miRNA-28化合物作为慢性疼痛标志物和在制备治疗慢性疼痛药物中的应用的制作方法
miRNA-28化合物作为慢性疼痛标志物和在制备治疗慢性疼痛药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属生物技术和医学领域，涉及一种治疗慢性疼痛的基因miRNA-28的用途。首次证实了miRNA-28在慢性疼痛病人血液中表达下调，并证实miRNA-28在慢性疼痛发生中能直接调控Nnat介导钙离子信号通路，且能显著抑制慢性疼痛发生和形成。进一步对慢性疼痛病人的血液临床标本进行了定量分析，表明miRNA-28能作为慢性疼痛发生的标志物。
【专利说明】mi RNA-28化合物作为慢性疼痛标志物和在制备治疗慢性 疼痛药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微小RNA分子的用途，尤其是涉及miRNA-28用途，具体是 miRNA-28化合物作为慢性疼痛标志物和在制备治疗慢性疼痛药物中的应用，属于生物医学 材料【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 慢性疼痛是临床上最常见和高发疾症之一，据统计，全球慢性疼痛的患者高达3. 2 亿。中枢神经系统（central nervous system, CNS)或周围神经系统（peripheral nervous system, PNS)的损伤或创伤、感染、炎症等均会引起慢性疼痛。主要的临床表现为自发痛、痛 觉过敏和异常性疼痛，由于病因复杂、发病机制尚不明确，治疗非常困难。而长期慢性疼痛 患者易产生焦虑、忧郁、失眠等症状，且耗费大量的医疗资源，严重影响着人们的生活质量。 目前采用的药物治疗及介入手术治疗均有长期效果不理想的缺陷。因此，深入探索疼痛发 生、发展的分子机制，明确其长期持续的原因，确立疼痛治疗靶点，寻求新的干预策略对提 1?疼痛治疗效果有着深远的意义。
[0003] MicroRNA是一类长度为19-25个核苷酸大小的内源性单链RNA，它们在转录后水 平沉默基因的翻译从而对生物体基因表达起到了精细调节的作用。如果miRNA与靶mRNA 的3'非翻译区匹配完全或接近完全，则该复合体降解靶mRNA ;若两者序列部分匹配则通过 抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因表达。
[0004] 神经细胞中含miRNA较其他组织细胞多，miRNA在突触部位的选择性聚集或缺失， 可以调节突触局部的基因表达和蛋白合成，影响神经细胞突触功能。神经系统疾病，比如帕 金森、精神分裂症、老年痴呆、亨廷顿病、神经母细胞瘤等都与miRNA表达和功能异常相关。
[0005] 关于miRNA-28作为一种抑制慢性疼痛基因的用途和作为慢性疼痛诊断的一种标 志物的用途目前尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供一种应用miRNA-28化合物作为慢性疼痛标志物和 在制备治疗慢性疼痛药物中的应用。
[0007] 目的在于提供miRNA-28化合物作为慢性疼痛疾病临床诊断标志物的用途。
[0008] 另一目的在于提供miRNA-28化合物作为治疗慢性疼痛药物的用途。
[0009] 首先采用荣光定量PCR方法对多个神经组织特异表达miRNA进行了检测，结果表 明miRNA-28在CFA慢性疼痛大鼠的背根神经节中出现下调表达，见图1。采用原位杂交观 察到了 miRNA-28在大鼠脊髓中的明显表达，见图2。采用慢病毒介导的过表达技术检测到， 当CFA慢性疼痛大鼠脊髓miRNA-28过表达时，其疼痛域值明显上升，见图3 ;而在正常大鼠 miRNA-28下调表达时，大鼠疼痛域值明显降低，见图3。
[0010] 进一步通过靶标预测软件分析发现，Nnat的3'端UTR区含有miRNA-28的结合位 点，见图4。并采用荧光素酶报告基因方法，验证了 miRNA-28作用靶标Nnat，见图5。利用 蛋白质免疫印迹检测到CFA大鼠 Nnat表达出现明显上调，见图6,该趋势与miRNA-28表达 相反。同时，在CFA模型鼠中，过表达miRNA-28时，Nnat表达出现明显下调。上述结果表 明，miRNA-28通过Nnat信号通路调控慢性疼痛的发生和维持。
[0011] 最后，本发明探讨了 miRNA-28在慢性疼痛诊断中的意义。对miRNA-28在慢性疼痛 病人血液中的表达进行了定量检测。样本包括正常组12例，慢性和轻微疼痛组12例。研 究证实miRNA-28在慢性疼痛病人中表达水平均出现显著下调（图7)。蛋白质免疫印迹分 析表明Nnat在慢性疼痛病人血样中表达均明显上调，进一步证实了慢性疼痛病人中Nnat 与miRNA-28存在与动物实验同样的相互作用关系。
