与大豆籽粒硬脂酸含量相关的紧密连锁标记及其应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  2

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与大豆籽粒硬脂酸含量相关的紧密连锁标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与大豆籽粒硬脂酸含量相关的紧密连锁标记及其应用。本发明公开的一对引物,该对引物由SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的DNA分子组成。本发明公开的连锁标记可以应用于评价大豆籽粒中硬脂酸含量及大豆选育。
【专利说明】与大豆籽粒硬脂酸含量相关的紧密连锁标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分子标记及其应用;特别涉及一种与大豆籽粒硬脂酸含量相关的紧密连锁标记及其应用,属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]大豆油占世界植物油的30%,它主要包含有五种脂肪酸:软脂酸约占11%左右,硬脂酸约占4%左右,油酸约占24%左右,亚油酸约占54%左右,亚麻酸约占7%左右。虽然软脂酸和硬脂酸都是饱和脂肪酸,但硬脂酸并不同于软脂酸,有研究证明硬脂酸可以降低血液中总的胆固醇水平,益于人类健康,并且可以不用氢化直接生产人造奶油、润滑剂,油墨和生物石油等。因此增加大豆饱和脂肪酸含量以满足用油加工的需要将是一个重要的育种目标。
[0003]近年来,国内外对大豆硬脂酸的研究日渐增多,Spencer等(2003)用Dare xFAM94-41杂交的F2:3分离群体鉴定出连锁群B2上和硬脂酸高度相关的3个SSR标记Satt556, Satt474, Satt070 ;Xianzhi Wang 等利用 SD02-4-59 和 A02-381100 杂交的重组自交系F5,运用CM和頂方法定位到5个和硬脂酸高度相关的标记:BARC-041257-07953、BARC-029787-06340、Satt252、Sat_064、BARC-014699-01621 ;苗兴芬等在多种环境下检测到6个和硬脂酸有关的位点等,开发新的与大豆籽粒硬脂酸含量相关的紧密连锁标记对评价大豆籽粒中硬脂酸含量以及大豆育种具有重要意义。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一种与大豆籽粒硬脂酸含量相关的紧密连锁标记及其应用。
[0005]本发明提供一对引物,该对引物由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子组成。
[0006]一种分子标记也属于本发明的保护范围,该分子标记是以植物组织的基因组DNA为模板,以所述的引物对为引物进行PCR扩增得到的DNA片段。
[0007]上述分子标记中,所述植物为大豆;
[0008]所述组织具体为叶片;
[0009]所述大豆具体为冀豆12号和/或黑豆。
[0010]所述黑豆为黑豆(ZDD03651)。
[0011]一种评价待测大豆的籽粒硬脂酸含量高低的方法也属于本发明的保护范围,,包括如下步骤:以待测大豆组织的基因组DNA为模板,以所述的引物对为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;PCR扩增产物大小在140-155bp之间的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR扩增产物含有大小分别在140-155bp之间的片段和在160-170bp之间的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量,PCR扩增产物含有大小分别在140-155bp之间的片段和在160_170bp之间的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR扩增产物大小在160-170bp之间的大豆的籽粒硬脂酸含量。[0012]上述方法中,所述PCR扩增产物大小在140_155bp之间的片段,与以冀豆12号组织的基因组DNA为模板,以所述的引物对为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物的片段一致;
[0013]所述PCR扩增产物大小在160-170bp之间的片段,与以黑豆ZDD03651组织的基因组DNA为模板,以所述的引物对为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物的片段一致。
[0014]上述任一所述的方法中,所述组织为叶片。
[0015]上述任一所述的方法中,所述待测大豆为冀豆12号和黑豆ZDD03651的杂交后代。
[0016]上述任一所述的方法中,所述冀豆12号为母本;
