以兔膝关节软骨单位为种子细胞,体外构建组织工程软骨的实验方法
专利名称：以兔膝关节软骨单位为种子细胞,体外构建组织工程软骨的实验方法
技术领域：
本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术领域，具体涉及一种以兔膝关节软骨 单位为种子细胞，体外构建组织工程软骨的实验方法。
背景技术：
在组织工程化软骨体外构建过程中，理想种子细胞的选择最为关键，也是目前研 究的难点。目前，国内外文献报道中，最为常用的关节软骨组织工程的种子细胞为软骨细 胞。其体外常规酶解消化方法为0. 4% Pronase酶按12mLDMEM_F12培养液/g软骨37°C 消化90分钟，更换培养液后，0.025% II型胶原酶过夜消化，获取膝关节软骨细胞。但软骨 细胞体外培养及传代过程中，黏弹性逐渐降低，脆性增加，软骨细胞功能退变比较快，体内 修复软骨缺损过程中形不成符合正常软骨特性的透明软骨组织，成为制约组织工程技术发 展的最大障碍之一。软骨单位(Chondron)作为近年来才逐渐重视的关节软骨功能结构，由细胞周基 质及包裹在一个或几个软骨细胞共同构成，其在软骨细胞代谢及力学环境维持方面发挥了 重要作用。我们试图在体外成功酶解消化获取兔膝关节软骨单位的基础上，以其为种子细 胞，建立体外体外构建组织工程化关节软骨的实验方法。
发明内容
本发明目的在于针对现有以软骨细胞为组织工程化软骨种子细胞的不足，提出一 种新的关节软骨组织工程的种子细胞——软骨单位(Chondron)的体外获取方法及其体外 组织工程化软骨的构建技术。具体是一种兔膝关节软骨单位体外酶解消化、分离方法的基 础上，以软骨单位为种子细胞，以海藻酸钠凝胶为载体，建立体外构建组织工程化关节软骨 的实验方法。本发明采用如下的技术方案实现一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞，体外构 建组织工程软骨的实验方法，其特征在于步骤如下(1)、无菌条件下留取兔膝关节，在超净工作台内将膝关节打开，刮取膝关节股骨 和胫骨平台全层软骨，将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗，弃上清，称重， 放置于无菌锥形瓶备用；(2)、采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥 形瓶内，即每克软骨加入DMEM-F12培养液12mL，DMEM-F12培养液中含有质量/体积浓度为 0. 3%的dispase酶和质量/体积浓度为0. 2%的II型胶原酶，上述两种酶均采用无菌DMEM-F12培养液溶解，经过0. 22 μ m —次性过滤器过滤、 除菌，加入培养液的锥形瓶放置于37°C 5% CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进行 联合酶解搅拌消化3h，形成消化悬液；
(3)、将上述消化悬液用10(^111细胞筛网过滤于离心管中，1200印111离心51^11，弃 上清，然后IOmL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次，加入原代软骨细胞培养液10mL， 原代软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清lmL，制成无菌的软骨单位悬液， 即获得了种子细胞——软骨单位；(4)、上述获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养，体外构建组织工程软骨， 步骤如下①、将120mg海藻酸钠粉剂溶解于IOmLO. 9% NaCl溶液，振荡，混勻，0. 45 μ m—次 性过滤器过滤、除菌备用，②、将软骨单位悬液计数、离心，弃上清，按4X IO6个单位/mL海藻酸钠凝胶混合， 用无菌吸管反复吹打均勻，③、用微量移液器吸取40 μ L混合均勻的海藻酸钠凝胶，缓慢滴入无菌102mMCaCl2 溶液，静置5 10分钟，制成海藻酸钠凝胶球，0. 9% NaCl溶液蘸洗，接种于6孔板培养，每 孔接种4粒凝胶球，加入原代培养基3mL，原代培养基包括DMEM-F12培养基2. 7mL及肽牛血 清 0. 3mL。④、将培养板放置于37°C 5% CO2培养箱进行培养，2 3日更换1次培养液，使关 节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。
