)上述菌液4°C 5000Xg离心30s，迅速置于冰上静置2min。弃上清，用400yL 预冷的CaCl2重悬菌体，然后置于冰上放置15min。
[0032] 5)重复4)步骤一次。
[0033] 6)4°C 5000Xg离心30s，弃上清。用80yL预冷的CaCl2重悬菌体，然后加 40 μ L50%甘油，混匀，-40°C保藏备用。
[0034] 7)将基因连接产物（约10 μ L)和感受态细胞混匀，迅速置于冰上放置45min。
[0035] 8)将上述混合物进行热击（42°C水浴lmin30s)，冰上放置5min。
[0036] 9)加入800yL LB培养基，37°C震荡培养60min。5000Xg离心2min，弃上清（保 留约200 μ L细胞培养物）。涂布抗生素平板，筛选阳性转化子。
[0037] 启动子功能分析（不同温度下启动子强度分析）：
[0038] 挑取上述重组大肠杆菌菌落（在100 μ g/mL的氨苄青霉素平板上生长）接到 10mL LB培养基中，37°C 160r/min培养12h，然后转接到50mL培养基中，分别在28°C和 37°C，160r/min培养12h，收集发酵液。4°C 5000Xg离心5min收集菌体，用100mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)洗涤2遍。重悬细胞后在冰浴中超声破碎（（工作3秒间歇2秒））5min， 离心，取上清用于CAT酶活的测定。E. coli JM109作为阴性对照。
[0039] CAT 酶活测定参考文献，反应体系包括 250mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)，0· lmmol/ L aCetyl-C〇A，0.4mg/mL DTNB和适量的粗酶液。将上述反应混合物置于37°C水浴中温育 2min，加入氯霉素至终浓度为0. lmmol/L，混勻后立即测定光吸收值A412 ;以未加氯霉素的 反应液为对照。CAT酶活单位定义：在上述条件下，每分钟乙酰化1 μ mol氯霉素所需的酶 量为一个活力单位（U)。总蛋白含量采用Bradford法测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1启动子和报告基因 PCR产物电泳图；
[0041] 图 2pMD18_T-PpigF_cat 的酶切验证
[0042] 图3启动子重组探测载体PCR验证
[0043] 图4CAT酶活测定的结果
【具体实施方式】
[0044] 实施例1 :pigF上游启动子序列分析
[0045] 根据GenBank中报道的序列确定pigF的转录起始点，选取其上游579bp的序列， 并将其命名为 P_pigF。登陆 http: //www. fruitf ly. org/seq-tools/promoter. html，利用 在线软件（Berkeley Drosophila Genome Project)预测可能的启动子功能区域并分析其 保守序列。分析结果表明，一段得分为0.79的核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示
[0046] (gcgcctttgccacggtgtgcgaggaactctccacctttttatacttagggagccagcaatg)中存在 与细菌标准的-10区（TATAAT)和-35区（TTGACA)相似的序列，说明核心启动子区的可靠 性很高。目标启动子序列越接近上述保守序列，启动子的强度可能越高。
[0047] 实施例2 :启动子和报告基因的克隆
[0048] 根据启动子和报告基因的序列设计PCR引物。以S.marcecens JNB5-1染色体DNA 为模版，利用P-pigF上下游引物进行PCR扩增，得到大小约为579bp的目的基因片段（图 1);以pACY⑶uet-Ι为模版，利用cat基因上下游引物进行PCR扩增，得到大小约654bp的 cat片段（图1)。
[0049] P-pigF 引物序列为：F :5' -ACCCGTCTAGAAAAAAGCCTATGGCACGGCGG-3'
[0050] R :5, -CGCCTGCAGTGCTGGCTCCCTAGTCTAAAAAGG-3'
[0051] cat 引物序列为：F : 5 ' -CGCCTGCAGATGGAGAAAAAAATCACTGG-3 '
[0052] R :5, -CCCAAGCTTTCATTCTTCG TCACCTCC-3，
[0053] 扩增产物采用上海生工胶回收试剂盒回收，然后与pMDIS-T载体连接得到重组质 粒pMD18-T-PpigF和pMD18-T-cat，酶切验证后送上海生物工程有限公司测序。
[0054] 实施例3 :启动子重组探测载体的构建
