一种耐油具柄菌及其应用的制作方法
一种耐油具柄菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种耐油具柄菌，即一种能抑制致病菌毒力因子分泌的密度感应淬灭菌株，该耐油具柄菌(Muricauda?olearia)LMM001菌株保藏号为CGMCC?No.8972。本发明还提供供从LMM001菌株中分离的AHL降解酶MomL蛋白，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1。本发明的耐油具柄菌LMM001菌株，可通过小分子QS阻抑物、AHL内酯酶MomL和AHL酰基转移酶等多种方式阻断致病菌的QS通路，降低致病菌毒力因子的分泌；菌株LMM001对斑马鱼没有毒副作用；菌株LMM001能提高斑马鱼对嗜水气单胞菌侵染的抵抗力；AHL内酯酶能大大降低铜绿假单胞菌胞外蛋白酶和绿脓菌素等毒力因子的分泌，能降低紫色色杆菌紫色杆菌素的合成。
【专利说明】一种耐油具柄菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于有益菌筛选【技术领域】，具体涉及一种耐油具柄菌及其应用。
【背景技术】
[0002]目前，抗生素是公认的治疗细菌性疾病的有效方法，传统的抗生素主要通过抑制细胞壁的合成、DNA的复制、RNA的转录以及蛋白质的合成等一些微生物所必需物质的合成或代谢途径，杀死细菌或抑制细菌的繁殖，从而实现对细菌性疾病的治疗目的。这种“生”或“死“的选择性压力，使随机突变产生的抗生素抗性基因得以保留，从而导致抗生素抗性突变的细菌迅速成为微生物群落中的优势种群，进而导致细菌抗药性的产生。而抗生素的滥用进一步加快了细菌抗药性的出现。与此同时新型抗生素的研发速度已经大大降低，往往新型抗生素推广到市场后的几年内就会有相应的抗性细菌出现。这样的现状促使人们开发一种不同于传统抗生素作用机制的新型细菌性疾病治疗手段。其中一种具开发前景的方法被称为抗毒力治疗(antivirulence therapy),该方法是以细菌的毒力因子本身(毒力因子的表达、功能及运输以及细菌的粘附作用等)为靶位，而不是上述微生物所必需的物质合成或代谢途径，因此从理论上来说能够大大降低其使用过程中对细菌产生的选择性压力从而有效降低产生细菌抗药性的几率。
[0003]密度感应(quorum sensing, QS)在1994被首次提出，用来描述夏威夷鱿鱼发光器官中的费氏弧菌(Vibrio fischeri)通过分泌和识别化学信号分子(autoinducers, AIs)来检测种群密度，从而在群体水平上协调其荧光素酶基因(luxABCDE)表达的现象。目前已经报道的信号分 子主要有革兰氏阴性菌的N-酰基高丝氨酸内酯分子(N-acylhomoserine lactone, AHL)、革兰氏阳性菌的寡妝分子(autoinducing peptide, AIP)以及在革兰氏阴性和阳性菌中普遍存在的A1-2分子。研究发现,铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、弧菌属(Vibrio)和伯克氏菌属(Burkholderia)等多种致病菌中致病因子的分泌和AHL类QS密切相关。另外，生物被膜(biofilm)在致病菌的宿主防御机制以及抗生素的抗药性中起关键作用，它的形成也受QS的调控作用。由于QS系统不是微生物生存所必需的，因此淬灭密度感应(quorumquenching, QQ)可以在不杀死细菌的情况下大大地降低其毒力的表达，同时大大降低环境中的选择压力以及出现细菌抗药性的几率，因此密度感应淬灭技术是极具开发前景的一种抗毒力治疗手段。
[0004]目前发现的AHL类的QS系统的密度感应淬灭活性物质主要有信号分子降解酶和QS阻抑小分子物质。小分子阻抑物主要有呋喃酮、肉桂醛及其衍生物和信号分子类似物。动物模型侵染实验表明呋喃酮和肉桂醛等小分子阻抑物能够大大降低哈维氏弧菌和铜绿假单胞菌等致病菌的致病性。目前在很多种细菌中发现了信号分子降解酶，根据降解机制的不同可分为三类=AHL内酯酶(内酯环水解作用)，AHL酰基转移酶(氨基水解作用)以及AHL氧化还原酶(氧化还原作用)。AHL降解酶尤其是AHL内酯酶对不同长度酰基链的信号分子(C4-C12)均具有高效的降解活性。动物实验表明，在毕赤酵母表达系统中过量表达的AHL内酯酶(AiiA)和嗜水气单胞菌混合注射鲤鱼能大大降低鲤鱼的致死率。AHL降解菌株的富集培养液能提高卤虫和大菱鲆的成活率以及增强罗氏沼虾对哈维氏弧菌的抵抗力。因此在防治海水养殖病害方面，密度感应淬灭菌株具有很广阔的发展前景。