[0012] 本发明首次发现miRNA-28在慢性疼痛发生和维持过程中均能通过调控Nnat信号 传导通路进行。作为疼痛抑制基因，miRNA-28能显著抑制慢性疼痛的发生。对慢性疼痛病 人的血样标本进行定量分析发现，miRNA-28在病人血样中的表达也是明显下调。研究结果 表明通过检测或干涉神经中枢中miRNA-28的表达可为慢性疼痛的诊断或治疗提供新的方 案。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1是miRNA-28在CFA疼痛模型中脊髓水平差异表达。
[0014] 图2是鞘内注射miR-28模拟物对CFA炎性疼痛模型大鼠痛行为学影响。制备CFA 炎性慢疼痛模型大鼠，第三天开始隔天微注射miR-28模拟物，注射2小时后测定大鼠对热 激疼痛反应，发现注射miR-28后明显减轻CFA大鼠疼痛反应。可看出人为增加 miR-28可 以减轻CFA大鼠疼痛行为，起镇痛作用。
[0015] 图3是miRNA-28祀标预测分析，坚线表示miRNA-28与Nnat配对的碱基。
[0016] 图4是荧光素酶报告基因法验证Nnat是miRNA-28的直接调控靶标。将miRNA-28 结合Nnat的50bp DNA片段构建到荧光素酶表达载体PsiCHECK2 (Promega)上荧光素酶的 3'端，将人工合成miRNA-28与载体共转染到293T细胞，检测荧光素酶表达。Nnat-vector 代表野生型载体，mutatant-vector代表突变型载体，Empty-Vector代表空载体；横坐标 intrace 1 luar miR-28 代表转染时无外源性miRNA-28，miR-28mimics 表不miRNA-28 与 Nnat 载体。
[0017] 图5是CFA疼痛中Nnat蛋白检测结果。
[0018] 图6是miRNA-28在慢性疼痛病人血样中的差异表达。
[0019] 图7是荧光素酶报告基因法将Nnat的50bp序列构建到表达载体的相应位点。载 体信息：表达克隆包含SV40启动子驱动的报告基因（萤火虫荧光素酶）的下游紧接3' 一 UTR(即miRNA作用位点）序列；第二个报告基因 renilla luciferase(hRLuc)，可用于监测 转染，表达效率，并可以作内参。
【具体实施方式】
[0020] 1. CFA慢性关节炎疼痛模型制备：
[0021] SPF级雄性SD大鼠（250 g?270 g)在异氟醚麻醉下，左后肢足底皮下注射100 微升CFA，成年小鼠（23?28g)左后肢足底皮下注射20微升CFA。对于幼年大鼠（9 一 14 天），在双后肢分别注射40微升CFA，由于新生鼠免疫系统发育不完全，2天后后肢的炎性即 会消失，因此2天后再注射20微升CFA，这样产生的炎性疼痛至少能维持4天。以上对照 组均注射0.9%生理盐水。因为动物在注射CFA 3天后对热刺激或机械刺激的反应最为强 烈，此时用作持续炎性痛模型。
[0022] 2.疼痛行为监测：
[0023] a.机械性异常疼痛：参照文献（Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung Jl, Yaksh TL:Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Meth〇dsl994, 53(1) :55-63.)用Von Frey纤维丝检测大鼠患侧后肢机械性缩足反射阈 值（paw withdrawal mechanical threshold, PWMT):大鼠置于透明玻璃隔窗中，下衬孔径 0. 5cm的有孔玻璃隔板，待大鼠安静后，用不同折力的Von Frey纤维丝刺激患侧后爪跖的 外侧面（腓肠神经区域）和内侧面（隐神经区域）区域。按不同压力从小到大垂直刺激， 每次逐渐加压使纤维丝弯曲成S形并保持持续6-8s，观察大鼠在刺激时间内是否缩足，若 迅速抬足移开刺激纤维丝则为阳性反应，个体自发体动不记做阳性反应。每次刺激间隔5s， 连续10次，能诱发4-6次缩足反应的纤维丝折力作为PWMT阈值纪录。
[0024] b.热痛觉过敏：将有机玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，按Hargreaves法（Harg reaves, K. , Dubner, R. , Brown, F. , Flores, C. , and Joris, J. (1988). A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.Pain 32, 77-88.)用热辐射刺激以照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至大鼠出现抬足 时间，截止时间为20 s。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定时间间隔5 min。
