11a型肺炎球菌单克隆抗体及其应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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11a型肺炎球菌单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种11A型肺炎球菌单克隆抗体杂交瘤细胞株Sino11A,其保藏编号为CGMCC?No.9234。本发明的单克隆抗体特异性好、抗体水平高且能长期保存,可用于肺炎球菌11A型多糖和肺炎多糖疫苗中11A型多糖含量的检测。
【专利说明】11A型肺炎球菌单克隆抗体及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学检测领域,具体地说,涉及11A型肺炎球菌单克隆抗体及其应 用。

【背景技术】
[0002] 肺炎抗体是指动物抗肺炎球菌各型别荚膜多糖产生的的IgG、IgM等类型抗体的 总称,广泛应用于肺炎链球菌菌株鉴定、肺炎多糖疫苗以及肺炎结合疫苗中各型别多糖的 定性和定量检测。
[0003] 目前世界上广泛应用的肺炎抗体主要来自兔血清。丹麦血清研究所(SSI)使用各 型别肺炎球菌静脉注射兔子,制备兔抗各型肺炎荚膜多糖的血清,应用于肺炎球菌菌种鉴 定以及肺炎荚膜多糖含量测定等实验。由于肺炎荚膜多糖成分复杂,许多型别之间存在交 叉反应(如6A和6B,19A和19F等),使用此方法制备的肺炎多糖抗体为多抗的混合物,特 异性差,不同型别之间存在交叉反应,只有通过多次菌体吸附,才能降低交叉作用的发生, 因而给鉴定工作带来不必要的麻烦,同时增加了实验误差,此外,该方法制备的抗体水平较 低,抗体滴度小,抗体效价不高,稳定性差,易降解,为抗体的长久保存带来困难。因此,制备 出特异性好、抗体滴度高且稳定性好的肺炎多糖抗体成为了亟待解决的问题。


【发明内容】

[0004] 为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种特异性好、抗体水平 高且能长期保存的11A型肺炎球菌单克隆抗体。
[0005] 为了实现本发明目的,本发明通过将免疫肺炎多糖原液的小鼠脾细胞与骨髓瘤细 胞融合,分离出能够分泌肺炎抗体的单克隆杂交瘤细胞,接种小鼠腹腔,制备含有特异性肺 炎抗体的腹水,经过后期处理并验证,得到一种特异性好、抗体水平高且能长期保存的肺 炎抗体。
[0006] 本发明首先提供了一种肺炎11A型单抗杂交瘤细胞株SinollA。该杂交瘤细胞株 现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址北京市朝阳区北辰西路 1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101,保藏编号CGMCC No. 9234,保藏日期 2014年5月26日。
[0007] 本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
[0008] 具体而言,本发明采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备11A型肺炎球菌单克隆抗 体,包括如下步骤:
[0009] 1)动物免疫
[0010] 11A型肺炎球菌多糖原液与弗氏完全佐剂等体积混合后进行乳化背部皮下注射小 鼠,后与弗氏不完全佐剂等体积混合后乳化进行第二次和第三次免疫,若第三次免疫后,抗 体效价经ELISA方法检测抗体滴度在10000以上,则认为合格,腹腔注射11A型肺炎多糖原 液进行加强免疫,不用乳化,剂量与前三次相同。
[0011] 2)脾细胞融合
[0012] 将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按一定比例混合,37°C水浴融合。将PEG滴入混合 系中;缓慢加入无血清的頂DM培养基,离心弃去上清后加入MDM完全培养液,将混悬液分 别加至96孔细胞培养板中,C02培养箱内培养后,添加 HAT培养液。
[0013] 3)杂交瘤细胞长至一定程度时进行抗体ELISA检测,及时做亚克隆。将HT培养 基稀释的杂交瘤细胞加入96孔板培养。培养两周后将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培 养,并冻存。
[0014] 4)冻存的单克隆细胞进行复苏,培养,25ml的细胞培养瓶细胞覆盖瓶底 70% -80 %时进行腹腔接种Balb/c雌性小鼠,定期收集腹水。
[0015] 进一步地,本发明还提供了包括上述单克隆抗体的试剂盒,用于检测肺炎球菌11A 型多糖。
[0016] 进一步地,所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。
[0017] 作为优选,所述标记为酶标记。
[0018] 更为优选,所述标记为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。
[0019] 本发明还提供了所述单克隆抗体在检测肺炎多糖疫苗中11A型多糖含量中的应 用。
[0020] 作为优选,所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。
[0021] 本发明采用11A型多糖原液免疫小鼠,制备小鼠脾细胞并与骨髓瘤细胞进行融 合,制备能够分泌11A型单克隆抗体的单克隆细胞株,腹腔接种小鼠制备11A型单抗腹水。
[0022] 本发明的有益效果在于:
[0023] 1、使用11A型肺炎多糖原液与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠,与菌体免疫相比具有较 好的特异性。
[0024] 2、筛选杂交瘤细胞时,除用11A型多糖检测细胞上清为阳性外,还用CPS多糖检测 细胞上清为阴性,确保杂交瘤细胞分泌的抗体只是针对11A型多糖,不含抗CPS多糖的抗 体。
[0025] 3、制备的11A型单抗腹水经过验证后,可以用于速率免疫浊度法检测11A型多糖 含量、双抗体夹心法检测肺炎多糖含量,以及进行酶标记之后制备酶标二抗。
[0026] 本发明克服了现有肺炎抗体存在交叉反应、抗体水平低、抗体效价差等缺点,通过 将免疫肺炎多糖原液的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,分离出能够分泌肺炎抗体的单克隆 杂交瘤细胞,接种小鼠腹腔,制备含有特异性肺炎抗体的腹水,经过后期处理并验证,得到 一种特异性好、抗体水平高且能长期保存的肺炎抗体。