[0005]目前发现的密度感应淬灭菌大多是来源于陆地，而已发现的25个种海洋细菌中只有边山假交替单胞菌(Pseudoalteromonas byunsanensis) 1A01261的QQ酶获得了鉴定。陆地来源的菌株可能会因为不适应海水环境而不宜作为海水养殖的有益菌，因此从海洋或水产养殖动物环境中分离的土著QQ菌株，对密度感应淬灭技术在水产养殖上的应用尤为重要。不仅如此，许多哺乳动物及人类致病菌的毒力也受到QS调控，因此新型高活性的QQ酶具有广阔的药物开发前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种耐油具柄菌及其应用，即一种能抑制致病菌毒力因子分泌的密度感应淬灭菌株，从而弥补现有技术的不足。
[0007]本发明的耐油具柄菌(Muricauda olearia)LMMOOl菌株，已于2014年3月28日保藏在位于北京朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8972。
[0008]耐油具柄菌LMMOOl的培养温度为范围是15_40°C，最佳培养温度为25_30°C;生长pH值范围为5.2-9.4，最 适生长pH为6.8-7.7。
[0009]本发明的菌株可用于制成用于淬灭水产养殖病原菌的密度感应系统，降低其毒力因子的分泌的菌制剂。
[0010]上述菌制剂中包含有耐油具柄菌LMMOOl菌株的活菌。
[0011 ] 上述的菌制剂为饲料添加剂或养殖水体添加剂。
[0012]本发明还提供从LMM001菌株中分离的AHL降解酶MomL蛋白，其中MomL降解酶包括有:
[0013]I)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的MomL蛋白；
[0014]2)将I)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有I)中蛋白的AHL降解活性的，由I)所衍生的蛋白。
[0015]本发明还提供用于编码MomL蛋白的核苷酸；其中编码MomL的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2o
[0016]所述的AHL降解酶MomL蛋白用作水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂。
[0017]本发明的耐油具柄菌LMMOOl菌株，可通过小分子QS阻抑物、AHL内酯酶MomL和AHL酰基转移酶等多种方式阻断致病菌的QS通路，降低致病菌毒力因子的分泌；菌株LMMOOl对斑马鱼没有毒副作用；菌株LMMOOl能提高斑马鱼对嗜水气单胞菌侵染的抵抗力；AHL内酯酶能大大降低铜绿假单胞菌胞外蛋白酶和绿脓菌素等毒力因子的分泌，能降低紫色色杆菌紫色杆菌素的合成。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1:MomL的C6-HSL降解活性图。【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明的菌株进行详细的描述。
[0020] 一、耐油具柄菌LMM001菌株的分离
[0021]2011年3月份将取自养殖场的健康牙鲆的体表粘液涂布海洋细菌培养基2216E平板上，28°C培养2d之后发现黄色菌落细菌，挑取单菌落进行继代培养，直至得到纯化的菌株，并通过对AHL降解活性效率的筛选得到目的菌株，命名为LMM001。
[0022]通过16s rRNA基因比对分析确定本发明菌株LMM001为耐油具柄菌(Muricaudaolearia)。
[0023]二、耐油具柄菌LMM001菌株的AHL降解活性的检测
[0024]先接种LMM001于海水2216E培养基中，于摇床170rpm、28°C培养24h。在培养获得的菌液中加入不同碳链长度的AHL分子(C6-C14-HSL)后在28°C反应24h。离心取上清用AHL报告菌报告菌根癌农杆菌A136 (pCF218) (pCF372)、紫色色杆菌CV026和VIR24检测剩余的AHL分子，发现菌株LMM001能在Ih内将加入的终浓度为10 μ M的所有碳链长度的AHL分子降解。
[0025]三、耐油具柄菌LMM001对斑马鱼的保护作用
[0026]将菌株LMM001按注射量3.60 X IO7Cfu/尾腹腔注射斑马鱼，每个实验组设置三个平行，每个平行实验组10尾斑马鱼，20天后没有发现斑马鱼死亡，说明其对斑马鱼无毒副作用。另外设置三个平行实验组，每个平行实验组10尾，在水体中加入菌株LMM001至终浓度约为IXlO6Cfu πιl-1，每天按换水量补加菌株Th20的菌悬液，一个星期后，加入嗜水气单胞菌AHKl至终浓度为I X IO7Cfu πιL-1，每天按换水量补加菌株LMM001菌悬液和AHKl菌悬液，对照组不加LMM001菌悬液，观察记录斑马鱼的死亡情况。发现对照组在嗜水气单胞菌的侵染下只有大约20%的成活率，而加入菌株LMM001的实验组的斑马鱼成活率为60%，说明菌株LMM001能提高斑马鱼抗嗜水气单胞菌侵染的能力。
