利用药物松胞素b检测淋巴细胞增殖的方法

xiaoxiao2020-6-24  6

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利用药物松胞素b检测淋巴细胞增殖的方法
【专利摘要】本发明属于生物检测【技术领域】,具体为一种利用药物松胞素B检测淋巴细胞增殖的方法。本发明依据的原理:药物松胞素B可以阻滞细胞的分裂而不阻滞细胞核的分裂,从而使发生增殖反应的细胞经松胞素B处理后形成直观的双核细胞;外周血淋巴细胞在植物血凝素的刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖,而电离辐射可以抑制淋巴细胞的增殖。以2Gyγ射线照射人外周血,并以PHA刺激后再加入松胞素B处理,检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异。经PHA刺激后的淋巴细胞会形成双核细胞,而受照射淋巴细胞的双核率显著下降,表明利用松胞素B检测淋巴细胞双核率可以很好地反映淋巴细胞的增殖水平。本发明方法检测指标直观、操作简单、快速、经济、结果准确。
【专利说明】利用药物松胞素B检测淋巴细胞增殖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】,具体涉及一种检测淋巴细胞增殖的方法。
【背景技术】
[0002]淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段,因此,检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法,是各医学专业学生,特别是检验专业学生必做的实验项目。临床上主要用于检测各种药物对免疫功能的影响以及用于肿瘤、迟发性变态反应、细胞免疫缺陷等可能有细胞免疫参与的疾病诊断。
[0003]淋巴细胞的增殖活化过程会发生许多复杂的生化反应,这些反应包括与膜相关联的早期现象,例如磷脂合成的增加、二价阳离子通透性增加、腺嘌呤环化酶的活化作用和胞内cAMP的同时增加;紧随之后的是膜表面CD分子的改变、细胞内RNA及DNA合成的增加,最终导致淋巴细胞形态学发生特征性改变和增值分裂,这些生化反应是淋巴细胞增殖实验的基本原理。目前淋巴细胞增殖检测的方法很多,常用的有:基于淋巴细胞增殖反应过程中DNA合成增加特点,通过氚标记的胸苷(3H-dT)掺入率来测定淋巴细胞的增殖水平。根据淋巴细胞转化为淋巴母细胞的形态学改变特点而提出的淋巴细胞转化试验,通过检测淋巴细胞的转化率来测定淋巴细胞的增殖水平。随着分子生物学的发展,越来越多的分子指标作为淋巴细胞增殖的标识,例如把多种淋巴细胞膜表面CD分子作为淋巴细胞增殖的标志物,通过流式细胞仪来检测淋巴细胞膜表面CD分子表达变化情况来测定淋巴细胞的增殖水平。 [0004]目前DNA合成最准确的检测方法是使用氚标记的胸苷(3H_dT),在DNA合成过程中3H-dT其掺入量可由液相闪烁仪来检测,通过该掺入量来计算DNA合成能力并间接反映淋巴细胞的增殖水平。由于使用了放射性物质,此方法对实验室要求很高,并且可能会对环境和工作场所造成放射性污染。同时,此方法是通过放射性计数来反映细胞免疫功能的,实验组和对照组的细胞数必须保证绝对相同,否则实验结果就不具有可信性。这两方面的缺点限制了此法的广泛应用。
[0005]淋巴细胞转化是通过对培养物中存在的淋巴母细胞百分比来评估的。转化淋巴细胞即淋巴母细胞的形态特征是:(I)转化淋巴母细胞体积增大,约大于原淋巴细胞3倍;(2)细胞核的核膜清晰,核内染色质疏松呈网状结构,可见I~3个核仁,有的核呈分裂相;(3)胞浆丰富,呈嗜碱性染色,核周围的胞浆有一染色较浅的透明区,为伪足状突起,胞浆内有小空泡出现。该方法的主要优点是从形态学判断转化淋巴细胞,但因其极端变异性和结果的主观性而得不到广泛利用。
[0006]通过流式细胞仪来检测淋巴细胞膜表面CD分子表达变化情况来测定淋巴细胞的增殖水平。该方法能够检测不同亚群细胞对多克隆或特异性刺激物的反应性,具有自动化程度高,高通量的优点,是当前最常见的淋巴细胞增殖检测方法,但流式细胞仪和各种CD分子抗体价格昂贵。
[0007]由于上述常规方法本身的缺陷,实际应用中会碰到一系列的问题;另外,由于其复杂性和精确性,这些常规方法绝对不适用于临床,只能限于实验室研究。

