一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用的制作方法

一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用，植物强耐盐基因SseNHX1如SEQ?ID?NO:1所示；植物强耐盐基因SseNHX1编码的Na+/H+逆向转运蛋白如SEQID?NO:2所示；植物强耐盐基因SseNHX1在培育抗盐植物方面的应用。本发明将同一家族中的2个不同来源的Na+/H+逆转运蛋白基因(NHX1)通过基因改组后获得的高度耐盐的基因(SseNHX1)遗传转化模式植物烟草，经过盐胁迫处理后能够进一步提高转基因烟草的耐盐性，为培育出更具耐盐性的新遗传材料提供了依据。
【专利说明】—种植物强耐盐基因SseNHXI及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及到植物基因工程领域，具体是涉及一种植物强耐盐基因SseNHXl及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002]土壤盐碱化问题是目前全球最严重的环境问题之一，包括人口膨胀的各方面因素不断使人类开发和利用大面积的土地，逐渐生成新的次生盐溃化，加速了土壤盐碱化的进程。目前全世界大约20%的耕种土地和50%的灌溉土地都不同程度的受到了盐溃化的危害，并且每年平均约12万hm2 土地发生次生盐溃化(Zhu J K, Plant salt tolerance.Trendsin plant science.2001,6(2):66-71)。因此，土壤资源的开发和高效利用是保护人类粮食安全的重中之重。长期以来，为解决土壤的盐溃化问题，国内外展开了广泛的研究。传统的解决方法有挖沟排碱、淡水压碱、平地深翻等。这些方法不但投资大，而且收效甚微。因此，从生物学的角度解决植物本身的耐盐问题是盐溃化土地改良和利用的根本出路。在当今提倡生态效益为重的前提下，普遍认为生物改良措施是最具有生态效益、经济效益的措施。因而，若能够发现并创制耐高盐的新型基因，进而将这些基因转化到植物中以培育植物耐盐新遗传材料用于盐溃化土地的生物改良，应对未来农业发展人口增多、可用耕地减少的挑战，均具有重大的科学意义和经济价值。
[0003]盐分对植物胁迫分为渗透胁迫、离子伤害、离子不平衡或营养缺乏三类，渗透胁迫和离子伤害目前被认为是对植物危害的两个主要过程(Blumwald E, Aharon G S，Apse MP.Sodium transport in plant cells.Biochem Biophy Acta.2000, 1465:140-151)。在盐胁迫下，一方面植物被迫吸收盐离子，由于盐离子的毒害作用，造成活性氧等自由基产生和修复系统的动态平衡被破坏，启动了膜脂过氧化或膜蛋白过氧化作用，造成膜脂或膜蛋白损伤，从而破坏膜结构，使质膜的透性增加，胞内水溶性物质外渗，植物表现出盐害特征。另一方面，土壤中的盐分使土壤溶液的水势降低，植物吸水困难造成“生理干旱”，从而表现出旱害特征。
[0004]为了抵御盐离子的胁迫，植物体形成了一系列的调节适应机制。植物耐盐的机制在细胞水平上主要有渗透调节和离子均衡两个方面。渗透调节主要是植物通过在细胞质中积累脯氨酸、甘露糖、甜菜碱等渗透保护剂和其他无机盐来降低渗透势，避免失水。植物离子均衡的策略涉及消除Na+毒害，其核心就是降低细胞内Na+浓度，促进细胞对K+的吸收(Viswanathan C，Andre J, Zhu J K.Understanding and improving salt tolerancein plants.Crop Sci, 2005,45(2):437-448)。而降低细胞内Na+含量主要通过Na+的外排和Na+的液泡区隔化来实现，一般是由位于细胞质膜或液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白来承担。液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(Vacuolar Na+/H+Antiporter, NHX)位于植物液泡膜上，可以使Na+在液泡内区域化，不仅可以减少盐分对植物细胞的伤害，还可以促进细胞从外界环境中吸水维持渗透平衡，对改善植物耐盐性起着非常重要的作用(Mansour MMF，Salama K H A, Al-Mutawa M M.Transport proteins and salt tolerance in plants.PlantScience, 2003, 164:891-900.)。
