一种嗜盐古菌及其应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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一种嗜盐古菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种嗜盐古菌(Haloarchaeon?B13-RDX),其生物保藏信息为CGMCC?No.9210。本发明公开的嗜盐古菌用于降解菊酯类农药具有很好的生物活性。
【专利说明】一种嗜盐古菌及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种嗜盐古菌,属于生物科学领域。

【背景技术】
[0002] 随着农业生产的发展,为了有效防治病虫害获得更高的农作物产量,农药的使用 量越来越大,由此造成了严重的环境污染问题。
[0003] 在这之中,拟除虫菊酯类(Pyrethroids)农药由于具有性质稳定,不易光解,无特 殊臭味及安全系数高,使用浓度低,触杀作用强,灭虫速度快,残效时间长等优点,在农业领 域被广泛的大量使用,但是自然界并无法有效分解该类农药残留,其广泛应用对生态环境 产生了不良影响,时有发生引起人的急慢性中毒事件。因此寻找能够有效消除环境中的拟 除虫菊酯类农药残留的方法已成为农药领域迫切需要解决的问题之一。
[0004] 在这个问题上,由于生物菌种能够通过自身的生命代谢活动降解环境中的有 毒、有害物质,在有害物质降解领域得到广泛应用。迄今为止,研究人员已从土壤、污 泥、污水、天然水体、垃圾场和厩肥中分离到降解不同农药的活性微生物,已有的这些 微生物主要集中在降解有机磷和除草剂方面,对上述的菊酯类农药很少涉及。尽管在 传统的菌株分离中也发现了假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘 氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)、 气单胞菌属(Aeromonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、耶尔森菌属(Yersinia)、寡养单胞 菌属(Stenotrophomonas)、克雷伯菌属(Klebsiella)、无色杆菌属(Achromobacter)、 产碱杆菌(Alcaigebes)、酸单胞菌属(Acidomonas)、弗拉特氏菌属(Frateuria)、微 球菌属(Micrococcus)、库特氏菌属(Kurthia)、中华根瘤菌属(Sinorhizbium);真菌 5 属:曲霉菌(Aspergillus)、木霉菌属(Trichoderma)、白腐菌属(Phanerochaete)、 镰孢霉属(Fusarium sp.)、毛链孢属(Monilpchaetes);放线菌5属:链轮丝菌属 (StreptoverticiIlium baldacci)、链霉菌属(Strepomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia Trevisan)、红球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)等菌株对降解降解拟除虫菊 酯类农药具有一定的效果,但这些菌株均存在讲解效率较低、耐药性较差的缺陷,实用价值 不大,无法满足大规模农业应用的需求。


【发明内容】

[0005] 在长期的研究中, 申请人:从罗布泊不同地区不同地点的区域考查采样,从各类干 盐湖中分离筛选出一批嗜盐古菌,并欣喜的发现其中的1株以溴氰菊酯,联苯菊酯,甲氰菊 酯等菊酯类农药作为碳源可以生长的嗜盐古菌对菊酯类农药具有非常理想的降解能力和 耐药性。基于上述发现, 申请人:完成了本发明。
[0006] 首先,本发明公开了一种嗜盐古菌,分类命名为Haloarchaeon sp. B13-RDX,其保 藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏日期为2014年2月24日,保藏编 号为 CGMCC No. 9210。
[0007] 申请人:进行的实验研究显示,该菌株对常见的菊酯类农药,包括但不限于溴氰菊 酯,联苯菊酯,甲氰菊酯等,具有不低于95%的降解率,并且在农药浓度高达100-200mg/L 的情况下降解率依旧保持在80%以上,适于大规模使用用于降解菊酯类农药残留。
[0008] 其次,由于本发明的嗜盐古菌具有上述优越的生物活性,因此本发明相应公开了 该嗜盐古菌在降解菊酯类农药中的应用。
[0009] 其中,上述的降解菊酯类农药包括但不限于联苯菊酯、甲氰菊酯或溴氰菊酯,除了 这几种常见品种以外,其它的菊酯类农药也可采用本发明的菌株进行降解。
[0010]为了最优化上述菌种的生物活性,上述嗜盐古菌优选在CM液体培养基中振荡培 养然后再接种到含有菊酯类农药的CM液体培养基中。
[0011] 其中,为了平衡菌株生长所需碳源和菌株生长量对降解率的影响, 申请人:广泛研 究了多种接种量(质量计)与最终降解率之间的关系,发现在接种量为4%时,降解率能够 达到95% ;继续提高接种量则会因为微生物数量增加,导致生长所需的碳源不足,影响了菌 株的活性,使得降解率出现下降,因此优选的,接种量为4%。
[0012] 同时, 申请人:还研究了不同浓度的菊酯类农药对菌株降解菊酯类农药的降解 率的影响, 申请人:发现随着浓度升高降解率呈现逐渐下降的趋势,当菊酯类农药浓度在 100-200mg/L时,降解率均在80%以上;当浓度在100mg/L及以下时,降解率可达到95%以 及更高的水平。因此,优选的,所述菊酯类农药浓度不高于200mg/L,更优选其为100mg/L。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1、2分别为本发明嗜盐菌B13-RDX菌株的革兰氏染色图片、电子显微镜照片 (X 10000);
[0014] 图3为采用邻接法基于本发明菌株的16S rRNA序列构建的发育系统树;
[0015] 图4为3种菊酯类农药混合标准色谱图,其中1.联苯菊酯;2.甲氰菊酯;3.溴氰 菊酯异构体;4.溴氰菊酯;
[0016] 图5为菌株B13-RDX生长和农药降解率的关系曲线;
[0017] 图6为不同的接种量对B13-RDX降解3种农药性能的影响;