【发明内容】

[0008]本发明的目的在于提供一种简便、经济、用途广,且适合于临床使用的检测淋巴细胞增殖的方法。
[0009]依据原理:生理情况下静止淋巴细胞暴露于促细胞分裂剂植物凝集素(PHA)可以转化为淋巴母细胞并可进一步分裂增殖,淋巴细胞的增殖活化能力与机体的细胞免疫有关;而松胞素B可以阻滞细胞的分裂而不阻滞细胞核的分裂。具有不同增殖能力的淋巴细胞经过PHA和松胞素B的双重作用后的双核细胞率会不同,增殖能力越强的淋巴细胞的双核细胞率越高。因此,可通过淋巴细胞的双核率直观地反映淋巴细胞的增殖水平。
[0010]本发明提供的检测淋巴细胞增殖的方法,具体步骤如下:
1、取若干份健康人外周血,每份血分成照射组(即增殖抑制组)和非照射组;
2、血样用含PHA营养液培养:无菌操作将0.2-0.6ml血样加入含有PHA营养液小瓶内,PHA终浓度为30-70 μ g/ml,混匀后,置于温箱中培养1_2天;
3、加入松胞素B继续培养:在含PHA营养液中培养结束后,向培养液内加入松胞素B,终浓度为2-6 μ g/ ml,温箱中继续培养24-36h ;
4、溶解红细胞:培养结束后,吸弃上清液,加入预温的质量浓度为0.87% NH4Cl溶液
3-5ml,置于温箱中孵育10-15min ;
5、低渗处理:离心弃上清后每管细胞加入5-10ml0.075M KCl混匀,室温低渗10_20min ;
6、固定液固定:采用两步固定法,低渗后加入固定液固定液(固定液:低渗液=1:5-8),滴管混匀后立即离心,弃上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ;所述固定液为甲醇和冰醋酸的混和液,两者质量比为甲醇:冰醋酸=7-9:1 ;
7、检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异,双核率=双核细胞数/N,N为观察淋巴细胞个数,N—般取500—1000。
[0011]上述步骤中,所述温箱温度为36°C -40°c,优选37°C ;预温温度为36°C _40°C,优选 37。。。
[0012]依据本发明采用松胞素B对淋巴细胞进行增殖检测的新方法,可以克服传统方法遇到的问题。该方法的主要优点有:
1、增殖的淋巴细胞可形成双核细胞,形态学观察,更加直观且客观(见附图);
2、检测指标为形态学观察,所以属于金标准(见附图);
3、实验成本很低;
4、操作简单,设备要求低,所有实验室都可以开展;
5、不使用放射性物质,不会对环境和工作场所造成污染;
6、全血培养物,结果不受细胞数影响;
7、结果准确,重复性好。
[0013]本发明是一种淋巴细胞增殖检测的新方法,是检测细胞免疫功能的体外试验方法之一,可应用于肿瘤、迟发性变态反应、细胞免疫缺陷、器官移植、以及某些细胞免疫性疾病的辅助诊断;另外,该技术也可用于药物或毒物的免疫毒理学研究,如检测药物或毒物对淋巴细胞的影响、估算药物或毒物剂量的大小等。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1为不同处理情况下淋巴细胞的形态学特点(*400倍)。其中:(1)显示血样在没有植物凝集素(PHA)和松胞素B (CB)处理的情况下,血液淋巴细胞的形态学特点;(2)显示血样在有PHA而没有CB处理的情况下,血液淋巴细胞的形态学特点,体积增大、胞浆丰富的细胞为增殖转化的淋巴细胞;(3)显示血样在PHA和CB共同处理的情况下,血液淋巴细胞的形态学特点,形成明显双核的细胞为增殖转化的淋巴细胞;(4)显示以2Gy Y射线照射(增殖抑制)血样后,在PHA和CB共同处理的情况下,血液淋巴细胞的形态学特点,形成明显双核的细胞为增殖转化的淋巴细胞。
【具体实施方式】
[0015](一)材料
1、植物血凝素(sigma公司),松胞素B (Sigma公司)。
[0016]2、培养液为RPMI1640 (PAA),含10%小牛血清(四季青),1%双抗(基诺)。