本发明利用软骨单位作为组织工程化软骨种子细胞，相对现有技术具有如下有益 效果(1)、利用dispase酶和II型胶原酶联合酶解搅拌消化3小时可以成功获取兔膝 关节软骨单位，获取方法简单，重复性好。(2)、酶解消化获得的软骨单位包括完整的细胞周基质及包裹在内的一个或几个 软骨细胞，使得软骨细胞在体外培养及构建组织工程化软骨过程中更加符合软骨细胞在体 内的生长环境及生物学特性。(3)、通过微管吸吮生物力学实验发现，急性消化软骨单位平衡 模量(1.573 士 0. 151kPa)、瞬时模量(6. 850 士 0. 607kPa)以及黏弹性指数 (13.423±1.027kPa*S)明显高于单纯软骨细胞平衡模量(0. 370士0. 013kPa)、瞬时模量 (0. 672士0. 015kPa)以及黏弹性指数(6. 293士0. 134kPa-s)。说明关节软骨单位较单纯细 胞相比生物力学特性明显提高，改善了软骨细胞作为种子细胞生物力学特性较差的缺点。(4)、与软骨细胞相比，软骨单位体外长期培养过程中形态、增殖情况稳定，分泌II 型胶原等基质成分生理学功能提高，有望促进组织工程法修复软骨损伤的效果。
具体实施例方式本发明具体步骤如下(1)、无菌条件下留取兔膝关节。在超净工作台内将膝关节打开，锐刀刮取膝关节 股骨和胫骨平台全层软骨。用小剪刀将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗， 弃上清，称重，放置于无菌锥形瓶备用。(2)、采用0.3% dispase酶(一种中性裂解酶，美国Sigma公司)和0.2% II型 胶原酶(美国Sigma公司)按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内。两种酶 均采用无菌DMEM-F12培养液(美国HyClone公司)溶解，经过0. 22 μ m —次性过滤器过滤、除菌。将加入培养液锥形瓶放置于37°C 5% CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进 行联合酶解搅拌消化3h (通过我们连续观察发现，搅拌消化3h时已肉眼看不见剩余软骨组 织块)。(3)、将上述消化悬液用IOOym细胞筛网过滤于15mL离心管中，1200rpm离心 5min,弃上清，IOmL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次。加入原代软骨细胞培养液 10mL(DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清ImL)，制成无菌的软骨单位悬液。(4)、上述消化获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养，步骤如下①、将120mg海藻酸钠(美国Sigma公司)粉剂溶解于IOmLO. 9% NaCl溶液，振 荡，混勻，0. 45 μ m —次性过滤器过滤、除菌备用。②、将软骨单位悬液计数、离心，弃上清。按4X IO6个单位/mL海藻酸钠凝胶混合， 用无菌吸管反复吹打均勻。③、用微量移液器吸取40 μ L混合均勻的海藻酸钠凝胶，缓慢滴入无菌102mMCaCl2 溶液，静置5 10分钟，制成海藻酸钠凝胶球。0. 9% NaCl溶液蘸洗，接种于6孔板培养， 每孔接种4粒凝胶球，加入原代培养基3mL (DMEM-F 12培养基2. 7mL及肽牛血清0. 3mL)。④、将培养板放置于37°C 5% CO2培养箱进行培养，2 3日更换1次培养液，使关 节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。
权利要求
一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞，体外构建组织工程软骨的实验方法，其特征在于步骤如下(1)、无菌条件下留取兔膝关节，在超净工作台内将膝关节打开，刮取膝关节股骨和胫骨平台全层软骨，将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗，弃上清，称重，放置于无菌锥形瓶备用；(2)、采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，即每克软骨加入DMEM-F12培养液12mL，DMEM-F12培养液中含有质量/体积浓度为0.3％的dispase酶和质量/体积浓度为0.2％的II型胶原酶，上述两种酶均采用无菌DMEM-F12培养液溶解，经过0.22μm一次性过滤器过滤、除菌，加入培养液的锥形瓶放置于37℃5％CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进行联合酶解搅拌消化3h，形成消化悬液；(3)、将上述消化悬液用100μm细胞筛网过滤于离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，然后10mL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次，加入原代软骨细胞培养液10mL，原代软