射干总异黄酮或异黄酮类化合物在制备防治妇女病的药物或食品中的应用的制作方法

专利名称：：射干总异黄酮或异黄酮类化合物在制备防治妇女病的药物或食品中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是中药射干Belamcandachinensis(L.)DC.中的总异黄酮或12个异黄酮类化合物单体鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、野鸢尾苷、去甲基次野鸢尾黄素、5，6，7，3'-四羟基-4'-甲氧基异黄酮、5，7_二羟基_6，3'，4',5'-四甲氧基异黄酮、5，7，3'-三羟基_8，4',5'-三甲氧基异黄酮、5，7，4'-三羟基-6，3'，5'-三甲氧基异黄酮、鸢尾苷元-4'-葡萄糖苷、5，3'，5'-三甲氧基-6，7-亚甲二氧基异黄酮-4'-0-^-D-葡萄糖用于制备防治妇女雌激素水平低下、减缓子宫及卵巢衰退或防治更年期综合征的药物或食品的用途。
背景技术：
：射干是鸢尾科射干属植物射干Belamcandachinensis(L.)DC.的干燥根茎。已报道的射干含有的异黄酮类化合物主要为鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、野鸢尾苷、去甲基次野鸢尾黄素、5，6，7，3'-四羟基-4'-甲氧基异黄酮、5，7_二羟基-6，3',4',5'-四甲氧基异黄酮、5，7，3'-三羟基_8，4',5'-三甲氧基异黄酮、5，7，4'-三羟基_6，3'，5'-三甲氧基异黄酮、鸢尾苷元-4'-葡萄糖苷、5，3'，5'-三甲氧基-6，7-亚甲二氧基异黄酮-4'-O-0-D-葡萄糖等[JinLi，ChenHai-Shengetal.NewflavoneandisoflavoneglycosidefromBelamcandachinensis,ChineseChemicalLetters2007,18:158_160；JinLi,ChenHai-sheng,JinYong-Sheng,LiangShuang,LiuJian—GuoChemicalconstituentsfromBelamcandachinensisJournalofAsianNaturalProductsResearch2008,10(1):89_91；胡小兰，徐谥，黄天霞等，射干中化学成分的分离与鉴定，中药通报，1982，7(1):2930;吉文亮，秦民坚，王峥涛.射干的化学成分研究(I)，中国药科大学学报，2001，32(3):197199;余亚纲，汪聪慧，刘岱等，B.Chinensis根茎中亲脂性组分的研究，药学学报，1983，18(12):969972；YamakiM，etal.,PlantaMed.,1990,56(3)335；HydeyukiIto,SatomiOnoue,etal.,IsoflavonoidsfromBelamcandachinensis,Chem.Pharm.Bull,2001,49(9):12291231；周立新，林茂，赫兰峰，射干的化学成分研究(I)，中草药，1996，27(1)810；秦民坚，吉文亮，王峥涛，射干的化学成分研究(II)，中草药，2004，35(5):487489；WonSickWoo,EunHeeWoo,AnIsoflavoneNoririsflorentinfromBelamcandachinensis,Phytochemistry,1993,33(4):939940；周立新等，中国化学快报，1997，8(2):133]。它们的化学结构通式为其中，队为OH或0CH3；R2为0CH3、0H或H；R3为OH或Oglu；R4为OCH3或H；R5为OCH3、OH或H；R6为OCH3、OH或Oglu；&为0013或11;各化合物的基团搭配见表1。表112个异黄酮类化合物的基团搭配<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>至今未见射干总异黄酮或上述12个异黄酮类化合物具有防治妇女雌激素低下或更年期综合症功能的报道。