[0005]近几年，通过转化NHX基因以提高植物耐盐性的基因工程已经展开，并在高等植物拟南芥等材料中取得了一定进展。到目前已经从拟南芥、水稻、北滨藜、冰叶午时花、碱蓬、盐角草等植物中分离出了 NHX基因，并都已证明该基因的表达产物具有Na+/H+交换的功能。这些结果表明，NHX基因是一种非常有效的耐盐基因，利用基因工程手段将其转入非抗盐性农作物中，可以培育出抗盐的转基因作物新品种，使其正常生长在盐溃土壤上。在实际生产应用上，植物耐盐基因工程大多集中在针对单个耐盐基因的克隆及遗传转化，单个耐盐基因尽管能够在一定程度上提高植物的耐盐性，然而，由于已克隆的单个基因活性不高、耐盐性不强的缺陷，很大程度上限制了该基因的生产应用和推广。因此，利用分子生物学技术提高单个耐盐基因的耐盐能力逐渐成为了扩展耐盐基因应用进而培育更强转基因耐盐植物的新方向。
[0006]1994 年美国 Stemmer (Stemmer W.P.C.Rapid evolution of a protein in vitro byDNA shuffling.Nature, 1994，370(4):389-391)首次提出 DNA shuffling 的策略。DNA 改组(DNA shuffling)又称有性PCR(sexual PCR)，其基本操作过程是:将一群密切相关的序列，如多种同源而有差异的基因(或一组突变的基因文库)，在DNase I的作用下随机切割，得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环。在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增直到获得全长的基因。这些重排产物的集合又称嵌合文库(突变文库)。由于片段之间可借助互补序列而自由匹配，一个亲本的突变可与另一亲本的突变相结合，从而可以产生新的突变组合。进一步，再对嵌合文库筛选，以期望最终获得性能满意的突变体。当DNA shuffling用于一组同源基因时，这种技术称为“DNA家族改组”(DNA familyshuffling)。DNA家族改组是一项高效的体外进化技术,该技术利用自然界中具有同源序列的基因家族如来自不同种属的相同基因以及同一种属的相关基因等进行改组，为蛋白质定向进化和结构一功能关系分析等研究提供了有效获得突变文库的方法。与单个基因的改组相比，DNA家族改组技术不仅可以显著加速有益突变的累积，还易于实现目的蛋白多种特性的共进化。
[0007]DNA shuffling技术自诞生以来，已在基础研究、工业、农业、医药、环保等各方面得到广泛应用，尤其是在酶的改良、药物蛋白的优化方面应用成果显著。大肠杆菌葡糖酸普酶基因改组后，筛选到的新基因表达的蛋白催化降解能力提高500倍；Chang等以多种人a -1NF基因为底物进行DNA shuffling,经两轮改组筛选后得到的大多数活性克隆的活性较野生型提高了 285000倍；因此，相信利用DNA family shuffling技术对盐生植物来源的液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白基因进行改组定能显示其强大的优势，创制出更强的新型耐盐基因。

【发明内容】

[0008]本发明目的在于获得一种能编码具有离子转运活性的Na+/H+逆向转运蛋白的植物强耐盐基因SseNHXl。
[0009]本发明的另一个目的在于提供上述基因编码的Na+/H+逆向转运蛋白SseNHXl，其离子转运活性比野生型的Na+/H+逆向转运蛋白更强。
[0010]本发明还提供了含有上述基因的重组载体。[0011]本发明的另一方面，还提供了含有上述重组载体的宿主细胞。
[0012]本发明的另一方面，还提供了重组载体的构建、转基因植物等方法，以应用上诉基因和编码蛋白培育耐盐性更强的转基因植物新品种。
[0013]本发明的技术方案概述如下:
[0014]一种植物强耐盐基因SseNHXl，所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015]上述植物强耐盐基因SseNHXl编码的Na+/H+逆向转运蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0016]含有上述基因的重组载体。
[0017]含有上述重组载体的宿主细胞。
[0018]上述植物强耐盐基因SseNHXl在培育抗盐植物方面的应用，所述植物强耐盐基因SseNHXl转入植物中，培育出耐盐性及生物学性状得到改善的植物新品种。
[0019]本发明的优点:
[0020](I)用于改组的模板基因SsNHXl和SeNHXl分别来源于碱蓬和盐角草，耐盐基因的耐盐度起点高。通过2个不同来源的Na+/H+逆转运蛋白基因进行DNA改组定向进化，大大增加了筛选到高度耐盐基因(即正义突变子)的几率。
[0021](2)采用盐敏感型酵母突变体 AXT3(Aenal_4::HIS3Anhal::LEU2Anhxl::TRPD来进行改组后突变基因的高通量筛选，大大提高了筛选效率。
