一种用于培养米根霉菌体的木糖及其制备方法
一种用于培养米根霉菌体的木糖及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于培养米根霉菌体的木糖及其制备方法，该木糖是通过以下方法制备得到的：1)将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70～90％乙醇在温度80～90℃条件下浸提1～2h，过滤，得到固形物；2)将固形物用甲酸在温度60～75℃条件下浸提1～2h，过滤，固液分离，将得到的液体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物，即为木糖。本发明使用茭白废弃物作为原料，不仅实现了茭白废弃物的可再生利用，同时在提取木糖的过程中，不需添加额外的催化剂即可高效提取木糖，反应条件温和，能耗低，木糖的回收率高，反应过程中也不产生额外的催化副产物，整个过程中不产生任何污染和浪费。
【专利说明】一种用于培养米根霉菌体的木糖及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种用于培养米根霉菌体的木糖及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 随着石油危机的日益加重，世界化学工业的原料正逐步由石油资源向生物质资源 转变。目前生物化工的原料大多以粮食制备的淀粉和糖为主，导致"与人（畜）争粮、与粮 争地"的局面日益严重。生物质单糖作为生物化工的主要原料，已成为限制中国生物化工产 业发展的瓶颈。
[0003] 木质纤维素包括农业生产的废弃物和剩余物（如农作物秸杆、谷壳、麸皮、蔗渣 等）、林木（软木和硬木）及林业加工废弃物、草类等，年产量高达1500亿吨以上。经过水 解糖化，纤维素物质可转化为单糖类物质，以此为平台，经化学途径可转化成燃油、燃气及 化学品；通过生物催化可转化成大宗发酵产品及液体生物燃料；利用结晶纯化技术得到的 单糖晶体更是重要的工业原料。
[0004] 木质纤维素中半纤维素、纤维素含量相对较高，能达到材料的50%以上，但由于木 质素含量较多（10?20% )，其对纤维素等的包裹作用，使得木质纤维素在处理过程中，困 难重重。其中木质素的存在成为木质纤维素资源充分利用的重大障碍，要达到有效利用木 质纤维素资源的目的，降低处理的成本，必须首先解决木质素的降解问题。对木质纤维素 处理的方法归类可分为物理法、化学法、物理-化学法及生物法等，主要有：机械粉碎（球 磨、振动磨等）、高温液态法、高能辐射、微波处理、高温分解、蒸气爆破法、氨纤爆破法、C0 2 爆破、湿氧化法、酸水解法、碱处理法、过氧化物法及有机溶剂法等。在早期的研究中多用 化学法处理，环境污染大，近期发展了相对清洁的生产方法，包括蒸爆法，有机溶剂提取法 等，该类方法在制备过程中相对能耗较大，归根到底，还在于其木质纤维素坚韧的内部结构 增加了分离的困难，同时，用以上方法得到的糖如木糖、葡萄糖在进行生物利用的过程中， 还需要进行脱毒处理。如黄和等申请的发明专利"控制丝状真菌发酵过程中生长形态的方 法"（授权号：CN102212484B)明确指出，木质纤维素水解得到的水解液含量复杂，成分较 多，水解糖液要经过脱毒处理后才可用于菌体的培养以及富马酸的发酵。
[0005] 目前针对茭白废弃物的资源利用还鲜有报道，本发明提出了专门本发明提出了专 门针对茭白废弃物提取糖资源的工艺。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种使用茭白废弃物为基本原料，高效提取用于培养米根霉 菌体的木糖。
[0007] 本发明的另一目的是提供该木糖的制备方法，该方法得到的木糖提取效率高，成 本低。
[0008] 本发明还有一个目的是提供利用该木糖培养米根霉菌体的培养方法。
[0009] 本发明可解决木质纤维素资源中糖资源提取和后续开发利用技术不足。
[0010] 本发明的目的是通过以下方式实现的：
[0011] 一种用于培养米根霉菌体的木糖，该木糖是通过以下方法制备得到的：