【具体实施方式】
[0018] 在下述实施例中,涉及的原料包括:
[0019] 1. 1菌株样品:样品的采集和处理从新疆罗布泊地区不同距离和不同生态点,根 据不同的植被和土壤,挑选样区,分别采集土样装入无菌离心管内带回实验室,于4°C保存。
[0020] 1. 2培养基:CM培养基(complex medium, CM),常规生物菌种培养基,各厂商出 产的此类培养基组成大体相同,略有差异,但不影响培养基的活性。典型的组成如下: Casamino acid(Difco)酪蛋白氨基酸 7.5g/L,Yeast extract(Difco)酵母抽提物 10.0g/ L,柠檬酸三钠 3. 0g/L,MgS04 ·7Η20 20. 0g/L,KCl 2. 0g/L,FeCl2 ·6Η20 10ppm,NaCl 200. 0g/ L, pH 7. 0-7. 2 ;
[0021] 牛奶-盐-琼脂培养基(1)脱脂牛奶150ml,8磅20min灭菌;(2)无机盐溶液30ml, 8磅30min灭菌,包括MgS0 4 · 7H20 3g,NaCl 60g,KN03 0. 6g,微量柠檬酸铁;(3)琼脂溶液 120ml,8 镑 30min 灭菌,包括 Casamino acid(Difco) 1. 5g,甘油 3g,琼脂 4. 5g。无菌操作将 ⑵和(3)混匀,用NaOH调pH至7· 0,然后混入⑴摇匀。
[0022] 1. 3主要菊酯类农药试剂:10%联苯菊酯,2. 5 %溴氰菊酯,20 %甲氰菊酯购自新 疆乌鲁木齐北站农产品市场。溴氰菊酯,联苯菊酯,甲氰菊酯标准品购自天津一方科 技有限公司,浓度为l〇〇ug/ml。
[0023] 实施例1 :嗜盐古菌Haloarchaeon B13-RDX的分离
[0024] 首先进行菌株的分离:采用倍比稀释法涂布,37°C光照培养7d,挑去平板上的菌 落,在平板上反复划线直到菌落的颜色、大小、形态完全一致,记录菌落形态;将纯化的菌 落在平板上于4°C保存。牛奶-盐-琼脂平板上观察单菌落的形态特征及颜色。
[0025] 然后进行菌株的筛选:在l〇〇ml的CM液体培养基中分别加入联苯菊酯、溴氰菊酯、 甲氰菊酯,使其最终浓度为l〇〇mg/L,以4%的量接种,37°C,180r mirT1振荡培养4d,样品平 行2组。
[0026] 其中3种农药的含量测定方法为添加农药的培养液振荡培养4天后,取1ml加入 5ml带刻度的试管中,加入3ml正己烷,振荡5分钟后,静置分层后,吸取2ml上清液加入少 量的分析纯无水Na 2S04脱水,气相色谱测定结果换算为培养液中的农药浓度(ml/L)。
[0027] 降解率=(1-降解菌处理后的拟除虫菊酯农药浓度/对照组拟除虫菊酯农药浓 度)X100%。
[0028] 气相色谱条件:6890-N气相色谱仪(美国安捷伦科技公司)。进样口 :200°C,检 测器:320°C,柱温 150°C (2min)6°C/min - 270°C (保持 23min),分流比 10 : 1,速率 lml/ min,色谱柱:HP-5,柱长:30mX0· 32mmX0· 25um。
[0029] 最后进行标准曲线的绘制:用移液枪准确的吸取1. 0ml联苯菊酯,甲氰菊酯,溴氰 菊酯标准溶液(l〇〇ug/ml)置于10ml容量瓶中,用正己烷定容至刻度,摇匀,配成lO.Oug/ ml的混合标准溶液。然后再用正己烷逐级稀释配置为弄浓度为0. 020ug/ml,0. 050ug/ml, 0· 10ug/ml,0. 20ug/ml,0. 50ug/ml,1. 0ug/ml,2. 0ug/ml 的混合标准溶液,各取 lu 1 进样, 以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线[1°]。
[0030] 混合标准色谱图(图4)绘制采用上述方法混合及其稀释3种供试农药其检测分 离情况、保留时间,标准色谱图。
[0031] 实施例2 :嗜盐古菌Haloarchaeon B13-RDX的种属鉴定
[0032] 菌株的鉴定分别采用如下方法:
[0033] a采用传统的鉴定方法,检测各种生理生化指标及其酶学特征检测。
[0034] b采用扩增、测定16SrRNA序列,通过检索GenBank数据库鉴定到属。
[0035] c菌株16SrRNA基因序列测定提取菌株的总DNA,然后使用下述引物【正向: 5' -ATTCCGGTTGATCCTGC-3,,反向:5,-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3,】扩增菌株 16SrRNA 基因。PCR反应条件为50yL反应体系30个循环;变性:94°C,45s ;退火:50°C,45s ;延伸: 72。。,90s。