[0025] 3.采用慢病毒过表达技术在体调控背根神经节miRNA表达
[0026] 采用慢病毒载体过表达技术过表达miR-28的原理与步骤：先用Lentiviral的 pCMV构建pri-miR-28表达载体，转染293T细胞（3. 75 X 106细胞/10cm种植平板），转染 后48-60小时离心收获繁殖的病毒颗粒。然后在体注射鞘内：大鼠经异氟醚麻醉后，注射3 次病毒悬浮液（浓度在3. 6 X 107-4. 5 X 109 IFU/ml)，每次1 μ 1，注射时沿着背根神经节背 面的中、左和右三个部位，每次注射时间60s，注射后注射器停留组织内60s。每只大鼠每天 注射一次，共注射5天。
[0027] 4.蛋白免疫印迹（Western-blot)
[0028] 在样品中加入裂解液，置于液氮中反复冻融数次后，再超声彻底破碎样品，离心分 离出蛋白质，对取得的蛋白样品进行定量。在蛋白样品中加入上样缓冲液，煮沸3-5分钟， 进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流20mA。待前沿指示剂恰好跑出凝胶后，停止电泳，进行 转膜。将样品转至膜上后，再与所要研究的蛋白的单抗共同孵育，最终进行显色，得到印迹 信号。同时以beta-actin为参照，对信号进行标准化校正，之后在成像系统中读出信号密 度，进行进一步的分析。
[0029] 5. RNA 提取
[0030] 按照Trizol法抽提总RNA，测定浓度后取500ng总RNA进行反转录，得到的cDNA 产物稀释两倍用于RT-PCR的模板。
[0031] 6.采用RT-PCR进行miRNA定量分析
[0032] miRNA的定量分析采用特异性莖环结构反转录引物（stem loop reverse transcription primer, Stem RT Primer)进行反转录后再进行定量PCR检测。由于成熟 的miRNA是由21-25个核苷酸组成的小RNA，因其长度太短并不能通过传统的实时定量PCR 进行检测，但通过特殊设计的茎环结构反转录引物可以对其进行检测。该引物的茎部一端 突出可以跟miRNA -段互补，待引物延伸后，miRNA序列特征被反转录至茎环延伸序列上， 这时就用延伸茎环为模板进行定量PCR。可以实现专一、灵敏性地定量检测miRNA表达。，每 个 PCR 体系加入 2ul 模板，参考 Takara 公司的 SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real time) 的说明进行。
[0033] Stem RT-primer 见序列表（1)。
[0034] 正向引物：序列表（2)
[0035] 反向引物：序列表（3)
[0036] 7.荧光素酶报告基因法
[0037] 将Nnat的50bp序列构建到表达载体的相应位点。载体信息如下：表达克隆包含 SV40启动子驱动的报告基因（萤火虫荧光素酶）的下游紧接3' 一 UTR(即miRNA作用位 点）序列。第二个报告基因 renilla luciferase (hRLuc)，可用于监测转染，表达效率，并可 以作内参。见图7。
[0038] 通过萤火虫荧光素酶的活性分析，可获得miRNA对潜在靶标基因调控作用的结 果。表达克隆转录后形成萤火虫荧光素酶0RF与3 ' UTR的嵌合体mRNA，如果有特异的miRNA 可与3' 一 UTR某段序列互补结合，嵌合体中荧光素酶0RF所编码蛋白的活性也相应受到 调控，因此通过检测荧光素酶的发光强度就可以定量地测定miRNA对应靶标的mRNA调控 的效果。转染过程如下：待293T细胞长到6孔板的70-80%时即可转染。转染时，将合成 的miRNA-2820pmol与含有Nnat的Pezx-MTOl载体0· 8 μ g共转染到H293T细胞，转染后 17-48h即可测定荧光素酶活性。
[0039] 8.人血样RNA提取
[0040] 过程同具体实施步骤4.，按照Trizol法抽提总RNA，测定浓度后取500ng总RNA 进行反转录，得到的cDNA产物稀释两倍后用于RT-PCR的模板。
【权利要求】
1. miRNA-28化合物作为慢性疼痛疾病临床诊断标志物的用途。 2. miRNA-28化合物在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。 3. miRNA-28调控下游靶标基因 nnat在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104152545SQ201410250468
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】李燕强, 曹君利, 潘志强 申请人:徐州医学院