[0017]所述黑豆ZDD03651为父本;
[0018]所述杂交后代为Fl代和/或Fl代自交得到的F2代和/或F2代连续自交得到的后代。
[0019]上述引物对、上述任一所述的分子标记在评价大豆籽粒的硬脂酸含量高低中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020]上述引物对、上述任一所 述的分子标记在大豆选育中的应用也属于本发明的保护范围。
[0021]上述任一所述的应用中,所述大豆为冀豆12号和黑豆的杂交后代;
[0022]所述冀豆12号具体为母本;
[0023]所述黑豆具体为父本;
[0024]所述黑豆具体为黑豆(ZDD03651);
[0025]所述杂交后代为Fl代和/或Fl代自交得到的F2代和/或F2代连续自交得到的后代。
[0026]本发明提供的连锁标记可以应用于评价大豆籽粒中硬脂酸含量及大豆选育。
【专利附图】

【附图说明】
[0027]图1为群体1、群体II以及两亲本的籽粒硬脂酸含量的表型分布。
[0028]图2为satt556附近的5个标记间遗传连锁图。
【具体实施方式】
[0029]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0030]下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0031]冀豆12号(Glycine max(L.)Merr)在文献“陈强等.冀豆12遗传背景下3个回交组合高低蛋白含量后代品系SSR标记分析[J].中国农业科学,2014,47 (2): 230-239”中公开过,公众可从河北省农林科学院粮油作物研究所获得。
[0032]黑豆(ZDD03651)(Glycine soja Sieb.Et Zucc.)在文献“雷雅坤.大豆五种脂肪酸含量遗传分析与QTL定位[D].石家庄:河北师范大学,2012.”中公开过,公众可从河北省农林科学院粮油作物研究所获得。
[0033]实施例1、大豆籽粒硬脂酸含量检测方法
[0034]将待检大豆样品用研磨仪充分研磨,磨好后取0.1g豆粉放入2.0mL离心管中,加ImL脂肪提取液(苯:石油醚体积比1: 1,混匀),振荡混匀60min,离心后取上清,加1.5mL的0.4mol/L甲醇钾(IOmL甲醇中加入0.2g氢氧化钾)甲酯化,静置60min,加5ml蒸馏水,使样品分层。吸取2 μ L最上层油份萃取物进行气相色谱分析(采用安捷伦6890Ν气相色谱仪)。
[0035]色谱条件:FID检测器,FFAP弹性石英毛细管柱,恒压的模式,载气:高纯氮气流速:lmL/min ;H2 流速:35mL/min ;空气流速:350mL/min。进样量:2yL。分流比:10:1,进样口的温度:250°C。检测器的温度:250°C。程序温:180°C,3min,9°C /min升到225°C /min,保持 25min。
[0036]通过气相色谱计算检测的硬脂酸占总脂肪酸的含量,最终得到待检大豆籽粒总脂肪酸中的硬脂酸含量。
[0037]实施例2、与大豆籽粒硬脂酸含量相关的紧密连锁标记的筛选
[0038]一、群体的构建
[0039]以冀豆12号(Glycine max(L.)Merr)为母本,地方半野生品种黑豆(ZDD03651)(Glycine soja Sieb.Et Zucc.)为父本杂交,在初定位的基础上,选择与硬脂酸含量紧密连锁标记satt556附近的3个标记(satt474、sct_094、satt556)在其衍生的F2:6代次级群体中进行扫描,筛选出3个标记均杂合的剩余杂合体,将其衍生的85个单株组成RHL (剩余杂合系)。
[0040]2012年6月将RHL播种于石家庄堤上试验站,筛选3个标记均杂合的单株I株。2012年11月该单株200粒种子衍生成次级群体I,采用单粒点播种植于三亚试验站,单株收获。2013年6月从群体I每株的种子中取一粒种子衍生成次级群体II,单粒播种于石家庄堤上试验站,单株收 获。
[0041]二、DNA的提取及SSR引物的筛选
[0042]在田间采集次级群体I和次级群体II的单株苗期第4周的第三片复叶,采用SDS 法提取 DNA。参照文献“Song QJ, Jia GF, Zhu YL, Grant D, Nelson RT, Hwang EY, HytenDL, Cregan PB (2010) Abundance of SSR motifs and development of candidate polymorphicSSR markers(BARCS0YSSR_1.0)in soybean.Crop Sci50:1950 - 1960.Cregan, P.B.,T.Jarvik, A.L.Bush, R.C.Shoemaker, K.G.Lark, A.L.Kahler, N.Kaya, T.T.VanToai, D.G.Lohnes, J.Chung, and J.E.Specht.1999.An integrated genetic linkage map of thesoybean.Crop Sc1.39:1464 - 1490”公开的标记,从中选择48个在satt556附近的标记,筛选出3个在母本和父本中有差异的SSR引物,并根据Soybase网站(http://soybase.0rg/)提供的大豆SSR序列合成扩增相应标记的引物。