【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
[0028] 实施例1
[0029] 1.动物免疫
[0030] 用含有11A型肺炎球菌多糖的样品添加或者不添加佐剂,背部皮下注射Balb/c小 鼠,总量0. 2ml (可不用多点注射),每只免疫0. 1-8 μ gllA型多糖原液;间隔14天后进行 第二次免疫,采用佐剂与〇. 1-8 μ gllA型多糖原液等体积混合后乳化,总量0. 2ml ;再次间 隔14天后进行第三次免疫,采用佐剂与0. l-8ygllA型多糖原液等体积混合后乳化,总量 0.2ml。第三次免疫后一周小鼠尾部静脉采血(或眼眶采血),检测血清的抗体滴度。若第 三次免疫后,抗体效价经ELISA方法检测抗体滴度在10000以上,则认为合格;第三次免疫 后3周-4周左右对抗体效价合格的小鼠腹腔注射11A型肺炎多糖原液进行加强免疫,不用 佐剂乳化,剂量与前三次相同。
[0031] 2.脾细胞融合
[0032] 2. 1骨髓瘤细胞的准备:细胞融合前两周复苏培养SP2/0_Agl4细胞株,融合前3 天扩大培养,融合前1天将细胞培养液去除,重新添加培养液。
[0033] 2. 2脾细胞制备:处死进行动物免疫的小鼠,按照常规方法制备小鼠脾细胞悬液
[0034] 2. 3细胞融合:
[0035] (1)根据计数结果将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0分别加入适量不完全IMDM培养 液,SP2/0细胞晃动混匀,脾细胞用吹打均匀。
[0036] (2)将脾细胞与SP2/0细胞按一定比例混合于一支50ml离心管中,混匀。
[0037] (3)加不完全頂DM培养液至50ml,离心5min,将上清尽量倒净,可用移液枪将管口 液体吸净。
[0038] (4)轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀,离心管置37°C水浴,准备融合。
[0039] (5)将37°C保温的PEGlml,用滴管缓慢滴入离心管,边滴边转动离心管,使细胞保 存在混匀状态。
[0040] (6)静置90s,立即在2-4min内缓慢加入15ml无血清的頂DM培养基(37°C ),尽 可能不搅动细胞。
[0041] (7)离心5分钟,弃去上清。
[0042] (8)加入IMDM完全培养液,轻轻混勻,将混悬液分别加至96孔细胞培养板中,每孔 100 μ 1。
[0043] (9)将培养板置37°C,5% C02培养箱内培养。
[0044] (10)融合第2天,添加 HAT培养液,每孔100 μ 1。
[0045] (11)每2-3天换一次HAT培养液,连续两周观察杂交瘤是否出现,两周后换用ΗΤ 培养基,观察融合细胞的生长状况。
[0046] 3.杂交瘤细胞的筛选:脾细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况,待其 长至孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。阳性孔细胞转入24孔板扩大培 养,及时做亚克隆。
[0047] 通过3次的亚克隆得到可以稳定分泌抗体的细胞系,将杂交瘤细胞SinollA进行 保藏,保藏号CGMCC N0. 9234 ;保藏时间:2014年5月26日;保藏单位:中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物 研究所,邮编100101。
[0048] 4.杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法):
[0049] (1)杂交瘤细胞计数,用含20%血清的HT培养基稀释杂交瘤细胞。
[0050] (2)将稀释的杂交瘤细胞加入96孔板培养,每孔100 μ 1。
[0051] (3) 37°C、5 % C02湿润培养7-10天,待出现肉眼可见的克隆,及时检测抗体活性。 在倒置显微镜下观察,标出只有单个克隆生长的孔,取上清作抗体检测。
[0052] (4)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
[0053] (5)每个克隆应尽快冻存。
[0054] 5.单抗细胞株腹水制备:按照常规方法将冻存的单克隆细胞进行复苏,培养,镜 下观察细胞生长状况,25ml的细胞培养瓶细胞覆盖瓶底70% -80%时即可进行接种;按照 常规方法腹腔接种Balb/c雌性小鼠,定期收集腹水。
[0055] 6.肺炎单抗腹水验证:使用速率免疫浊度方法检测不同稀释度的11A型肺炎单抗 腹水与11A型肺炎多糖标准品的反应值,观察反应趋势,确定可用性。
[0056] 6. 1速率免疫浊度法检测11A型多糖标准品反应值,如表1所示:
[0057] 表1不同来源11A型肺炎抗体与标准多糖反应值
[0058]

【权利要求】
1. 11A型肺炎球菌单克隆抗体杂交瘤细胞株SinollA,其保藏编号为CGMCC No. 9234。
2. 由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3. 包括权利要求2所述的单克隆抗体的试剂盒。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述单克隆抗体经生物标记或化学标 记。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述单克隆抗体经酶标记。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或 碱性磷酸酶标记。
7. 根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于肺炎球菌11A型多糖的 检测。
8. 权利要求2所述单克隆抗体在检测肺炎多糖疫苗中11A型多糖含量中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。
10. 根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱 性磷酸酶标记。
【文档编号】C12N5/20GK104140955SQ201410250080
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】陈磊, 王欣, 童钦, 李育荣, 王琳, 蔡芳, 高强, 尹卫东 申请人:北京科兴中维生物技术有限公司

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