【专利摘要】本发明属生物技术和医学领域，涉及一种治疗慢性疼痛的基因miRNA-28的用途。首次证实了miRNA-28在慢性疼痛病人血液中表达下调，并证实miRNA-28在慢性疼痛发生中能直接调控Nnat介导钙离子信号通路，且能显著抑制慢性疼痛发生和形成。进一步对慢性疼痛病人的血液临床标本进行了定量分析，表明miRNA-28能作为慢性疼痛发生的标志物。
【专利说明】mi RNA-28化合物作为慢性疼痛标志物和在制备治疗慢性 疼痛药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微小RNA分子的用途，尤其是涉及miRNA-28用途，具体是 miRNA-28化合物作为慢性疼痛标志物和在制备治疗慢性疼痛药物中的应用，属于生物医学 材料【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 慢性疼痛是临床上最常见和高发疾症之一，据统计，全球慢性疼痛的患者高达3. 2 亿。中枢神经系统（central nervous system, CNS)或周围神经系统（peripheral nervous system, PNS)的损伤或创伤、感染、炎症等均会引起慢性疼痛。主要的临床表现为自发痛、痛 觉过敏和异常性疼痛，由于病因复杂、发病机制尚不明确，治疗非常困难。而长期慢性疼痛 患者易产生焦虑、忧郁、失眠等症状，且耗费大量的医疗资源，严重影响着人们的生活质量。 目前采用的药物治疗及介入手术治疗均有长期效果不理想的缺陷。因此，深入探索疼痛发 生、发展的分子机制，明确其长期持续的原因，确立疼痛治疗靶点，寻求新的干预策略对提 1?疼痛治疗效果有着深远的意义。
[0003] MicroRNA是一类长度为19-25个核苷酸大小的内源性单链RNA，它们在转录后水 平沉默基因的翻译从而对生物体基因表达起到了精细调节的作用。如果miRNA与靶mRNA 的3'非翻译区匹配完全或接近完全，则该复合体降解靶mRNA ;若两者序列部分匹配则通过 抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因表达。
[0004] 神经细胞中含miRNA较其他组织细胞多，miRNA在突触部位的选择性聚集或缺失， 可以调节突触局部的基因表达和蛋白合成，影响神经细胞突触功能。神经系统疾病，比如帕 金森、精神分裂症、老年痴呆、亨廷顿病、神经母细胞瘤等都与miRNA表达和功能异常相关。
[0005] 关于miRNA-28作为一种抑制慢性疼痛基因的用途和作为慢性疼痛诊断的一种标 志物的用途目前尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供一种应用miRNA-28化合物作为慢性疼痛标志物和 在制备治疗慢性疼痛药物中的应用。
[0007] 目的在于提供miRNA-28化合物作为慢性疼痛疾病临床诊断标志物的用途。
[0008] 另一目的在于提供miRNA-28化合物作为治疗慢性疼痛药物的用途。
[0009] 首先采用荣光定量PCR方法对多个神经组织特异表达miRNA进行了检测，结果表 明miRNA-28在CFA慢性疼痛大鼠的背根神经节中出现下调表达，见图1。采用原位杂交观 察到了 miRNA-28在大鼠脊髓中的明显表达，见图2。采用慢病毒介导的过表达技术检测到， 当CFA慢性疼痛大鼠脊髓miRNA-28过表达时，其疼痛域值明显上升，见图3 ;而在正常大鼠 miRNA-28下调表达时，大鼠疼痛域值明显降低，见图3。
[0010] 进一步通过靶标预测软件分析发现，Nnat的3'端UTR区含有miRNA-28的结合位 点，见图4。并采用荧光素酶报告基因方法，验证了 miRNA-28作用靶标Nnat，见图5。利用 蛋白质免疫印迹检测到CFA大鼠 Nnat表达出现明显上调，见图6,该趋势与miRNA-28表达 相反。同时，在CFA模型鼠中，过表达miRNA-28时，Nnat表达出现明显下调。上述结果表 明，miRNA-28通过Nnat信号通路调控慢性疼痛的发生和维持。
[0011] 最后，本发明探讨了 miRNA-28在慢性疼痛诊断中的意义。对miRNA-28在慢性疼痛 病人血液中的表达进行了定量检测。样本包括正常组12例，慢性和轻微疼痛组12例。研 究证实miRNA-28在慢性疼痛病人中表达水平均出现显著下调（图7)。蛋白质免疫印迹分 析表明Nnat在慢性疼痛病人血样中表达均明显上调，进一步证实了慢性疼痛病人中Nnat 与miRNA-28存在与动物实验同样的相互作用关系。