[0012] 1)将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70?90%乙醇在温度80?90°C条件下浸提 1?2h，过滤，得到固形物；
[0013] 2)将固形物用甲酸在温度60?75°C条件下浸提1?2h，过滤，固液分离，将得到 的液体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物，即为木糖。优选用甲酸在温度70°C条件下浸 提2h。
[0014] 所述的茭白废弃物为茭白叶鞘、叶片和鞘叶。
[0015] 上述木糖的制备方法包括以下步骤：
[0016] 1)将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70?90%乙醇在温度80?90°C条件下浸提 1?2h，过滤，得到固形物；
[0017] 2)将得到的固形物用甲酸在温度60?75°C条件下浸提1?2h，过滤，固液分离， 将得到的液体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物。优选用甲酸在温度70°C条件下浸提 2h。
[0018] 该方法中，所述的茭白废弃物可先在50°C过夜烘干，粉碎至粒径为10?20mm的颗 粒。
[0019] 乙醇浸提过程中采用的固液比为1 :5?20,优选1 :10。
[0020] 乙醇浸提过程中优选采用的乙醇浓度为80?90%。
[0021] 上述方法中，步骤"1) "优选在温度为90°C条件下浸提。
[0022] 步骤"2) "使用甲酸浸提采用的固液比为1 :5?20,优选为1 :10?20,最优选1 : 10。
[0023] 步骤"2) "中，优选将固形物用甲酸在温度70°C条件下浸提。
[0024] -种利用上述方法制备得到的木糖培养米根霉菌体的方法包括以下步骤：将木糖 对米根霉进行分级培养，培养分2?4级，优选3级，每级控制木糖浓度在10?15g/L，总 糖浓度控制在30?50g/L，同时控制蛋白胨2. Og/L，磷酸二氢钾0· 2g/L，MgS04 · 7Η200· 2g/ L，CaC036. Og/L，250ml摇瓶每瓶装50ml种子液，150r/min，30°C反应，每级培养8?12h，培 养结束后，得到大小均一的球状米根霉菌体。
[0025] 上述固液比均指质量体积比（g/ml)。
[0026] 本发明所使用的甲酸为市售商品甲酸，其质量浓度优选为86. 24%。
[0027] 本发明将得到的木糖进行稀释，并在其中添加（一种培养产富马酸的菌体，一种 用于产乳酸的菌体），用于培养米根霉菌体，培养20?40h，可得到均匀的、直径为1mm左 右的球形菌体。该菌体发酵得到的富马酸以及乳酸产量均能达到53. 2和57. 4g/L(80g/ L初始葡萄糖浓度），同时对菌体中的壳聚糖成分进行分析发现，其中壳聚糖成分可高达至 0. 164g/g，比葡萄糖纯培养增加了 27%以上，由此可见，利用该工艺能够高效制备木糖，同 时得到的木糖可进行米根霉菌体的培养，培养的菌体壳聚糖含量也相对较高。其中，菌体中 的壳聚糖的质量检测方法是按照授权号：CN102212484B的发明专利"控制丝状真菌发酵过 程中生长形态的方法"中所公开的方法进行的。
[0028] 与现有技术比较，本发明的有益效果：使用茭白废弃物作为原料，不仅实现了茭白 废弃物的可再生利用，同时在提取木糖的过程中，不需添加额外的催化剂即可高效提取木 糖，反应条件温和，能耗较低，木糖的回收率达到了 90?95 %，反应过程中也不产生额外的 催化副产物，甲酸可经过蒸馏回收再利用，因此，整个过程中不产生任何污染和浪费，降低 了生产成本，而且得到的木糖安全无毒。同时，得到的木糖用来培养米根霉菌体，可得到大 小均一的球形菌体，菌体中壳聚糖含量可高达至16. 4%。
[0029] 以下通过实验例对本发明进行进一步说明：
[0030] 1、乙醇对茭白中木质素脱除的影响
[0031] (1)乙醇浓度对木质素脱除的影响