发明内容本发明的目的是对鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、野鸢尾苷等异黄酮类化合物以及射干总异黄酮提供一种制备防治妇女雌激素低下或更年期综合征的药物或食品的用途。经动物实验，射干总异黄酮或鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾黄素、野鸢尾苷等12个异黄酮类化合物对1215月龄SD雌性自然衰老大鼠或去势大鼠能提高雌激素水平，促进卵泡生成，促进子宫、阴道上皮增生，减缓子宫及卵巢衰退，还可提高阴道上皮细胞雌激素受体的表达，因此，可用于制备防治妇女雌激素水平低下或更年期综合征的药物或食品。具体实施例方式现结合实施例，对本发明作进一步描述。实施例1.制备射干总异黄酮射干干燥药材10Kg，按常规用10倍量80%乙醇水溶液热提取三次，每次提取时间为100分钟，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，加水稀释至10倍体积后，按常规上AB-8大孔树脂柱，先以水洗脱5个柱床体积，再以90%乙醇水溶液洗脱5个柱床体积，收集该90%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩干燥，得射干总异黄酮198g，总异黄酮再用30倍量80%乙醇加热回流溶解，过滤，滤液减压浓缩至约八分之一体积，浓缩液放置过夜沉淀，过滤沉淀，干燥，得射干总异黄酮产品。经含量测定，异黄酮类成分(以鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾苷元、次野鸢尾黄素、野鸢尾苷五个主成分计)的含量大于91%。实施例2.鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾黄素、野鸢尾苷等12个异黄酮化合物的制备(详见JinLi(金_)，ChenHai-sheng(陈海生)，etal.ChemicalconstituentsfromBelamcandachinensisJournalofAsianNaturalProductsResearch2008,10(1)89-91)中药射干干燥根茎4Kg，粉碎后用80%乙醇水溶液加热回流提取3次，减压回收溶剂，得流浸膏约200g，将其分散于蒸馏水800ml中，依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯分别萃取3次(每次500ml)，分别回收溶剂后，得到石油醚萃取物22g，氯仿萃取物65g，乙酸乙酯萃取物28g。取氯仿萃取物65g，进行硅胶柱层析用梯度溶剂系统CHC13—CHC13/CH3OHH20(201)，分别得到流份CI、C2和C3。将C1部分再进行S印hadexLH20柱层析，用CHC13/CH30H(11)洗脱，收集相应流份，分别得到化合物BC-2,BC-4，BC-5，BC-6和BC-10。将C2部分再进行S印hadexLH20柱层析，用CHC13/CH30H(11)洗脱，收集相应流份，分别得到化合物BC-3，BC-8,BC-9。取乙酸乙酯萃取物28g经硅胶柱层析用梯度溶剂系统CHC13/CH30H(201—11)，得到流份E1、E2和E3。将E3部分再进行S印hadexLH20柱层析，用CHC13/CH30H(11)洗脱，收集相应流份，得到化合物BC-1，BC-7,BC-11和BC-12实施例3.化合物对自然衰老大鼠雌激素样作用试验一、实验材料(一)实验动物1215月龄SD雌性大鼠100只，均为清洁动物，由海军医学研究所动物实验中心提供，动物合格证SCXK(军)2007-011。实验前置动物于室内适应环境一周，饲养环境温度为1822°C，相对湿度为(50士20)%，自由饮水。(二)受试药物1、射干总异黄酮和4个异黄酮类化合物由实施例1制备6(1)射干总异黄酮(BC)，总异黄酮含量彡90%。(2)鸢尾苷(BC-1)(3)野鸢尾苷元(BC-2)(4)鸢尾黄素(BC-3)(5)野鸢尾苷(BC-72、阳性对照药物(1)大豆异黄酮，批号090118，邯郸麦浪生物科技有限公司。(2)更年安片，批号080701，江西天施康中药股份有限公司。3、动物的颗粒饲料每天按大鼠体重100g/kg供食，使用前将受试药物分别按给药剂量加入大鼠饲料加工成颗粒饲料，置50°C的烘箱中烘干。不同药物颗粒饲料每100g药物含量分别为1)射干总异黄酮(BC):400mg、600mg和800mg三个剂量，分别对应于低、中、高三个剂量组；2)鸢尾苷(BC-1):600mg；3)野鸢尾苷元(BC-2):600mg；4)鸢尾黄素(BC-3):600mg；5)野鸢尾苷(BC-7):600mg；6)大豆异黄酮600mg；7)更年安片600mg。