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清1mL，制成无菌的软骨单位悬液，即获得了种子细胞——软骨单位；(4)、上述获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养，体外构建组织工程软骨，步骤如下①、将120mg海藻酸钠粉剂溶解于10mL0.9％NaCl溶液，振荡，混匀，0.45μm一次性过滤器过滤、除菌备用，②、将软骨单位悬液计数、离心，弃上清，按4×106个单位/mL海藻酸钠凝胶混合，用无菌吸管反复吹打均匀，③、用微量移液器吸取40μL混合均匀的海藻酸钠凝胶，缓慢滴入无菌102mMCaCl2溶液，静置5～10分钟，制成海藻酸钠凝胶球，0.9％NaCl溶液蘸洗，接种于6孔板培养，每孔接种4粒凝胶球，加入原代培养基3mL，原代培养基包括DMEM-F 12培养基2.7mL及肽牛血清0.3mL，④、将培养板放置于37℃5％CO2培养箱进行培养，2～3日更换1次培养液，使关节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。
全文摘要
本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术领域，具体涉及一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞，体外构建组织工程软骨的实验方法。其步骤如下留取兔膝关节，将关节软骨反复剪成碎片组织，冲洗，弃上清，放置于无菌锥形瓶备用；采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，搅拌，消化，形成消化悬液；将消化悬液过滤、离心，加入原代软骨细胞培养液，制成无菌的软骨单位悬液，获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养构建组织工程软骨。本发明的有益效果软骨单位体外长期培养过程中形态、增殖情况稳定，分泌II型胶原等基质成分生理学功能提高，有望促进组织工程法修复软骨损伤的效果。
文档编号A61L27/20GK101829362SQ20101014694
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者卫小春, 孙振伟, 李琦, 段王平 申请人:山西医科大学第二医院;卫小春
技术领域：
本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术领域，具体涉及一种以兔膝关节软骨 单位为种子细胞，体外构建组织工程软骨的实验方法。
背景技术：
在组织工程化软骨体外构建过程中，理想种子细胞的选择最为关键，也是目前研 究的难点。目前，国内外文献报道中，最为常用的关节软骨组织工程的种子细胞为软骨细 胞。其体外常规酶解消化方法为0. 4% Pronase酶按12mLDMEM_F12培养液/g软骨37°C 消化90分钟，更换培养液后，0.025% II型胶原酶过夜消化，获取膝关节软骨细胞。但软骨 细胞体外培养及传代过程中，黏弹性逐渐降低，脆性增加，软骨细胞功能退变比较快，体内 修复软骨缺损过程中形不成符合正常软骨特性的透明软骨组织，成为制约组织工程技术发 展的最大障碍之一。软骨单位(Chondron)作为近年来才逐渐重视的关节软骨功能结构，由细胞周基 质及包裹在一个或几个软骨细胞共同构成，其在软骨细胞代谢及力学环境维持方面发挥了 重要作用。我们试图在体外成功酶解消化获取兔膝关节软骨单位的基础上，以其为种子细 胞，建立体外体外构建组织工程化关节软骨的实验方法。
发明内容
本发明目的在于针对现有以软骨细胞为组织工程化软骨种子细胞的不足，提出一 种新的关节软骨组织工程的种子细胞——软骨单位(Chondron)的体外获取方法及其体外 组织工程化软骨的构建技术。具体是一种兔膝关节软骨单位体外酶解消化、分离方法的基 础上，以软骨单位为种子细胞，以海藻酸钠凝胶为载体，建立体外构建组织工程化关节软骨 的实验方法。本发明采用如下的技术方案实现一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞，体外构 建组织工程软骨的实验方法，其特征在于步骤如下(1)、无菌条件下留取兔膝关节，在超净工作台内将膝关节打开，刮取膝关节股骨 和胫骨平台全层软骨，将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗，弃上清，称重， 放置于无菌锥形瓶备用；(2)、采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥 形瓶内，即每克软骨加入DMEM-F12培养液12mL，DMEM-F12培养液中含有质量/体积浓度为 0. 3%的dispase酶和质量/体积浓度为0. 2%的II型胶原酶，上述两种酶均采用无菌DMEM-F12培养液溶解，经过0. 22 μ m —次性过滤器过滤、 除菌，加入培养液的锥形瓶放置于37°C 5% CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进行 联合酶解搅拌消化3h，形成消化悬液；