[0032] 取烘干茭白废弃物（茭白鞘叶、叶片和叶鞘）5g，加入50ml乙醇溶液中，W:V = 1:10 ;乙醇浓度分别为70, 80, 90, 100%，反应温度在90°C ;提取lh，减压蒸馏，烘干，测其 干重，木质素去除率，其结果如表1所示。大量的文献报道了利用乙醇催化制备纤维的工 艺，但是木质素是难以糖化的复杂的不定型高聚物，是植物体内最难分解的组分，并且在纤 维素周围形成保护层，影响纤维素糖化，同时木质素是一种聚集体，结构中存在许多极性 基团，尤其是较多的羟基，造成了很强的分子内和分子间的氢键，因此，基本上乙醇催化制 备纤维的工艺都要在较为严格的条件下，如添加酸碱催化剂同时催化温度较高（>180°C为 宜），这些条件虽然能使木质素脱离，但是半纤维素以及纤维素也发生了降解。
[0033] 但是针对茭白废弃物，发明人却可选择使用乙醇来提取木质素，并且可选择在较 低的温度下实现木质素的提取。从表中可以看出，当乙醇浓度为90%时，木质素去除效果最 佳，达到了 76%，随着乙醇浓度的继续升高，反而不利于木质素的去除；同时从表中可以看 出，废弃物的剩余含量均发生变化，其可能是废弃物中部分果胶、蛋白类物质也随着溶液提 取出来，而糖类物质并无有多少损耗。
[0034] 表 1
[0035]
【权利要求】
1. 一种用于培养米根霉菌体的木糖，其特征在于该木糖是通过以下方法制备得到的： 1) 将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70?90%乙醇在温度80?90°C条件下浸提1? 2h，过滤，得到固形物； 2) 将固形物用甲酸在温度60?75°C条件下浸提1?2h，过滤，固液分离，将得到的液 体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物，即为木糖。
2. 根据权利要求1所述的木糖，其特征在于所述的茭白废弃物为茭白叶鞘、叶片和鞘 叶。
3. -种权利要求1所述的木糖的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 1) 将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70?90%乙醇在温度80?90°C条件下浸提1? 2h，过滤，得到固形物； 2) 将得到的固形物用甲酸在温度60?75°C条件下浸提1?2h，过滤，固液分离，将得 到的液体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物。
4. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于所述的茭白废弃物先粉碎至粒 径为10?20mm的颗粒。
5. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于乙醇浸提过程中采用的固液比 为1 :5?20,优选1 :10。
6. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于乙醇浸提过程中采用的乙醇浓 度为80?90%。
7. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于步骤" 1) "为在温度为90°C条 件下浸提。
8. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于步骤"2) "使用甲酸浸提采用的 固液比为1 :5?20,优选为1 :10?20,最优选1 :10。
9. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于步骤"2) "中，将固形物用甲酸 在温度70°C条件下浸提。
10. -种利用权利要求1所述的木糖培养米根霉菌体的方法，其特征在于该方法 包括以下步骤：将木糖对米根霉进行分级培养，培养分2?4级，每级控制木糖浓度在 10?15g/L，总糖浓度控制在30?50g/L，同时控制蛋白胨2. Og/L，磷酸二氢钾0. 2g/L， MgS04 ·7Η200· 2g/L，CaC036. Og/L，250ml 摇瓶每瓶装 50ml 种子液，150r/min，30°C反应，每级 培养8?12h，培养结束后，得到大小均一的球状米根霉菌体。
【文档编号】C12R1/845GK104152592SQ201410250130