[0027]三、本发明AHL降解酶MomL的鉴定
[0028]采用Illumina高通量测序技术对LMM001的全基因组进行了测序及分析,经RAST服务器进行基因注释后也测到可能具有AHL降解活性的蛋白。采用大肠杆菌表达系统构建BL21 (DE3) -pTWINl-MomL表达菌株，发现重组MomL蛋白能降解C4-C14-HSL分子，这说明这MomL是AHL降解酶。用AHL报告菌CV026检测MomL的C6-HSL降解活性(见图1)，0.078U的MomL能形成明显的抑制圈(报告菌CV026检测到C6-HSL时显紫色)。
[0029]四、MomL的AHL降解机制
[0030]AHL内酯酶的作用机制是水解AHL分子的内酯环，开环的AHL在酸性条件下(pH2)能够重新闭环恢复AHL分子活性，而AHL酰基转移酶的对AHL的降解机制不同，因此可以用酸化实验初步检测AHL降解活性是否为内酯酶活性。
[0031]AHL内酯酶活性的初步检测采用酸化法:向表达出来的MomL中加入终浓度为10 μ M的C6-HSL，28V反应24h后，反应液经4°C，13000g离心10min收集上清液，收集的上清沸水浴处理5min，加入适量的过滤除菌的盐酸1M)至pH2左右，于28°C孵育24h，用AHL报告菌CV026和VIR24检测AHL恢复情况。
[0032]酸化试验发现被MomL降解的C6-HSL能获得恢复，说明MomL是AHL内酯酶。为了进一步验证MomL对AHL的降解机制，利用HPLC-MS检测确定其对C6-HSL以及C12-HSL的降解产物。MomL的C6-HSL降解产物分子量主要是为218。C6-HSL的分子式为CltlH17NO3，理论分子量为199.25，被AHL内酯酶水解后的产物是C6-HS，分子式为CltlH19NO4，理论分子量为217.25，这与结果中分子量为218的化合物相近，因此MomL降解C6-HSL的产物是C6-HS，因此MomL是AHL内酯酶。
[0033]五、MomL的酶学性质
[0034]AHL分子被内酯酶水解后会产生一个质子(H+，水解后的羧基电解产生)，而累计产生的质子可使PH发生变化，当在具有弱缓冲能力的反应体系中加入pH指示剂时就可以通过检测吸光度的变化来反应AHL内酯酶活性，该方法叫做pH指示的连续分光光度分析法。该方法关键在于选择合适的pH指示剂和缓冲溶液组成一个缓冲体系，其中pH指示剂的PKa值与缓冲液的pKa值越接近越好。目前对AHL内酯酶的酶学动力学参数主要采用苯酚红和HEPES系统(pKa ^ 7.9)或甲酚紫和N，N- 二羟乙基甘氨酸系统(pKa ^ 8.4)，但是由于系统自身的PKa值设定过高，可能会促进AHL的化学水解。本论文采用溴麝香草酚蓝(Bromothymol Blue,简称 BTB, pKa = 7.1)和 M0PS(pKa = 7.2)系统，两者的 pKa 相差不大并且接近中性，该系统已经被广泛地用于其他水解酶的酶学动力学参数的检测。
[0035]具体方法为:配制2XM0PS储存液(5mM，pH7.1) ;10XBTB储存液(ImM)。在100 μ I的反应体系中加入50 μ I MOPS储存液，10 μ I BTB储存液，加入0.156_5mM的AHL，DMS0的终浓度为1%，加入适量的待测重组MomL，加入三蒸水至100 μ 1，温度25°C，酶标仪630nm处连续检测50次(每30s检测一次)。计算每个浓度AHL的反应初速度，按照标准曲线换算。每个实验组设置三个平行。
[0036]利用上述方法检测MomL的酶学性质，发现:
[0037]1、重组 MomL 对信号分子 C4_、C6_、30C6、C8、30C8 和 30C10 的 kd/Kjs^T1)值分别为 1.6Χ105、2.9Χ105、3.I X ΙΟ5』.6X ΙΟ5、..5X IO5 和 5.1XlO50
[0038]2、MomL的最适反应温度为40°C。
[0039]3、MomL的温度稳定性:60度处理30min后保持32%的C6-HSL降解活性。
[0040]4、最适反应pH为8。
[0041]5、不同金属离子MomL活性的影响:金属离子Cu2+，Fe2+能抑制MomL的活性，而Mg2+和Co2+能够促进MomL的活性。MomL对Mg2+的亲和性很高，对Co2+的亲和性非常低，但是MomL结合上Zn2+或Mg2+后对其活性仅有部分提高，而推测Be2+能促进MomL的活性的重要性可能更大。
[0042]6、重组MomL对致病菌毒力因子分泌的影响
[0043]重组MomL的酶活IU表示在Imin内降解I μ mo I的C6-HSL所需的酶量。