[0017]3、肝素抗凝管。
[0018]4、生理盐水、087% NH4Cl 溶液、Giemsa 染液。
[0019](二)操作方法
1.无菌采血,每份0.5ml,分成2Gy照射组(增殖抑制组)和非照射组,将其分别注入
4.5ml含有PHA的RPMI1640培养液内,PHA终浓度为50 μ g/ml,混匀后,置37°C温箱培养2天。
[0020]2、第3天向培养液内加入松胞素B,终浓度为3 μ g/ml,细胞继续培养24h。
[0021]3、溶解红细胞:第4天吸弃上清液,加入37°C预温的0.87% NH4Cl溶液3ml,置37°C温箱孵育15min,然后加生理盐水7ml。
[0022]4、300g离心10min,弃去上清液,每管细胞加入7ml 0.075M KCl混匀,室温低渗15min。
[0023]5、加入1ml固定液(质量比为甲醇:冰醋酸9:1)预固定细胞。
[0024]6、300g离心10min,除去低渗液,每管加入5ml固定液固定30min。
[0025]7、300g离心10min,保留约0.5ml固定液,滴片,干燥。
[0026]8、用Giemsa染液染色30min,40倍显微镜观察500个淋巴细胞,双核率=双核细胞数/500。
[0027]结果:取10份健康人外周血,每份血分成2Gy照射组(增殖抑制组)和非照射组,检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异。结果显示,经PHA刺激而增殖转化后的淋巴细胞形成了明显的双核细胞,非照射组的双核率为51.7%±4.3%,照射组的双核率为29.4%±5.6%,照射后淋巴细胞的双核率下降了 22.3%(P〈0.001),表明照射后淋巴细胞的增殖明显受到抑制,表明淋巴细胞的双核率可以很好的反映淋巴细胞的增殖水平。见图1所
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[0028]该新方法检测指标直观、操作简单、快速、经济、结果准确。
【权利要求】
1.一种利用药物松胞素B检测淋巴细胞增殖的方法,其特征在于具体步骤为: (1)取若干份健康人外周血,每份血分成照射组即增殖抑制组和非照射组; (2)血样用含PHA营养液培养:无菌操作将0.2-0.6ml血样加入含有PHA营养液小瓶内,PHA终浓度为30-70 μ g/ml,混匀后,置于温箱中培养1_2天; (3)加入松胞素B继续培养:在含PHA营养液中培养结束后,向培养液内加入松胞素B,终浓度为2-6 μ g/ml,温箱中继续培养24-36h ; (4)溶解红细胞:培养结束后,吸弃上清液,加入预温的质量浓度为0.87% NH4Cl溶液3-5ml,置于温箱中孵育10-15min ; (5)低渗处理:离心弃上清后每管细胞加入5-10ml0.075M KCl混匀,室温低渗10_20min ; (6)固定液固定:采用两步固定法,低渗后加入固定液固定,按体积比,固定液:低渗液=1:5-8,滴管混匀后立即离心,弃上清每管加入5-8ml固定液固定20_30min ;所述固定液为甲醇和冰醋酸的混和液,两者质量比为甲醇:冰醋酸=7-9:1 ; (7)检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异,双核率=双核细胞数/N,N为观察淋巴细胞个数,N取500—1000 ; 上述步骤中,所述温箱温度为36°C _40°C,所述预温温度为36°C _40°C。
【文档编号】C12Q1/02GK104017876SQ201410253026
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】袁德晓, 邵春林, 张江虹, 潘燕, 白杨 申请人:复旦大学

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