(三)主要试剂血清雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)放射免疫测定试剂盒，天津九鼎医学生物工程有限公司提供；血清皮质酮酶联反应试齐[J盒，DiagnosticSystemsLaboratoriesInc公司提供；雌激素受体(ER)试剂盒，上海长岛生物技术有限公司提供。(四)实验仪器SN-697全自动双探头放射免疫、记数器，上海核所日环光电仪器有限公司；80-2型离心机，上海精密科学仪器有限公司；FA-N/FC电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司。二、实验方法(一)分组将100只1215月龄SD雌性大鼠随机分成10组，每组10只，分两笼饲养，每笼5只。1.空白对照组，每天按体重一次性喂食不加药的颗粒饲料100g/kg；2.射干总异黄酮低剂量组，每天按体重喂食低剂量BC颗粒饲料100g/kg，给药剂量为400mg/kg；3.射干总异黄酮中剂量组，每天按体重喂食中剂量BC颗粒饲料100g/kg，给药剂量为600mg/kg；4.射干总异黄酮高剂量组，每天按体重喂食高剂量BC颗粒饲料100g/kg，给药剂量为800mg/kg；5.鸢尾苷(BC-1)组，每天按体重喂食BC-1颗粒饲料100g/kg，给药剂量为600mg/kg；6.野鸢尾苷元(BC-2)组，每天按体重喂食BC-2颗粒饲料100g/kg，给药剂量为600mg/kg；7.鸢尾黄素(BC-3)组，每天按体重喂食BC-3颗粒饲料100g/kg，给药剂量为600mg/kg；8.野鸢尾苷(BC-7)组，每天按体重喂食BC-7颗粒饲料100g/kg，给药剂量为600mg/kg；9.大豆异黄酮组，每天按体重喂食大豆异黄酮颗粒饲料100g/kg，给药剂量为600mg/kg；10.更年安片组，每天按体重喂食更年安片颗粒饲料100g/kg，给药剂量为600mg/kg。(二)观察和检测将上述各组按剂量供食，每天一次，饮水自由，连续给药30天。喂养30天后，断头取血，分离血清，测血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、皮质酮含量；取子宫、卵巢、阴道、肾上腺称重，计算脏器系数，并将其固定、石蜡包埋、切片、HE染色，LeicaDMLB光学显微镜对切片进行组织形态学观察、免疫组化染色阴道上皮细胞雌激素受体的表达。1、血清性激素的测定断头取血，按常规分离血清，-20°C保存，用放免法测定血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)含量；用酶联法测定皮质酮含量；严格按各药盒说明书操作。实验数据用均数士标准差表示，采用配对t检验作给药前后统计分析，P<0.05判断为具有显著的统计学差异。结果见表1。表1各组大鼠血清E2、FSH、LH、皮质酮水平的比较这is)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注与空白对照组比较*p<0.05**p<0.01通常，妇女更年期血清E2水平下降，血清FSH水平和血清LH水平升高，血清皮质酮水平下降。由表1可见，与空白对照组相比，各给药组血清E2水平都有不同程度的提高，血清FSH水平和血清LH水平都有不同程度的下降，血清皮质酮水平不同程度有所升高，某些指标接近甚至好于阳性对照药大豆异黄酮或更年安，说明本发明所说射干总异黄酮或异黄酮类化合物可防治或改善妇女更年期综合征症状。2、脏器系数测定解剖取出子宫、卵巢、阴道、肾上腺，尽可能剔除周边的结缔组织和脂肪，精确称重，按下式计算脏器系数。脏器系数二脏器重量(g)/体重(g)X1000各组动物性器官脏器系数测定结果见表2。表2各组大鼠性器官脏器系数测定结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与空白对照组比较*p<0.05**p<0.01通常，妇女更年期子宫、阴道、卵巢细胞衰退，肾上腺功能下降。由表2可见，与空白对照组相比，各给药组子宫阴道系数、卵巢系数和肾上腺(左)系数均有不同程度的增力口，与阳性对照组接近，说明能使卵巢细胞增殖、子宫质量增加，从而可改善和防治妇女更年期综合征症状。3、病理检查及免疫组化实验将子宫、卵巢、阴道、肾上腺分别按常规用10%福尔马林固定72小时，石蜡包埋切片，切片厚约45μm，HE染色，LeicaDMLB光学显微镜观察，Olympus数码摄像机下抓拍显微照片。