[0044](I)检测不同浓度的重组蛋白(5，0.5，0.05U πι-1)对铜绿假单胞菌PAOl胞外蛋白酶的活性的影响。蛋白酶活性的测定参照Hentzer的方法。各个样品于28°C静置培养24h后，0D590测细菌生长情况。13000g4°C离心10min，取上清各100 μ I与底物偶氮酪蛋白(5mg ι?-1，溶于50mM的Tris-HCl中，pH为8.0)混合后37°C孵育2h。加入200 μ I浓度为10%的三氯乙酸溶液终止反应，静置l-2min后13000g离心5min，取出上清100 μ I并加入100 μ I浓度为525mM的氢氧化钠溶液。混匀后取出200 μ I置于96孔板中，测量0D415，按公式0D415/(0D590*100y I)计算各样品的蛋白酶活性。各组阴性对照为不加入重组MomL的各菌株的胞外蛋白酶活性。按各组阴性对照组的活性为100%计算相对胞外蛋白酶活性。每个实验组设置三个平行。发现加入三种浓度的重组MomL蛋白能使铜绿假单胞菌的胞外蛋白酶下降36% -57%。
[0045](2)检测不同浓度的重组MomL对紫色色杆菌的紫色杆菌素合成的影响。具体方法参照Blosser的方法。各样品于28°C静置培养24h后，0D660测量细菌生长情况。取出200 μ I的培养液，加入200 μ I的10%的SDSdi^m 5s，静置5min，加入500 μ I的正丁醇，涡旋5s萃取紫色杆菌素，13000离心2min。取上层正丁醇溶液，测量0D590，以公式0D590/(0D660*200ul)计算各样品的紫色杆菌素的量。阴性对照为不加入重组MomL的所表达紫色杆菌素的量。以阴性对照组为100%计算各组相对紫色杆菌素的量。每个实验组设置三个平行。发现入5U πι 1的MomL能使紫色色杆菌的紫色杆菌素降低85%。
[0046](3)检测不同浓度的重组MomL对铜绿假单胞菌PAOl的绿脓菌素的合成抑制效果。具体方法参照Essar的方法。用PB (Pseudoomonas Broth)培养基培养菌株PAOl (20g蛋白胨，1.4g MgCl2, IOg K2S04, IOml甘油，IL的蒸馏水)。各实验组培养基总体积为5ml，加入不同浓度的MomL，摇床170rpm，28°C培养24h后，取出Iml的培养液加入800 μ I氯仿进行萃取，13000g离心2min后,从下层氯仿层取出500 μ I加入1.5ml的200mM的盐酸混匀，离心取出上层溶液稀释2倍，测0D520。以阴性对照为100%计算相对绿脓菌素的产量。每个实验组设置三个平行。发现加入5、0.5和0.05U ml—1的MomL能使铜绿假单胞菌的绿脓菌素分别下降88%、72%和62%左右。
[0047]上述结果说明MomL能有效降低部分致病菌毒力因子的分泌。
[0048]六、MomL是 一种新型的海洋AHL内酯酶
[0049]M om L具有 信号肽序列，是目前金属-β -内酰胺酶家族中唯--个分泌到胞外的
AHL内酯酶。在已鉴定的AHL内酯酶中，MomL与AiiA的氨基酸序列相似度最高(一致性为28.85% )，而对 C6-HSL 的降解效率是 AiiA(BaciIIus sp.240B1)的 10 倍左右。AiiA 蛋白结合的金属离子为Zn2+,这与MomL不同。从上述结果可知MomL —种新型的海洋AHL内酯酶，其高效的AHL降解活性表明其具有进一步应用开发的价值。
【权利要求】
1.一种耐油具柄菌，其特征在于，所述的耐油具柄菌的保藏编号为CGMCCN0.8972。
2.如权利要求1所述的耐油具柄菌，其特征在于所述的耐油具柄菌的培养温度为范围是15-40°C，最佳培养温度为25-30°C ;生长pH值范围为5.2 - 9.4，最适生长pH为6.8-7.7。
3.权利要求1所述的耐油具柄菌在制备用于淬灭水产养殖病原菌的菌制剂中的应用。
4.一种菌制剂，其特征在于，所述的菌制剂中包含有权利要求1所述的耐油具柄菌的活菌。
5.如权利要求4所述的菌制剂，其特征在于，所述的菌制剂为饲料添加剂或养殖水体添加剂。
6.一种MomL蛋白，其特征在于，所述的蛋白包括有: 1)氨基酸序列为SEQID NO:1的蛋白； 2)将I)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有I)中蛋白活性的，由I)所衍生的蛋白。
7.一种核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸编码权利要求6所述的MomL蛋白。
8.如权利要求7所述的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸序列为SEQID N0:2。
9.权利要求6所述的MomL蛋白在制备水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK103981140SQ201410252837
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】张晓华, 汤开浩, 史晓翀, 苏颖, 张蕴慧 申请人:中国海洋大学