(3)、将上述消化悬液用10(^111细胞筛网过滤于离心管中，1200印111离心51^11，弃 上清，然后IOmL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次，加入原代软骨细胞培养液10mL， 原代软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清lmL，制成无菌的软骨单位悬液， 即获得了种子细胞——软骨单位；(4)、上述获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养，体外构建组织工程软骨， 步骤如下①、将120mg海藻酸钠粉剂溶解于IOmLO. 9% NaCl溶液，振荡，混勻，0. 45 μ m—次 性过滤器过滤、除菌备用，②、将软骨单位悬液计数、离心，弃上清，按4X IO6个单位/mL海藻酸钠凝胶混合， 用无菌吸管反复吹打均勻，③、用微量移液器吸取40 μ L混合均勻的海藻酸钠凝胶，缓慢滴入无菌102mMCaCl2 溶液，静置5 10分钟，制成海藻酸钠凝胶球，0. 9% NaCl溶液蘸洗，接种于6孔板培养，每 孔接种4粒凝胶球，加入原代培养基3mL，原代培养基包括DMEM-F12培养基2. 7mL及肽牛血 清 0. 3mL。④、将培养板放置于37°C 5% CO2培养箱进行培养，2 3日更换1次培养液，使关 节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。
本发明利用软骨单位作为组织工程化软骨种子细胞，相对现有技术具有如下有益 效果(1)、利用dispase酶和II型胶原酶联合酶解搅拌消化3小时可以成功获取兔膝 关节软骨单位，获取方法简单，重复性好。(2)、酶解消化获得的软骨单位包括完整的细胞周基质及包裹在内的一个或几个 软骨细胞，使得软骨细胞在体外培养及构建组织工程化软骨过程中更加符合软骨细胞在体 内的生长环境及生物学特性。(3)、通过微管吸吮生物力学实验发现，急性消化软骨单位平衡 模量(1.573 士 0. 151kPa)、瞬时模量(6. 850 士 0. 607kPa)以及黏弹性指数 (13.423±1.027kPa*S)明显高于单纯软骨细胞平衡模量(0. 370士0. 013kPa)、瞬时模量 (0. 672士0. 015kPa)以及黏弹性指数(6. 293士0. 134kPa-s)。说明关节软骨单位较单纯细 胞相比生物力学特性明显提高，改善了软骨细胞作为种子细胞生物力学特性较差的缺点。(4)、与软骨细胞相比，软骨单位体外长期培养过程中形态、增殖情况稳定，分泌II 型胶原等基质成分生理学功能提高，有望促进组织工程法修复软骨损伤的效果。
具体实施例方式本发明具体步骤如下(1)、无菌条件下留取兔膝关节。在超净工作台内将膝关节打开，锐刀刮取膝关节 股骨和胫骨平台全层软骨。用小剪刀将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗， 弃上清，称重，放置于无菌锥形瓶备用。(2)、采用0.3% dispase酶(一种中性裂解酶，美国Sigma公司)和0.2% II型 胶原酶(美国Sigma公司)按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内。两种酶 均采用无菌DMEM-F12培养液(美国HyClone公司)溶解，经过0. 22 μ m —次性过滤器过滤、除菌。将加入培养液锥形瓶放置于37°C 5% CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进 行联合酶解搅拌消化3h (通过我们连续观察发现，搅拌消化3h时已肉眼看不见剩余软骨组 织块)。(3)、将上述消化悬液用IOOym细胞筛网过滤于15mL离心管中，1200rpm离心 5min,弃上清，IOmL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次。加入原代软骨细胞培养液 10mL(DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清ImL)，制成无菌的软骨单位悬液。(4)、上述消化获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养，步骤如下①、将120mg海藻酸钠(美国Sigma公司)粉剂溶解于IOmLO. 