并进行子宫内膜的雌激素受体免疫组织化学染色，统计阳性表达结果为1)各组大鼠子宫、阴道、卵巢、肾上腺病理组织学检查从大鼠各脏器病理组织学检查结果来看，各组大鼠子宫、阴道、卵巢、肾上腺脏器和组织在显微镜下均未见有明显的异型增生、萎缩、出血、坏死及炎症等改变；卵巢内可见有不同发育程度和数量的卵泡。相比各组的病理检查，鸢尾苷(BC-I)、野鸢尾苷元(BC-2)、射干异黄酮高剂量组的子宫内膜、阴道上皮有相对明显的内膜增生现象；鸢尾苷(BC-I)、野鸢尾苷元(BC-2)、鸢尾黄素(BC-3)、野鸢尾苷(BC-7)组卵泡数量相对明显的增多，说明给药后可促进卵巢内卵泡的发育和数量，使子宫内膜、阴道上皮内膜增生，可预防和治疗妇女更年期综合征因性器官衰退引起的临床症状。2)免疫组化雌激素受体雌激素受体在各组大鼠子宫的上皮细胞均有表达，雌激素受体在鸢尾苷(BC-I)、野鸢尾苷元(BC-2)、鸢尾黄素(BC-3)组中表达较明显，与大豆异黄酮组接近，说明可使大鼠的子宫雌激素受体上调，从而改善更年期雌激素水平下降所引起的症状。实施例4.对去势大鼠雌激素样作用试验一、实验材料(一)实验动物同实施例3(二)受试药物同实施例31、阳性对照药物(1)大豆异黄酮，批号090118，邯郸麦浪生物科技有限公司。(2)更年安片，批号080701，江西天施康中药股份有限公司。(3)水合氯醛批号20080410国药集团化学试剂有限公司。2、动物的颗粒饲料及药物含量同实施例3(三)主要试剂同实施例3(四)实验仪器同实施例3二、实验方法(一)大鼠去势大鼠腹腔给予9%的水合氯醛(10ml/kg)麻醉。沿背部后正中线作1.0-1.5cm的纵行皮切口，双侧分别分离出卵巢，结扎、切除卵巢，检查无渗血，复原器官缝合完整，大腿肌肉外侧注射青霉素(2万u/kg)抗菌，连续3天，术后注意保温，自由饮水、进食，术后1-6小时大鼠均苏醒。术后第9天将大鼠随机分成10组，每组10只，分两笼饲养，每笼5只。(二)分组及给药同实施例3。(三)观察和检测将做好的含药颗粒饲料分别按每天100g/kg大鼠体重给药，饮水自由，连续给药30天。喂养30天后，断头取血，分离血清，测血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、皮质酮含量；取子宫、阴道、肾上腺称重，计算脏器系数，并将其固定、石蜡包埋、切片、HE染色，LeicaDMLB光学显微镜对切片进行组织形态学观察、免疫组化染色阴道上皮细胞雌激素受体的表达。1、血清性激素的测定断头取血，按常规分离血清，-20°C保存，用放免法测定血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)含量；用酶联法测定皮质酮含量；严格按各药盒说明书操作。实验数据用均数士标准差(X士S)表示，采用配对t检验作给药前后统计分析，P<0.05判断为具有显著的统计学差异结果见表3表3各组大鼠血清E2、FSH、LH、皮质酮水平的比较@切)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注与空白对照组比较*p<0.05**p<0.01由表3可见，各组去势大鼠血清测定结果与空白对照组相比，各给药组E2水平与阳性对照组接近或高于阳性对照组，特别是射干总异黄酮(BC)中剂量组和野鸢尾苷元组；FSH水平有所下降，其中射干总异黄酮(BC)中剂量组下降最为显著(ρ<0.01)；LH水平都有不同程度的下降，特别是鸢尾苷(BC-I)和鸢尾黄素(BC-3)；血清皮质酮水平有明显升高。结果表明它们可用于改善妇女更年期综合征症状。2、脏器系数测定动物处死后，解剖取出子宫、阴道、肾上腺，尽可能剔除周边的结缔组织和脂肪，精确称重，按下式计算脏器系数。脏器系数=脏器重量(g)/体重(g)X1000各组动物性器官脏器系数测定结果比较如表4所示。表4各组大鼠性器官脏器系数测定结果比较(S=S)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>BC-7野鸢尾苷0.73±0.110.12±0.02大豆异黄酮组0.79±0.250.12士0.03更年安组_0.68士0.11_0.13士0.02_注与空白对照组比较*p<0.05；**p<0.01由表4可见，给药组去势大鼠子宫阴道系数与空白对照组相比，射干总异黄酮(BC)中剂量和高剂量、鸢尾苷(BC-I)、野鸢尾苷元(BC-2)、鸢尾黄素(BC-3)、野鸢尾苷(BC-7)组子宫阴道系数均有不同程度的增加，特别是鸢尾黄素(BC-3)组；肾上腺(左侧)系数变化不大。