[0043]三、带型检测
[0044]分别以步骤二提取的DNA为模板,以各SSR引物为引物进行PCR扩增,进行相应分子标记带型检测,将所得的带型记作带型X ;以冀豆12 (母本)的DNA为模板,以相应的SSR引物为引物进行PCR扩增,进行相应分子标记带型检测,将所得的带型记作带型A ;以黑豆(父本)的DNA为模板,以相应的SSR引物为引物进行PCR扩增,进行相应分子标记带型检测,将所得的带型记作带型B ;X有三种情形,第一种为X与A —致,第二种为X与B —致,第三种为X为既含有A,又含有B的杂合带型,将此杂合带型记作带型H。
[0045]其中5个标记的引物如表1所示。
[0046]其中Barcsoyssr_14_1033的上游引物如SEQ ID N0.3所示,下游引物如SEQ IDN0.4所示。
[0047]当所用的SSR引物为Barcsoyssr_14_1033标记的引物时,A带型的大小在140-155bp之间,B带型的大小在160-170bp之间,H带型的大小分别在140_155bp和160-170bp 之间。
[0048]表1引物序列表
[0049]
【权利要求】
1.一对引物,该对引物由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子组成。
2.一种分子标记,该分子标记是以植物组织的基因组DNA为模板,以权利要求1所述的引物对为引物进行PCR扩增得到的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的分子标记,其特征在于:所述植物为大豆; 所述组织具体为叶片; 所述大豆具体为冀豆12号和/或黑豆。
4.一种评价待测大豆的籽粒硬脂酸含量高低的方法,包括如下步骤:以待测大豆组织的基因组DNA为模板,以权利要求1所述的引物对为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;PCR扩增产物大小在140-155bp之间的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR扩增产物含有大小分别在140-155bp之间的片段和在160-170bp之间的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量,PCR扩增产物含有大小分别在140-155bp 之间的片段和在160-170bp之间的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR扩增产物大小在160-170bp之间的大豆的籽粒硬脂酸含量。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述PCR扩增产物大小在140-155bp之间的片段,与以冀豆12号组织的基因组DNA为模板,以权利要求1所述的引物对为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物的片段一致; 所述PCR扩增产物大小在160-170bp之间的片段,与以黑豆ZDD03651组织的基因组DNA为模板,以权利要求1所述的引物对为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物的片段一致。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述组织为叶片。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法,其特征在于:所述待测大豆为冀豆12号和黑豆ZDD03651的杂交后代。
8.根据权利要求4-7任一所述的方法,其特征在于:所述冀豆12号为母本; 所述黑豆ZDD03651为父本。
9.权利要求1所述的引物对、权利要求2或3所述的分子标记在评价大豆籽粒的硬脂酸含量高低中的应用。
10.权利要求1所述的引物对、权利要求2或3所述的分子标记在大豆选育中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104004757SQ201410251971
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】张孟臣, 邓莹莹, 张梅申, 雷雅坤, 杨春燕, 闫龙, 东方阳, 乔亚科 申请人:河北省农林科学院粮油作物研究所, 河北科技师范学院

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