【专利摘要】本发明提供一种耐油具柄菌，即一种能抑制致病菌毒力因子分泌的密度感应淬灭菌株，该耐油具柄菌(Muricauda?olearia)LMM001菌株保藏号为CGMCC?No.8972。本发明还提供供从LMM001菌株中分离的AHL降解酶MomL蛋白，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1。本发明的耐油具柄菌LMM001菌株，可通过小分子QS阻抑物、AHL内酯酶MomL和AHL酰基转移酶等多种方式阻断致病菌的QS通路，降低致病菌毒力因子的分泌；菌株LMM001对斑马鱼没有毒副作用；菌株LMM001能提高斑马鱼对嗜水气单胞菌侵染的抵抗力；AHL内酯酶能大大降低铜绿假单胞菌胞外蛋白酶和绿脓菌素等毒力因子的分泌，能降低紫色色杆菌紫色杆菌素的合成。
【专利说明】一种耐油具柄菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于有益菌筛选【技术领域】，具体涉及一种耐油具柄菌及其应用。
【背景技术】
[0002]目前，抗生素是公认的治疗细菌性疾病的有效方法，传统的抗生素主要通过抑制细胞壁的合成、DNA的复制、RNA的转录以及蛋白质的合成等一些微生物所必需物质的合成或代谢途径，杀死细菌或抑制细菌的繁殖，从而实现对细菌性疾病的治疗目的。这种“生”或“死“的选择性压力，使随机突变产生的抗生素抗性基因得以保留，从而导致抗生素抗性突变的细菌迅速成为微生物群落中的优势种群，进而导致细菌抗药性的产生。而抗生素的滥用进一步加快了细菌抗药性的出现。与此同时新型抗生素的研发速度已经大大降低，往往新型抗生素推广到市场后的几年内就会有相应的抗性细菌出现。这样的现状促使人们开发一种不同于传统抗生素作用机制的新型细菌性疾病治疗手段。其中一种具开发前景的方法被称为抗毒力治疗(antivirulence therapy),该方法是以细菌的毒力因子本身(毒力因子的表达、功能及运输以及细菌的粘附作用等)为靶位，而不是上述微生物所必需的物质合成或代谢途径，因此从理论上来说能够大大降低其使用过程中对细菌产生的选择性压力从而有效降低产生细菌抗药性的几率。
[0003]密度感应(quorum sensing, QS)在1994被首次提出，用来描述夏威夷鱿鱼发光器官中的费氏弧菌(Vibrio fischeri)通过分泌和识别化学信号分子(autoinducers, AIs)来检测种群密度，从而在群体水平上协调其荧光素酶基因(luxABCDE)表达的现象。目前已经报道的信号分 子主要有革兰氏阴性菌的N-酰基高丝氨酸内酯分子(N-acylhomoserine lactone, AHL)、革兰氏阳性菌的寡妝分子(autoinducing peptide, AIP)以及在革兰氏阴性和阳性菌中普遍存在的A1-2分子。研究发现,铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、弧菌属(Vibrio)和伯克氏菌属(Burkholderia)等多种致病菌中致病因子的分泌和AHL类QS密切相关。另外，生物被膜(biofilm)在致病菌的宿主防御机制以及抗生素的抗药性中起关键作用，它的形成也受QS的调控作用。由于QS系统不是微生物生存所必需的，因此淬灭密度感应(quorumquenching, QQ)可以在不杀死细菌的情况下大大地降低其毒力的表达，同时大大降低环境中的选择压力以及出现细菌抗药性的几率，因此密度感应淬灭技术是极具开发前景的一种抗毒力治疗手段。
[0004]目前发现的AHL类的QS系统的密度感应淬灭活性物质主要有信号分子降解酶和QS阻抑小分子物质。小分子阻抑物主要有呋喃酮、肉桂醛及其衍生物和信号分子类似物。动物模型侵染实验表明呋喃酮和肉桂醛等小分子阻抑物能够大大降低哈维氏弧菌和铜绿假单胞菌等致病菌的致病性。目前在很多种细菌中发现了信号分子降解酶，根据降解机制的不同可分为三类=AHL内酯酶(内酯环水解作用)，AHL酰基转移酶(氨基水解作用)以及AHL氧化还原酶(氧化还原作用)。AHL降解酶尤其是AHL内酯酶对不同长度酰基链的信号分子(C4-C12)均具有高效的降解活性。动物实验表明，在毕赤酵母表达系统中过量表达的AHL内酯酶(AiiA)和嗜水气单胞菌混合注射鲤鱼能大大降低鲤鱼的致死率。AHL降解菌株的富集培养液能提高卤虫和大菱鲆的成活率以及增强罗氏沼虾对哈维氏弧菌的抵抗力。因此在防治海水养殖病害方面，密度感应淬灭菌株具有很广阔的发展前景。