[0036] 将菌株的16S rRNA序列与从GenBank数据库中获得的嗜盐菌16S rRNA序列作比 较,采用Clustalw2.0软件包进行多序列匹配排列,其中形成的缺口用中性元素填补。用 PHYLIP程序包中的DNAdist程序计算进化距离,根据"Kimura双参数"方式,通过序列数据 计算矩阵距离,然后使用Neighbor-joining方法,进行系统进化树估算。
[0037] 实施例3 :嗜盐古菌Haloarchaeon B13-RDX的降解特性研究
[0038] 首先考虑菌株生长曲线与拟除虫菊酯类农药降解率的关系:
[0039] 将降解菌B13-RDX接种在CM液体培养基里,37°C,180r min-1振荡培养4d,按 4%的接菌量转接入含有100mg/L联苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的CM液体培养基中,37 °C, 180r mirT1振荡培养,分别在24h、48h、72h、96h测定0D600nm时菌株生长量,以及气相色谱 检测24h、48h、72h、96h降解菌B13-RDX对3种拟除虫菊酯类农药的降解率。
[0040] 然后研究菌株的接种量与拟除虫菊酯类农药降解率的关系:
[0041] 将降解菌B13-RDX接种在CM液体培养基里37°C,180r min-1振荡培养4d,分别按 4%、8 %、12%、16%的量转接入含有100mg/L联苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的CM液体培养 基中,37°C,180r mirT1振荡培养,4d后气相色谱检测农药含量。
[0042] 最后进行了菌株对农药耐受能力的检测:
[0043] 将降解菌 B13-RDX 分别点接于含有 100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L 联苯菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯的CM琼脂培养基,37°C,培养4-7d观察是否生长。
[0044] 实验结果如下所述:
[0045] 1.将嗜盐古菌Haloarchaeon B13-RDX在牛奶固体培养基平板上厌氧光照培养 5d,形成黄色的圆形菌落,边缘整齐光滑。经鉴定,B13-RDX的生理生化特征为:革兰氏染色 阴性,杆状,V-P反应阴性,不能利用淀粉,H 2S反应,明胶检测,酯酶检测,过氧化氢酶,硝酸 盐还原均为阳性。
[0046] 2.从该菌16S rRNA构建的系统发育树(图3)上看,菌株B13-RDX与盐红菌属 Haloarchaeon分在同一类群中,序列同源性为95%。根据生物学领域的通常认知,16S rRNA基因序列同源性低于98%,可以认为属于不同种,同源性小于93% -95%,可认为属于 不同属。因此基于系统发育树和16S rRNA同源性角度,菌株B13-RDX是盐红菌属中的一个 新成员, 申请人:将其命名为新疆罗布泊嗜盐古菌HaloarchaeonB13-RDX。
[0047] 3、本实施例所采用方法的线性范围与检出限
[0048] 取混合标准溶液1 μ 1进样测定,以待测物峰面积对其浓度作标准曲线,结果见表 1〇
[0049] 由该结果可看出,3种拟除虫菊酯类农药在0. 02 μ g/ml?2. 0 μ g/ml范围内呈良 好的线性关系(r为0. 99808?0. 99859)。
[0050] 表1标准曲线及检出限
[0051]

【权利要求】
1. 一种嗜盐古菌(Haloarchaeon B13-RDX),其生物保藏信息为CGMCC No.9210。
2. 权利要求1所述嗜盐古菌在降解菊酯类农药中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述降解菊酯类农药为联苯菊酯、甲氰菊 酯或溴氰菊酯。
4. 根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述嗜盐古菌在CM液体培养基中振荡培养 然后接种到含有菊酯类农药的CM液体培养基中。
5. 根据权利要求4所述的应用,其特征在于接种量为4%。
6. 根据权利要求4所述的应用,其特征在于菊酯类农药浓度不高于200mg/L。
7. 根据权利要求6所述的应用,其特征在于菊酯类农药浓度为100mg/L。
【文档编号】C12N1/20GK104195062SQ201410250126
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】迪丽拜尔·托乎提, 买热帕提阿依, 迪丽乌孜·安尼瓦尔, 旭格拉, 赵和平, 周宇光, 米丽班·霍加艾合买提 申请人:迪丽拜尔·托乎提, 新疆师范大学

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