[0012] 本发明首次发现miRNA-28在慢性疼痛发生和维持过程中均能通过调控Nnat信号 传导通路进行。作为疼痛抑制基因，miRNA-28能显著抑制慢性疼痛的发生。对慢性疼痛病 人的血样标本进行定量分析发现，miRNA-28在病人血样中的表达也是明显下调。研究结果 表明通过检测或干涉神经中枢中miRNA-28的表达可为慢性疼痛的诊断或治疗提供新的方 案。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1是miRNA-28在CFA疼痛模型中脊髓水平差异表达。
[0014] 图2是鞘内注射miR-28模拟物对CFA炎性疼痛模型大鼠痛行为学影响。制备CFA 炎性慢疼痛模型大鼠，第三天开始隔天微注射miR-28模拟物，注射2小时后测定大鼠对热 激疼痛反应，发现注射miR-28后明显减轻CFA大鼠疼痛反应。可看出人为增加 miR-28可 以减轻CFA大鼠疼痛行为，起镇痛作用。
[0015] 图3是miRNA-28祀标预测分析，坚线表示miRNA-28与Nnat配对的碱基。
[0016] 图4是荧光素酶报告基因法验证Nnat是miRNA-28的直接调控靶标。将miRNA-28 结合Nnat的50bp DNA片段构建到荧光素酶表达载体PsiCHECK2 (Promega)上荧光素酶的 3'端，将人工合成miRNA-28与载体共转染到293T细胞，检测荧光素酶表达。Nnat-vector 代表野生型载体，mutatant-vector代表突变型载体，Empty-Vector代表空载体；横坐标 intrace 1 luar miR-28 代表转染时无外源性miRNA-28，miR-28mimics 表不miRNA-28 与 Nnat 载体。
[0017] 图5是CFA疼痛中Nnat蛋白检测结果。
[0018] 图6是miRNA-28在慢性疼痛病人血样中的差异表达。
[0019] 图7是荧光素酶报告基因法将Nnat的50bp序列构建到表达载体的相应位点。载 体信息：表达克隆包含SV40启动子驱动的报告基因（萤火虫荧光素酶）的下游紧接3' 一 UTR(即miRNA作用位点）序列；第二个报告基因 renilla luciferase(hRLuc)，可用于监测 转染，表达效率，并可以作内参。
【具体实施方式】
[0020] 1. CFA慢性关节炎疼痛模型制备：
[0021] SPF级雄性SD大鼠（250 g?270 g)在异氟醚麻醉下，左后肢足底皮下注射100 微升CFA，成年小鼠（23?28g)左后肢足底皮下注射20微升CFA。对于幼年大鼠（9 一 14 天），在双后肢分别注射40微升CFA，由于新生鼠免疫系统发育不完全，2天后后肢的炎性即 会消失，因此2天后再注射20微升CFA，这样产生的炎性疼痛至少能维持4天。以上对照 组均注射0.9%生理盐水。因为动物在注射CFA 3天后对热刺激或机械刺激的反应最为强 烈，此时用作持续炎性痛模型。
[0022] 2.疼痛行为监测：
[0023] a.机械性异常疼痛：参照文献（Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung Jl, Yaksh TL:Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Meth〇dsl994, 53(1) :55-63.)用Von Frey纤维丝检测大鼠患侧后肢机械性缩足反射阈 值（paw withdrawal mechanical threshold, PWMT):大鼠置于透明玻璃隔窗中，下衬孔径 0. 5cm的有孔玻璃隔板，待大鼠安静后，用不同折力的Von Frey纤维丝刺激患侧后爪跖的 外侧面（腓肠神经区域）和内侧面（隐神经区域）区域。按不同压力从小到大垂直刺激， 每次逐渐加压使纤维丝弯曲成S形并保持持续6-8s，观察大鼠在刺激时间内是否缩足，若 迅速抬足移开刺激纤维丝则为阳性反应，个体自发体动不记做阳性反应。每次刺激间隔5s， 连续10次，能诱发4-6次缩足反应的纤维丝折力作为PWMT阈值纪录。
[0024] b.热痛觉过敏：将有机玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，按Hargreaves法（Harg reaves, K. , Dubner, R. , Brown, F. , Flores, C. , and Joris, J. (1988). A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.Pain 32, 77-88.)用热辐射刺激以照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至大鼠出现抬足 时间，截止时间为20 s。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定时间间隔5 min。
[0025] 3.采用慢病毒过表达技术在体调控背根神经节miRNA表达