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】付永前, 尹龙飞, 蒋茹, 朱华跃, 李鑫 申请人:台州学院
【专利摘要】本发明公开了一种用于培养米根霉菌体的木糖及其制备方法，该木糖是通过以下方法制备得到的：1)将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70～90％乙醇在温度80～90℃条件下浸提1～2h，过滤，得到固形物；2)将固形物用甲酸在温度60～75℃条件下浸提1～2h，过滤，固液分离，将得到的液体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物，即为木糖。本发明使用茭白废弃物作为原料，不仅实现了茭白废弃物的可再生利用，同时在提取木糖的过程中，不需添加额外的催化剂即可高效提取木糖，反应条件温和，能耗低，木糖的回收率高，反应过程中也不产生额外的催化副产物，整个过程中不产生任何污染和浪费。
【专利说明】一种用于培养米根霉菌体的木糖及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种用于培养米根霉菌体的木糖及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 随着石油危机的日益加重，世界化学工业的原料正逐步由石油资源向生物质资源 转变。目前生物化工的原料大多以粮食制备的淀粉和糖为主，导致"与人（畜）争粮、与粮 争地"的局面日益严重。生物质单糖作为生物化工的主要原料，已成为限制中国生物化工产 业发展的瓶颈。
[0003] 木质纤维素包括农业生产的废弃物和剩余物（如农作物秸杆、谷壳、麸皮、蔗渣 等）、林木（软木和硬木）及林业加工废弃物、草类等，年产量高达1500亿吨以上。经过水 解糖化，纤维素物质可转化为单糖类物质，以此为平台，经化学途径可转化成燃油、燃气及 化学品；通过生物催化可转化成大宗发酵产品及液体生物燃料；利用结晶纯化技术得到的 单糖晶体更是重要的工业原料。
[0004] 木质纤维素中半纤维素、纤维素含量相对较高，能达到材料的50%以上，但由于木 质素含量较多（10?20% )，其对纤维素等的包裹作用，使得木质纤维素在处理过程中，困 难重重。其中木质素的存在成为木质纤维素资源充分利用的重大障碍，要达到有效利用木 质纤维素资源的目的，降低处理的成本，必须首先解决木质素的降解问题。对木质纤维素 处理的方法归类可分为物理法、化学法、物理-化学法及生物法等，主要有：机械粉碎（球 磨、振动磨等）、高温液态法、高能辐射、微波处理、高温分解、蒸气爆破法、氨纤爆破法、C0 2 爆破、湿氧化法、酸水解法、碱处理法、过氧化物法及有机溶剂法等。在早期的研究中多用 化学法处理，环境污染大，近期发展了相对清洁的生产方法，包括蒸爆法，有机溶剂提取法 等，该类方法在制备过程中相对能耗较大，归根到底，还在于其木质纤维素坚韧的内部结构 增加了分离的困难，同时，用以上方法得到的糖如木糖、葡萄糖在进行生物利用的过程中， 还需要进行脱毒处理。如黄和等申请的发明专利"控制丝状真菌发酵过程中生长形态的方 法"（授权号：CN102212484B)明确指出，木质纤维素水解得到的水解液含量复杂，成分较 多，水解糖液要经过脱毒处理后才可用于菌体的培养以及富马酸的发酵。
[0005] 目前针对茭白废弃物的资源利用还鲜有报道，本发明提出了专门本发明提出了专 门针对茭白废弃物提取糖资源的工艺。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种使用茭白废弃物为基本原料，高效提取用于培养米根霉 菌体的木糖。
[0007] 本发明的另一目的是提供该木糖的制备方法，该方法得到的木糖提取效率高，成 本低。
[0008] 本发明还有一个目的是提供利用该木糖培养米根霉菌体的培养方法。
[0009] 本发明可解决木质纤维素资源中糖资源提取和后续开发利用技术不足。
[0010] 本发明的目的是通过以下方式实现的：
[0011] 一种用于培养米根霉菌体的木糖，该木糖是通过以下方法制备得到的：
[0012] 1)将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70?90%乙醇在温度80?90°C条件下浸提 1?2h，过滤，得到固形物；