表明可改善和预防妇女更年期引起的临床症状。3、病理检查及免疫组化检查取子宫、阴道、肾上腺经过10%福尔马林固定72小时，石蜡包埋切片，切片厚约45μm，HE染色，LeicaDMLB光学显微镜观察，Olympus数码摄像机下抓拍显微照片。并进行子宫内膜的雌激素受体免疫组织化学染色，统计阳性表达。1)各组去势大鼠子宫、阴道、肾上腺病理组织学检查从去势大鼠各脏器病理组织学检查结果来看，各组去势大鼠子宫、阴道、肾上腺脏器和组织在显微镜下均未见明显的异型增生、萎缩、出血、坏死及炎症等改变。相比各组的病理检查，鸢尾苷(BC-I)、野鸢尾苷元(BC-2)、鸢尾黄素(BC-3)、野鸢尾苷(BC-7)、射干总异黄酮高剂量组有相对明显的子宫内膜增生现象，与大豆异黄酮组一样，说明给药后使子宫内膜、阴道上皮内膜增生，因此可预防和治疗妇女更年期综合症因性器官衰退引起的临床症状。2)免疫组化雌激素受体雌激素受体在各组去势大鼠子宫的上皮细胞均有表达，雌激素受体在野鸢尾苷元(BC-2)、鸢尾黄素(BC-3)、野鸢尾苷(BC-7)、射干总异黄酮高剂量组中的表达较明显，与大豆异黄酮组一致，说明给药组可使大鼠的子宫雌激素受体上调，可预防和治疗妇女更年期综合症由于雌激素水平下降引起的临床症状。上述实验结果表明，射干总异黄酮或鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾黄素、野鸢尾苷等异黄酮类化合物具有显著提高雌激素水平，促进卵泡生成，促进子宫、阴道上皮增生，减缓子宫及卵巢衰退，并可提高阴道上皮细胞雌激素受体的表达，这些药理作用说明射干总异黄酮或异黄酮类化合物单体可以防治妇女更年期雌激素水平改变而引起的一系列临床症状。因此，它们可用于制备防治妇女雌激素水平低下、减缓子宫细胞和阴道上皮细胞及卵巢衰退或更年期综合征的药物或食品。权利要求异黄酮类化合物鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾黄素、野鸢尾苷、次野鸢尾黄素、去甲基次野鸢尾黄素、5，6，7，3′-四羟基-4′-甲氧基异黄酮、5，7-二羟基-6，3′，4′，5′-四甲氧基异黄酮、5，7，3′-三羟基-8，4′，5′-三甲氧基异黄酮、5，7，4′-三羟基-6，3′，5′-三甲氧基异黄酮、鸢尾苷元-4′-葡萄糖苷或5，3′，5′-三甲氧基-6，7-亚甲二氧基异黄酮-4′-O-β-D-葡萄糖在制备防治妇女雌激素水平低下、减缓子宫及卵巢衰退或更年期综合征的药物或食品中的应用，它们的化学结构通式如下其中R1＝OH或OCH3；R2＝OCH3、OH或H；R3＝OH或Oglu；R4＝OCH3或H；R5＝OCH3、OH或H；R6＝OCH3、OH或Oglu；R7＝OCH3或H；各化合物的基团搭配分别如下FSA00000081690300011.tif2.射干总异黄酮在制备防治妇女雌激素水平低下、减缓子宫及卵巢衰退或更年期综合征的药物或食品中的应用，所说射干总异黄酮的制备方法如下取射干干燥药材，用10倍体积量的80%乙醇水溶液热提取三次，每次提取时间为100分钟，过滤，滤液减压回收乙醇，加水稀释至10倍体积后，上AB-8大孔树脂柱，先以水洗脱5个柱床体积，再以90%乙醇水溶液洗脱5个柱床体积，收集该90%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩干燥，得射干总异黄酮。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，是射干总异黄酮或鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾黄素、野鸢尾苷等12个异黄酮类化合物单体在制备防治妇女雌激素水平低下、减缓子宫及卵巢衰退或更年期综合征的药物或食品中的应用。动物实验结果表明，射干中的总异黄酮或12个异黄酮类化合物单体具有显著提高雌激素水平，促进卵泡生成，促进子宫、阴道上皮增生，减缓子宫及卵巢衰退；可提高阴道上皮细胞雌激素受体的表达等药理作用，因此可用于制备防治妇女雌激素水平低下、减缓子宫及卵巢衰退和更年期综合症的药物或食品。本发明为寻求植物雌激素药物提供了一种新的来源。文档编号A61K31/352GK101797265SQ201010144900公开日2010年8月11日申请日期2010年4月9日优先权日2010年4月9日发明者刘建国,赵卫权,金丽,金永生,陈海生申请人:中国人民解放军第二军医大学