[0026] 采用慢病毒载体过表达技术过表达miR-28的原理与步骤：先用Lentiviral的 pCMV构建pri-miR-28表达载体，转染293T细胞（3. 75 X 106细胞/10cm种植平板），转染 后48-60小时离心收获繁殖的病毒颗粒。然后在体注射鞘内：大鼠经异氟醚麻醉后，注射3 次病毒悬浮液（浓度在3. 6 X 107-4. 5 X 109 IFU/ml)，每次1 μ 1，注射时沿着背根神经节背 面的中、左和右三个部位，每次注射时间60s，注射后注射器停留组织内60s。每只大鼠每天 注射一次，共注射5天。
[0027] 4.蛋白免疫印迹（Western-blot)
[0028] 在样品中加入裂解液，置于液氮中反复冻融数次后，再超声彻底破碎样品，离心分 离出蛋白质，对取得的蛋白样品进行定量。在蛋白样品中加入上样缓冲液，煮沸3-5分钟， 进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流20mA。待前沿指示剂恰好跑出凝胶后，停止电泳，进行 转膜。将样品转至膜上后，再与所要研究的蛋白的单抗共同孵育，最终进行显色，得到印迹 信号。同时以beta-actin为参照，对信号进行标准化校正，之后在成像系统中读出信号密 度，进行进一步的分析。
[0029] 5. RNA 提取
[0030] 按照Trizol法抽提总RNA，测定浓度后取500ng总RNA进行反转录，得到的cDNA 产物稀释两倍用于RT-PCR的模板。
[0031] 6.采用RT-PCR进行miRNA定量分析
[0032] miRNA的定量分析采用特异性莖环结构反转录引物（stem loop reverse transcription primer, Stem RT Primer)进行反转录后再进行定量PCR检测。由于成熟 的miRNA是由21-25个核苷酸组成的小RNA，因其长度太短并不能通过传统的实时定量PCR 进行检测，但通过特殊设计的茎环结构反转录引物可以对其进行检测。该引物的茎部一端 突出可以跟miRNA -段互补，待引物延伸后，miRNA序列特征被反转录至茎环延伸序列上， 这时就用延伸茎环为模板进行定量PCR。可以实现专一、灵敏性地定量检测miRNA表达。，每 个 PCR 体系加入 2ul 模板，参考 Takara 公司的 SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real time) 的说明进行。
[0033] Stem RT-primer 见序列表（1)。
[0034] 正向引物：序列表（2)
[0035] 反向引物：序列表（3)
[0036] 7.荧光素酶报告基因法
[0037] 将Nnat的50bp序列构建到表达载体的相应位点。载体信息如下：表达克隆包含 SV40启动子驱动的报告基因（萤火虫荧光素酶）的下游紧接3' 一 UTR(即miRNA作用位 点）序列。第二个报告基因 renilla luciferase (hRLuc)，可用于监测转染，表达效率，并可 以作内参。见图7。
[0038] 通过萤火虫荧光素酶的活性分析，可获得miRNA对潜在靶标基因调控作用的结 果。表达克隆转录后形成萤火虫荧光素酶0RF与3 ' UTR的嵌合体mRNA，如果有特异的miRNA 可与3' 一 UTR某段序列互补结合，嵌合体中荧光素酶0RF所编码蛋白的活性也相应受到 调控，因此通过检测荧光素酶的发光强度就可以定量地测定miRNA对应靶标的mRNA调控 的效果。转染过程如下：待293T细胞长到6孔板的70-80%时即可转染。转染时，将合成 的miRNA-2820pmol与含有Nnat的Pezx-MTOl载体0· 8 μ g共转染到H293T细胞，转染后 17-48h即可测定荧光素酶活性。
[0039] 8.人血样RNA提取
[0040] 过程同具体实施步骤4.，按照Trizol法抽提总RNA，测定浓度后取500ng总RNA 进行反转录，得到的cDNA产物稀释两倍后用于RT-PCR的模板。
【权利要求】
1. miRNA-28化合物作为慢性疼痛疾病临床诊断标志物的用途。 2. miRNA-28化合物在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。 3. miRNA-28调控下游靶标基因 nnat在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104152545SQ201410250468
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】李燕强, 曹君利, 潘志强 申请人:徐州医学院
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