[0013] 2)将固形物用甲酸在温度60?75°C条件下浸提1?2h，过滤，固液分离，将得到 的液体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物，即为木糖。优选用甲酸在温度70°C条件下浸 提2h。
[0014] 所述的茭白废弃物为茭白叶鞘、叶片和鞘叶。
[0015] 上述木糖的制备方法包括以下步骤：
[0016] 1)将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70?90%乙醇在温度80?90°C条件下浸提 1?2h，过滤，得到固形物；
[0017] 2)将得到的固形物用甲酸在温度60?75°C条件下浸提1?2h，过滤，固液分离， 将得到的液体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物。优选用甲酸在温度70°C条件下浸提 2h。
[0018] 该方法中，所述的茭白废弃物可先在50°C过夜烘干，粉碎至粒径为10?20mm的颗 粒。
[0019] 乙醇浸提过程中采用的固液比为1 :5?20,优选1 :10。
[0020] 乙醇浸提过程中优选采用的乙醇浓度为80?90%。
[0021] 上述方法中，步骤"1) "优选在温度为90°C条件下浸提。
[0022] 步骤"2) "使用甲酸浸提采用的固液比为1 :5?20,优选为1 :10?20,最优选1 : 10。
[0023] 步骤"2) "中，优选将固形物用甲酸在温度70°C条件下浸提。
[0024] -种利用上述方法制备得到的木糖培养米根霉菌体的方法包括以下步骤：将木糖 对米根霉进行分级培养，培养分2?4级，优选3级，每级控制木糖浓度在10?15g/L，总 糖浓度控制在30?50g/L，同时控制蛋白胨2. Og/L，磷酸二氢钾0· 2g/L，MgS04 · 7Η200· 2g/ L，CaC036. Og/L，250ml摇瓶每瓶装50ml种子液，150r/min，30°C反应，每级培养8?12h，培 养结束后，得到大小均一的球状米根霉菌体。
[0025] 上述固液比均指质量体积比（g/ml)。
[0026] 本发明所使用的甲酸为市售商品甲酸，其质量浓度优选为86. 24%。
[0027] 本发明将得到的木糖进行稀释，并在其中添加（一种培养产富马酸的菌体，一种 用于产乳酸的菌体），用于培养米根霉菌体，培养20?40h，可得到均匀的、直径为1mm左 右的球形菌体。该菌体发酵得到的富马酸以及乳酸产量均能达到53. 2和57. 4g/L(80g/ L初始葡萄糖浓度），同时对菌体中的壳聚糖成分进行分析发现，其中壳聚糖成分可高达至 0. 164g/g，比葡萄糖纯培养增加了 27%以上，由此可见，利用该工艺能够高效制备木糖，同 时得到的木糖可进行米根霉菌体的培养，培养的菌体壳聚糖含量也相对较高。其中，菌体中 的壳聚糖的质量检测方法是按照授权号：CN102212484B的发明专利"控制丝状真菌发酵过 程中生长形态的方法"中所公开的方法进行的。
[0028] 与现有技术比较，本发明的有益效果：使用茭白废弃物作为原料，不仅实现了茭白 废弃物的可再生利用，同时在提取木糖的过程中，不需添加额外的催化剂即可高效提取木 糖，反应条件温和，能耗较低，木糖的回收率达到了 90?95 %，反应过程中也不产生额外的 催化副产物，甲酸可经过蒸馏回收再利用，因此，整个过程中不产生任何污染和浪费，降低 了生产成本，而且得到的木糖安全无毒。同时，得到的木糖用来培养米根霉菌体，可得到大 小均一的球形菌体，菌体中壳聚糖含量可高达至16. 4%。
[0029] 以下通过实验例对本发明进行进一步说明：
[0030] 1、乙醇对茭白中木质素脱除的影响
[0031] (1)乙醇浓度对木质素脱除的影响