[0005]目前发现的密度感应淬灭菌大多是来源于陆地，而已发现的25个种海洋细菌中只有边山假交替单胞菌(Pseudoalteromonas byunsanensis) 1A01261的QQ酶获得了鉴定。陆地来源的菌株可能会因为不适应海水环境而不宜作为海水养殖的有益菌，因此从海洋或水产养殖动物环境中分离的土著QQ菌株，对密度感应淬灭技术在水产养殖上的应用尤为重要。不仅如此，许多哺乳动物及人类致病菌的毒力也受到QS调控，因此新型高活性的QQ酶具有广阔的药物开发前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种耐油具柄菌及其应用，即一种能抑制致病菌毒力因子分泌的密度感应淬灭菌株，从而弥补现有技术的不足。
[0007]本发明的耐油具柄菌(Muricauda olearia)LMMOOl菌株，已于2014年3月28日保藏在位于北京朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8972。
[0008]耐油具柄菌LMMOOl的培养温度为范围是15_40°C，最佳培养温度为25_30°C;生长pH值范围为5.2-9.4，最 适生长pH为6.8-7.7。
[0009]本发明的菌株可用于制成用于淬灭水产养殖病原菌的密度感应系统，降低其毒力因子的分泌的菌制剂。
[0010]上述菌制剂中包含有耐油具柄菌LMMOOl菌株的活菌。
[0011 ] 上述的菌制剂为饲料添加剂或养殖水体添加剂。
[0012]本发明还提供从LMM001菌株中分离的AHL降解酶MomL蛋白，其中MomL降解酶包括有:
[0013]I)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的MomL蛋白；
[0014]2)将I)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有I)中蛋白的AHL降解活性的，由I)所衍生的蛋白。
[0015]本发明还提供用于编码MomL蛋白的核苷酸；其中编码MomL的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2o
[0016]所述的AHL降解酶MomL蛋白用作水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂。
[0017]本发明的耐油具柄菌LMMOOl菌株，可通过小分子QS阻抑物、AHL内酯酶MomL和AHL酰基转移酶等多种方式阻断致病菌的QS通路，降低致病菌毒力因子的分泌；菌株LMMOOl对斑马鱼没有毒副作用；菌株LMMOOl能提高斑马鱼对嗜水气单胞菌侵染的抵抗力；AHL内酯酶能大大降低铜绿假单胞菌胞外蛋白酶和绿脓菌素等毒力因子的分泌，能降低紫色色杆菌紫色杆菌素的合成。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1:MomL的C6-HSL降解活性图。【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明的菌株进行详细的描述。
[0020] 一、耐油具柄菌LMM001菌株的分离
[0021]2011年3月份将取自养殖场的健康牙鲆的体表粘液涂布海洋细菌培养基2216E平板上，28°C培养2d之后发现黄色菌落细菌，挑取单菌落进行继代培养，直至得到纯化的菌株，并通过对AHL降解活性效率的筛选得到目的菌株，命名为LMM001。
[0022]通过16s rRNA基因比对分析确定本发明菌株LMM001为耐油具柄菌(Muricaudaolearia)。
[0023]二、耐油具柄菌LMM001菌株的AHL降解活性的检测
[0024]先接种LMM001于海水2216E培养基中，于摇床170rpm、28°C培养24h。在培养获得的菌液中加入不同碳链长度的AHL分子(C6-C14-HSL)后在28°C反应24h。离心取上清用AHL报告菌报告菌根癌农杆菌A136 (pCF218) (pCF372)、紫色色杆菌CV026和VIR24检测剩余的AHL分子，发现菌株LMM001能在Ih内将加入的终浓度为10 μ M的所有碳链长度的AHL分子降解。
[0025]三、耐油具柄菌LMM001对斑马鱼的保护作用
[0026]将菌株LMM001按注射量3.60 X IO7Cfu/尾腹腔注射斑马鱼，每个实验组设置三个平行，每个平行实验组10尾斑马鱼，20天后没有发现斑马鱼死亡，说明其对斑马鱼无毒副作用。另外设置三个平行实验组，每个平行实验组10尾，在水体中加入菌株LMM001至终浓度约为IXlO6Cfu πιl-1，每天按换水量补加菌株Th20的菌悬液，一个星期后，加入嗜水气单胞菌AHKl至终浓度为I X IO7Cfu πιL-1，每天按换水量补加菌株LMM001菌悬液和AHKl菌悬液，对照组不加LMM001菌悬液，观察记录斑马鱼的死亡情况。发现对照组在嗜水气单胞菌的侵染下只有大约20%的成活率，而加入菌株LMM001的实验组的斑马鱼成活率为60%，说明菌株LMM001能提高斑马鱼抗嗜水气单胞菌侵染的能力。
[0027]三、本发明AHL降解酶MomL的鉴定