[0055] 将pMD18-T_cat用Pst I和Hind III酶切，胶回收后与用相同限制性内切酶线性 化的pMD18-T-PpigF经T4DNA连接酶连接，构建重组载体pMD18-T-PpigF-cat，转化E. coli JM109感受态细胞，提取重组质粒进行酶切和PCR验证，如图2、3所示，pMD18-T-PpigF-cat 用Pst I和Hind III双酶切后得到3269bp和649bp的片段，表明启动子探测载体构建 成功。以携带启动子的重组质粒为模板进行PCR，扩增出启动子片段，与阳性对照（以 S.marcecens JNB5-1基因组DNA为模板）的片段大小一致，而阴性对照（以pMD18-T-cat 为模板）中无条带显示，表明启动子探测载体构建成功。
[0056] 实施例4 :不同温度条件下启动子强度分析
[0057] 挑取上述在100 μ g/mL的氨苄青霉素平板上生长的重组大肠杆菌菌落，接到 10mL LB培养基中，37°C 160r/min培养12h，然后转接到50mL培养基中，分别在28°C和 37°C，160r/min培养12h，收集发酵液。4°C 5000Xg离心5min收集菌体，用100mmol/L Tris-HCl (pH7. 8)洗涤2遍。重悬细胞后在冰浴中超声破碎（工作3秒间歇2秒）5min，离 心，取上清用于CAT酶活的测定。E. coli JM109作为阴性对照。
[0058] CAT 酶活测定反应体系包括 250mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)，0· lmmol/L acetyl-C〇A，0. 4mg/mL DTNB和适量的粗酶液。将上述反应混合物置于37°C水浴中温育 2min，加入氯霉素至终浓度为0. lmmol/L，混勻后立即测定光吸收值A412 ;以未加氯霉素的 反应液为对照。CAT酶活单位定义：在上述条件下，每分钟乙酰化1 μ mol氯霉素所需的酶 量为一个活力单位（U)。蛋白含量采用Bradford法测定。不同温度（28°C和37°C)条件 下测定CAT酶活力的结果如图4所示，阴性对照E. coli JM109无 CAT活性；E. coli JM109/ pMD18-T-PpigF-cat 在 28°C和 37°C 下的酶活分别为 5. 02U/mg 和 2. 39U/mg ;因此，P-pigF 具有启动子的功能，并且在28°C时的强度是37°C时的2. 1倍，即P-pigF受温度的调控。
[0001] 序列表 <110>江南大学 <120> -种高产灵歯红桌粘质沙冚氏菌温度凋控型启动了 <160> 1 <211> 61bp <212> DNA <213> Serratia marcecens <222> (1)..(61) <223>温度调控型启动了 <400> 1 1 GCGCCTTTGC CACGGTGTGC GAGGAACTCT CCACCTTTTT ATACTTAGGG AGCCAGCAAT 61 G
【权利要求】
1. PigF基因启动子，其中包含下述（a)?（d)中任意一项DNA: (a) SEQ ID NO :1 所示的 DNA ; (b) 包含SEQ ID NO :1所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA ; (c) 包含在SEQ ID NO :1所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱 基序列、并且具有启动子活性的DNA ; (d) 与SEQ ID NO :1所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性/来源 于沙雷氏菌属细菌的DNA。
2. -种质粒，其中含有权利要求1所述的PigF基因启动子。
3. 权利要求2所述的质粒，该质粒为pMD18-T-PpigF。
4. 一种质粒，将氯霉素乙酰转移酶基因 cat与权利要求3所述的质粒连接构建而获得。
5. 权利要求4所述的质粒，该质粒为pMD18-T-PpigF-cat。
6. -种转化细胞，其通过往宿主细胞中导入权利要求2、3、4或5所述的质粒而获得。
7. 权利要求6所述的转化细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。
8. 扩增权利要求1所述DNA分子全长或任以片段的引物对。
【文档编号】C12N15/11GK104059913SQ201410250011
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】饶志明, 杨套伟, 徐美娟, 张显, 徐虹 申请人:江南大学
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