[0032] 取烘干茭白废弃物（茭白鞘叶、叶片和叶鞘）5g，加入50ml乙醇溶液中，W:V = 1:10 ;乙醇浓度分别为70, 80, 90, 100%，反应温度在90°C ;提取lh，减压蒸馏，烘干，测其 干重，木质素去除率，其结果如表1所示。大量的文献报道了利用乙醇催化制备纤维的工 艺，但是木质素是难以糖化的复杂的不定型高聚物，是植物体内最难分解的组分，并且在纤 维素周围形成保护层，影响纤维素糖化，同时木质素是一种聚集体，结构中存在许多极性 基团，尤其是较多的羟基，造成了很强的分子内和分子间的氢键，因此，基本上乙醇催化制 备纤维的工艺都要在较为严格的条件下，如添加酸碱催化剂同时催化温度较高（>180°C为 宜），这些条件虽然能使木质素脱离，但是半纤维素以及纤维素也发生了降解。
[0033] 但是针对茭白废弃物，发明人却可选择使用乙醇来提取木质素，并且可选择在较 低的温度下实现木质素的提取。从表中可以看出，当乙醇浓度为90%时，木质素去除效果最 佳，达到了 76%，随着乙醇浓度的继续升高，反而不利于木质素的去除；同时从表中可以看 出，废弃物的剩余含量均发生变化，其可能是废弃物中部分果胶、蛋白类物质也随着溶液提 取出来，而糖类物质并无有多少损耗。
[0034] 表 1
[0035]
【权利要求】
1. 一种用于培养米根霉菌体的木糖，其特征在于该木糖是通过以下方法制备得到的： 1) 将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70?90%乙醇在温度80?90°C条件下浸提1? 2h，过滤，得到固形物； 2) 将固形物用甲酸在温度60?75°C条件下浸提1?2h，过滤，固液分离，将得到的液 体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物，即为木糖。
2. 根据权利要求1所述的木糖，其特征在于所述的茭白废弃物为茭白叶鞘、叶片和鞘 叶。
3. -种权利要求1所述的木糖的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 1) 将茭白废弃物粉碎后，用浓度为70?90%乙醇在温度80?90°C条件下浸提1? 2h，过滤，得到固形物； 2) 将得到的固形物用甲酸在温度60?75°C条件下浸提1?2h，过滤，固液分离，将得 到的液体进行减压蒸馏，回收甲酸，得到固形物。
4. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于所述的茭白废弃物先粉碎至粒 径为10?20mm的颗粒。
5. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于乙醇浸提过程中采用的固液比 为1 :5?20,优选1 :10。
6. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于乙醇浸提过程中采用的乙醇浓 度为80?90%。
7. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于步骤" 1) "为在温度为90°C条 件下浸提。
8. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于步骤"2) "使用甲酸浸提采用的 固液比为1 :5?20,优选为1 :10?20,最优选1 :10。
9. 根据权利要求3所述的木糖的制备方法，其特征在于步骤"2) "中，将固形物用甲酸 在温度70°C条件下浸提。
10. -种利用权利要求1所述的木糖培养米根霉菌体的方法，其特征在于该方法 包括以下步骤：将木糖对米根霉进行分级培养，培养分2?4级，每级控制木糖浓度在 10?15g/L，总糖浓度控制在30?50g/L，同时控制蛋白胨2. Og/L，磷酸二氢钾0. 2g/L， MgS04 ·7Η200· 2g/L，CaC036. Og/L，250ml 摇瓶每瓶装 50ml 种子液，150r/min，30°C反应，每级 培养8?12h，培养结束后，得到大小均一的球状米根霉菌体。
【文档编号】C12R1/845GK104152592SQ201410250130
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】付永前, 尹龙飞, 蒋茹, 朱华跃, 李鑫 申请人:台州学院
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