9% NaCl溶液，振 荡，混勻，0. 45 μ m —次性过滤器过滤、除菌备用。②、将软骨单位悬液计数、离心，弃上清。按4X IO6个单位/mL海藻酸钠凝胶混合， 用无菌吸管反复吹打均勻。③、用微量移液器吸取40 μ L混合均勻的海藻酸钠凝胶，缓慢滴入无菌102mMCaCl2 溶液，静置5 10分钟，制成海藻酸钠凝胶球。0. 9% NaCl溶液蘸洗，接种于6孔板培养， 每孔接种4粒凝胶球，加入原代培养基3mL (DMEM-F 12培养基2. 7mL及肽牛血清0. 3mL)。④、将培养板放置于37°C 5% CO2培养箱进行培养，2 3日更换1次培养液，使关 节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。
权利要求
一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞，体外构建组织工程软骨的实验方法，其特征在于步骤如下(1)、无菌条件下留取兔膝关节，在超净工作台内将膝关节打开，刮取膝关节股骨和胫骨平台全层软骨，将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗，弃上清，称重，放置于无菌锥形瓶备用；(2)、采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，即每克软骨加入DMEM-F12培养液12mL，DMEM-F12培养液中含有质量/体积浓度为0.3％的dispase酶和质量/体积浓度为0.2％的II型胶原酶，上述两种酶均采用无菌DMEM-F12培养液溶解，经过0.22μm一次性过滤器过滤、除菌，加入培养液的锥形瓶放置于37℃5％CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进行联合酶解搅拌消化3h，形成消化悬液；(3)、将上述消化悬液用100μm细胞筛网过滤于离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，然后10mL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次，加入原代软骨细胞培养液10mL，原代软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清1mL，制成无菌的软骨单位悬液，即获得了种子细胞——软骨单位；(4)、上述获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养，体外构建组织工程软骨，步骤如下①、将120mg海藻酸钠粉剂溶解于10mL0.9％NaCl溶液，振荡，混匀，0.45μm一次性过滤器过滤、除菌备用，②、将软骨单位悬液计数、离心，弃上清，按4×106个单位/mL海藻酸钠凝胶混合，用无菌吸管反复吹打均匀，③、用微量移液器吸取40μL混合均匀的海藻酸钠凝胶，缓慢滴入无菌102mMCaCl2溶液，静置5～10分钟，制成海藻酸钠凝胶球，0.9％NaCl溶液蘸洗，接种于6孔板培养，每孔接种4粒凝胶球，加入原代培养基3mL，原代培养基包括DMEM-F 12培养基2.7mL及肽牛血清0.3mL，④、将培养板放置于37℃5％CO2培养箱进行培养，2～3日更换1次培养液，使关节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。
全文摘要
本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术领域，具体涉及一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞，体外构建组织工程软骨的实验方法。其步骤如下留取兔膝关节，将关节软骨反复剪成碎片组织，冲洗，弃上清，放置于无菌锥形瓶备用；采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，搅拌，消化，形成消化悬液；将消化悬液过滤、离心，加入原代软骨细胞培养液，制成无菌的软骨单位悬液，获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养构建组织工程软骨。本发明的有益效果软骨单位体外长期培养过程中形态、增殖情况稳定，分泌II型胶原等基质成分生理学功能提高，有望促进组织工程法修复软骨损伤的效果。
文档编号A61L27/20GK101829362SQ20101014694
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者卫小春, 孙振伟, 李琦, 段王平 申请人:山西医科大学第二医院;卫小春
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