[0022](3)本发明将同一家族中的2个不同来源的Na+/H+逆转运蛋白基因(NHXl)通过基因改组后获得的高度耐盐的基因(SseNHXl)遗传转化模式植物烟草，经过盐胁迫处理后能够进一步提高转基因烟草的耐盐性，为培育出更具耐盐性的新遗传材料提供了理论依据。
【专利附图】

【附图说明】
[0023]图1为SsNHXl和SeNHXl的DNA改组过程。
[0024]图2为部分改组文库的耐盐筛选。其中箭头所指的是含有强耐盐改组基因SseNHXl的酵母菌落。
[0025]图3为SseNHXl与SsNHXUSeNHXl的氨基酸序列比对。其中白色框标记为随机突变的氨基酸；灰色阴影框标记为氨基酸替换情况。
[0026]图4为改组获得的SseNHXl基因与未改组SsNHXl、SeNHXl基因在酵母突变菌株AXT3中功能互补实验比较，即在含有O、50、75、100和150mM NaCl的APGal平板上生长情况:其中I为含有PYES2质粒的野生型W303，II为含有pYES2质粒的缺陷型菌株AXT3，III为含有pYES2-SsNHXl重组质粒的AXT3菌株，IV为含有pYES2_SeNHXl重组质粒的AXT3菌株，V为含有pYES2-SseNHXl重组质粒的AXT3菌株。
[0027]图5为盐胁迫I个月后野生型烟草和转基因烟草(分别转SsNHXl、SeNHXl和SseNHXl基因)植株表型。
【具体实施方式】
[0028]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0029]实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0030]实施例1.碱蓬和盐角草Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆
[0031]用Trizol试剂从碱蓬和盐角草植物叶片中抽提总RNA，以总RNA为模板进行反转录，合成cDNA第一链。以合成的cDNA为模板，参照对编码Na+/H+逆向转运蛋白的野生型耐盐基因SsNHXl (来源于碱蓬，其GenBank序列号:AY261806)和SeNHXl (来源于盐角草，其GenBank序列号::AY131235)的cDNA序列设计以下引物(5’端分别包含BamHI和SalI酶切位点):
[0032]ssF (5，-CGCGGATCCATGTGGTCACAGTTAAGCTC-3，) SEQ ID NO: 3
[0033]ssR(5，-ACGCGTCGACTTATGTTCTCTGTGACAAATTAGTGG-3’ ) SEQ ID NO: 4
[0034]seF (5，~CGCGGATCCATGTTGTCACAATTGAGCTC~3，) SEQ ID NO: 5
[0035]seR(5，~ACGCGTCGACTGTTCTGTCTAGCAAATTGTC~3，) SEQ ID NO: 6
[0036]通过PCR扩增获得碱蓬Na+/H+逆向转运蛋白基因SsNHXl和盐角草Na+/H+逆向转运蛋白基 因SeNHXl，分别将其连接到pMD-18T载体中，转入大肠杆菌T0P10，克隆得到SsNHXl和SeNHXl的序列，并通过测序来确定。
[0037]实施例2.SsNHXl、SeNHXl基因的DNA改组
[0038]I)改组模板的制备分别以pMD-18T_SsNHXl和pMD-18T_SeNHXl质粒为模板，用TaqPlus DNA聚合酶分别对两个基因进行PCR扩增，纯化后作为DNA家族改组的模板。
[0039]2) DNaseI随机酶切紫外吸收法测定纯化后的DNA浓度，分别取含量为1.5 μ g的模板混合。取混合后的模板加入到50 μ L酶切反应体系中。
[0040]首先用0.15Μ NaCl (Sigma)稀释 DNaseI (N0.EN0525Fermentas, IOU/ μ I) 100 倍至浓度为0.1U/ μ Lo
[0041]DNaseI消化反应体系:
[0042]
【权利要求】
1.一种植物强耐盐基因SseNHXl，其特征是所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1的植物强耐盐基因SseNHXl编码的Na+/H+逆向转运蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.含有权利要求1所述基因的重组载体。
4.含有权利要求3所述重组载体的宿主细胞。
5.权利要求1所述的植物强耐盐基因SseNHXl在培育抗盐植物方面的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103993020SQ201410252475
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】王罡, 季静, 吴广霞, 高海伶, 王昱蓉 申请人:天津大学