[0028]采用Illumina高通量测序技术对LMM001的全基因组进行了测序及分析,经RAST服务器进行基因注释后也测到可能具有AHL降解活性的蛋白。采用大肠杆菌表达系统构建BL21 (DE3) -pTWINl-MomL表达菌株，发现重组MomL蛋白能降解C4-C14-HSL分子，这说明这MomL是AHL降解酶。用AHL报告菌CV026检测MomL的C6-HSL降解活性(见图1)，0.078U的MomL能形成明显的抑制圈(报告菌CV026检测到C6-HSL时显紫色)。
[0029]四、MomL的AHL降解机制
[0030]AHL内酯酶的作用机制是水解AHL分子的内酯环，开环的AHL在酸性条件下(pH2)能够重新闭环恢复AHL分子活性，而AHL酰基转移酶的对AHL的降解机制不同，因此可以用酸化实验初步检测AHL降解活性是否为内酯酶活性。
[0031]AHL内酯酶活性的初步检测采用酸化法:向表达出来的MomL中加入终浓度为10 μ M的C6-HSL，28V反应24h后，反应液经4°C，13000g离心10min收集上清液，收集的上清沸水浴处理5min，加入适量的过滤除菌的盐酸1M)至pH2左右，于28°C孵育24h，用AHL报告菌CV026和VIR24检测AHL恢复情况。
[0032]酸化试验发现被MomL降解的C6-HSL能获得恢复，说明MomL是AHL内酯酶。为了进一步验证MomL对AHL的降解机制，利用HPLC-MS检测确定其对C6-HSL以及C12-HSL的降解产物。MomL的C6-HSL降解产物分子量主要是为218。C6-HSL的分子式为CltlH17NO3，理论分子量为199.25，被AHL内酯酶水解后的产物是C6-HS，分子式为CltlH19NO4，理论分子量为217.25，这与结果中分子量为218的化合物相近，因此MomL降解C6-HSL的产物是C6-HS，因此MomL是AHL内酯酶。
[0033]五、MomL的酶学性质
[0034]AHL分子被内酯酶水解后会产生一个质子(H+，水解后的羧基电解产生)，而累计产生的质子可使PH发生变化，当在具有弱缓冲能力的反应体系中加入pH指示剂时就可以通过检测吸光度的变化来反应AHL内酯酶活性，该方法叫做pH指示的连续分光光度分析法。该方法关键在于选择合适的pH指示剂和缓冲溶液组成一个缓冲体系，其中pH指示剂的PKa值与缓冲液的pKa值越接近越好。目前对AHL内酯酶的酶学动力学参数主要采用苯酚红和HEPES系统(pKa ^ 7.9)或甲酚紫和N，N- 二羟乙基甘氨酸系统(pKa ^ 8.4)，但是由于系统自身的PKa值设定过高，可能会促进AHL的化学水解。本论文采用溴麝香草酚蓝(Bromothymol Blue,简称 BTB, pKa = 7.1)和 M0PS(pKa = 7.2)系统，两者的 pKa 相差不大并且接近中性，该系统已经被广泛地用于其他水解酶的酶学动力学参数的检测。
[0035]具体方法为:配制2XM0PS储存液(5mM，pH7.1) ;10XBTB储存液(ImM)。在100 μ I的反应体系中加入50 μ I MOPS储存液，10 μ I BTB储存液，加入0.156_5mM的AHL，DMS0的终浓度为1%，加入适量的待测重组MomL，加入三蒸水至100 μ 1，温度25°C，酶标仪630nm处连续检测50次(每30s检测一次)。计算每个浓度AHL的反应初速度，按照标准曲线换算。每个实验组设置三个平行。
[0036]利用上述方法检测MomL的酶学性质，发现:
[0037]1、重组 MomL 对信号分子 C4_、C6_、30C6、C8、30C8 和 30C10 的 kd/Kjs^T1)值分别为 1.6Χ105、2.9Χ105、3.I X ΙΟ5』.6X ΙΟ5、..5X IO5 和 5.1XlO50
[0038]2、MomL的最适反应温度为40°C。
[0039]3、MomL的温度稳定性:60度处理30min后保持32%的C6-HSL降解活性。
[0040]4、最适反应pH为8。
[0041]5、不同金属离子MomL活性的影响:金属离子Cu2+，Fe2+能抑制MomL的活性，而Mg2+和Co2+能够促进MomL的活性。MomL对Mg2+的亲和性很高，对Co2+的亲和性非常低，但是MomL结合上Zn2+或Mg2+后对其活性仅有部分提高，而推测Be2+能促进MomL的活性的重要性可能更大。
[0042]6、重组MomL对致病菌毒力因子分泌的影响
[0043]重组MomL的酶活IU表示在Imin内降解I μ mo I的C6-HSL所需的酶量。
[0044](I)检测不同浓度的重组蛋白(5，0.5，0.05U πι-1)对铜绿假单胞菌PAOl胞外蛋白酶的活性的影响。蛋白酶活性的测定参照Hentzer的方法。各个样品于28°C静置培养24h后，0D590测细菌生长情况。13000g4°C离心10min，取上清各100 μ I与底物偶氮酪蛋白(5mg ι?-1，溶于50mM的Tris-HCl中，pH为8.0)混合后37°C孵育2h。加入200 μ I浓度为10%的三氯乙酸溶液终止反应，静置l-2min后13000g离心5min，取出上清100 μ I并加入100 μ I浓度为525mM的氢氧化钠溶液。混匀后取出200 μ I置于96孔板中，测量0D415，按公式0D415/(0D590*100y I)计算各样品的蛋白酶活性。各组阴性对照为不加入重组MomL的各菌株的胞外蛋白酶活性。按各组阴性对照组的活性为100%计算相对胞外蛋白酶活性。每个实验组设置三个平行。发现加入三种浓度的重组MomL蛋白能使铜绿假单胞菌的胞外蛋白酶下降36% -57%。
[0045](2)检测不同浓度的重组MomL对紫色色杆菌的紫色杆菌素合成的影响。具体方法参照Blosser的方法。各样品于28°C静置培养24h后，0D660测量细菌生长情况。取出200 μ I的培养液，加入200 μ I的10%的SDSdi^m 5s，静置5min，加入500 μ I的正丁醇，涡旋5s萃取紫色杆菌素，13000离心2min。取上层正丁醇溶液，测量0D590，以公式0D590/(0D660*200ul)计算各样品的紫色杆菌素的量。阴性对照为不加入重组MomL的所表达紫色杆菌素的量。以阴性对照组为100%计算各组相对紫色杆菌素的量。每个实验组设置三个平行。发现入5U πι 1的MomL能使紫色色杆菌的紫色杆菌素降低85%。
[0046](3)检测不同浓度的重组MomL对铜绿假单胞菌PAOl的绿脓菌素的合成抑制效果。具体方法参照Essar的方法。用PB (Pseudoomonas Broth)培养基培养菌株PAOl (20g蛋白胨，1.4g MgCl2, IOg K2S04, IOml甘油，IL的蒸馏水)。各实验组培养基总体积为5ml，加入不同浓度的MomL，摇床170rpm，28°C培养24h后，取出Iml的培养液加入800 μ I氯仿进行萃取，13000g离心2min后,从下层氯仿层取出500 μ I加入1.5ml的200mM的盐酸混匀，离心取出上层溶液稀释2倍，测0D520。以阴性对照为100%计算相对绿脓菌素的产量。每个实验组设置三个平行。发现加入5、0.5和0.05U ml—1的MomL能使铜绿假单胞菌的绿脓菌素分别下降88%、72%和62%左右。
[0047]上述结果说明MomL能有效降低部分致病菌毒力因子的分泌。
[0048]六、MomL是 一种新型的海洋AHL内酯酶
[0049]M om L具有 信号肽序列，是目前金属-β -内酰胺酶家族中唯--个分泌到胞外的
AHL内酯酶。在已鉴定的AHL内酯酶中，MomL与AiiA的氨基酸序列相似度最高(一致性为28.85% )，而对 C6-HSL 的降解效率是 AiiA(BaciIIus sp.240B1)的 10 倍左右。AiiA 蛋白结合的金属离子为Zn2+,这与MomL不同。从上述结果可知MomL —种新型的海洋AHL内酯酶，其高效的AHL降解活性表明其具有进一步应用开发的价值。
【权利要求】
1.一种耐油具柄菌，其特征在于，所述的耐油具柄菌的保藏编号为CGMCCN0.8972。
2.如权利要求1所述的耐油具柄菌，其特征在于所述的耐油具柄菌的培养温度为范围是15-40°C，最佳培养温度为25-30°C ;生长pH值范围为5.2 - 9.4，最适生长pH为6.8-7.7。
3.权利要求1所述的耐油具柄菌在制备用于淬灭水产养殖病原菌的菌制剂中的应用。
4.一种菌制剂，其特征在于，所述的菌制剂中包含有权利要求1所述的耐油具柄菌的活菌。
5.如权利要求4所述的菌制剂，其特征在于，所述的菌制剂为饲料添加剂或养殖水体添加剂。
6.一种MomL蛋白，其特征在于，所述的蛋白包括有: 1)氨基酸序列为SEQID NO:1的蛋白； 2)将I)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有I)中蛋白活性的，由I)所衍生的蛋白。
7.一种核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸编码权利要求6所述的MomL蛋白。
8.如权利要求7所述的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸序列为SEQID N0:2。
9.权利要求6所述的MomL蛋白在制备水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK103981140SQ201410252837
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】张晓华, 汤开浩, 史晓翀, 苏颖, 张蕴慧 申请人:中国海洋大学
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