穿心莲内酯衍生物在制备抗hiv药物中的用途的制作方法

专利名称：：穿心莲内酯衍生物在制备抗hiv药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及穿心莲内酯衍生物的医药用途，具体是指穿心莲内酯衍生物在制备抗HIV药物中用途，属于药物化学领域。
背景技术：
：艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)，是一种由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病。迄今仍无艾滋病疫苗问世，抗HIV药物依然是艾滋病防治的主要手段。高效抗逆转录病毒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)是目前临床广泛使用的治疗艾滋病的方法，但此种疗法价格昂贵，毒副作用大，不能彻底清除人体内的HIV，而且易引起病毒产生变异性和耐药性。因此，寻找具有新的作用靶点、抗耐药，且价格低、疗效佳、毒性小的新型药物已成为目前抗HIV药物研究的趋势。传统中药和药用植物来源的天然化合物具有结构多样性、毒性较低、来源广泛等特点，可能具有与现有药物不同的抗HIV机制，因而在防治艾滋病方面有着独特的优势和巨大的潜力。[张旋，黄宁，郑永唐，我国中药来源的抗HIV天然化合物研究进展[J].药学学报，2010，45(2)141-153.]穿心莲内酯(Andrographolide)为爵床科植物穿心莲Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的主要有效成分之一。具有解热、抗炎、镇痛、抗菌、降血糖等广泛的生理活性，临床上主要用于治疗上呼吸道感染等疾病。随着对穿心莲内酯药理作用研究的不断深入，其在免疫调节、抗病毒、抗肿瘤和抗HIV等方面显示了诱人的应用前景。[李晶，黄文龙，张惠斌等，穿心莲内酯酰胺类衍生物的合成及其cox-2表达抑制活性[J].中国药科大学学报，2007，38(04)299-304.；Jackman，R.W.，M.G.Rhoads，E.Cornwell,etal.,Microtubule-MediatedNF-KbActivationintheTNF-αSignalingPathway[J].ExperimentalCellResearch,2009,315(19)3242-3249.；Madav,S.,H.Tripathi,Tandan,etal.,Analgesic,AntipyreticandAntiulcerogenicEffectsofAndrographolide[J].IndianJ.Pharm.Sci,1995,57(3)121-125.；Roy,S.,K.Rao,C.Bhuvaneswari,etal.,PhytochemicalAnalysisofAndrographisPaniculataExtractandItsAntimicrobialActivity[J]·WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2010,26(1)85-91.；DeutschlanderM.S.,M.vandeVenter,S.Roux,etal.,HypoglycaemicActivityofFourPlantExtractsTraditionallyUsedinSouthAfricaforDiabetes[J].JournalofEthnopharmacology,2009,124(3):619-624.；Farinacci,Μ.,Μ.Colitti,S.Sgorlon,etal.,ImmunomodulatoryActivityofPlantResiduesonOvineNeutrophils[J].VeterinaryImmunologyandImmunopathology，2008，126(1-2)54-63.；Chen,J-X.，H-J.Xue,ff-C.Ye,etal.，ActivityofAndrographolideandItsDerivativesagainstInfluenzaVirusinVivoandinVitro[J].Biol.Pharm.Bull.,2009,32(8)1385-1391.；Shi,M-D.,H-H.Lin,T-A.Chiang,etal.,AndrographolideCouldInhibitHumanColorectalCarcinomaLovoCellsMigrationandInvasionViaDown-RegulationofMmp-7Expression[J].Chemico-BiologicalInteractions,2009,180(3)344-352.；Ding,Y.,L.Zhang,J.S.Goodwin,etal.,PlectinregulatesthesignalingandtraffickingoftheHIV-lco-receptorCXCR4andplaysaroleinHIV-Iinfection[J].ExperimentalCellResearch,2008,314(3)=590-602.；戴桂馥，王俊峰，何帅伟，等.穿心莲内酯及其衍生物的药理活性研究进展.中成药，2006，28(7)1032-1035.]文献报道穿心莲内酯具有抗HIV活性[S.HoltandL.Comae.MiracleHerbsHowHerbsCombinewithModernMedicinetoTreatCancer,HeartDisease,AIDS,andMore.CaroPublishingGroup,1998.；N.Srinivas,R.Sriram,P.Sairam,P.SunilKumar,B.KochunarayanaandC.Rajan.Compoundshavinganti-tumaractivity:processfortherepreparationandpharmaceuticalscompositioncontainthem.PCT,Int.App1.,WO01/57026A1,2001],Venkateswarlu等从中药穿心莲中分离得到到1个新的二萜二聚体双穿心莲内酯醚以及4个已知的二萜化合物和2个已知的黄酮类化合物。对分离得到的所有化合物均进行了抗HIV活性的检测，结果显示穿心莲内酯和14-脱氧-11，12-二脱氢穿心莲内酯具有显著的抗HIV活性，EC50分别为49.Oμg/mL和56.8μg/mL,但均低于抗HIV药物AZT的活性(EC5tl为20ng/mL)。[Reddy，V.L.N.，S.Μ.Reddy，V.Ravikanth,etal.，AnewBIS—AndrographolideEtherfromAndrographispaniculataNeesandevaluationofanti-HIVactivity[J].NaturalProductResearchFormerIyNaturalProductLetters,2005，19(3):223-230.]现有文献中未见有关穿心莲内酯衍生物具有抗HIV活性的报道。
发明内容本发明的目的在于提供穿心莲内酯衍生物在制备抗HIV药物中的应用。为实现本发明的目的，根据SFDA“抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则(2006)”采用国际通用实验方法对穿心莲内酯衍生物的抗HIV-I活性进行检测，研究证实穿心莲内酯衍生物具有抗HIV活性，可以用于制备抗HIV药物。本发明中涉及的穿心莲内酯衍生物为以下化合物^OR1HO^A1_4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>A112-0-苯甲酰-14-脱氧穿心莲内酯A212-0-对硝基苯甲酰-14-脱氧穿心莲内酯A3:12-0-(3，4_亚甲二氧基肉桂酰)-14_脱氧穿心莲内酯A412-0-(3,4-亚甲二氧基_6_硝基苯甲酰)_14_脱氧穿心莲内酯其化合物的制备方法已在本研究前期申请的发明专利CN=200710019983.3中公Jf,同时可以:Li,J.，W.Huang,H.Zhang,etal.，SynthesisofandrographolidederivativesandtheirTNF-αandIL_6expressioninhibitoryactivities[J].Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2007,17(24):6891_6894.。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>B1:3_肟脱水穿心莲内酯B2:3-0-对氯苯甲酰肟脱水穿心莲内酯其化合物的制备方法已在本研究前期申请的发明专利CN=200710019983.3中公开。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>C1:12，13-二氢穿心莲内酰胺C1:3-N-甲基-12，13-二氢穿心莲内酰胺其化合物的制备方法己在本研究前期申请的发明专利CN=200710019983.3中公开，还可以参考李晶，黄文龙，张惠斌等，穿心莲内酯酰胺类衍生物的合成及其C0X-2表达抑制活性[J]·中国药科大学学报，2007，38(04)=299-304.。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>D1:3，19-二-O-乙酰异穿心莲内酯D2:3，19-二-O-丙酰异穿心莲内酯D3:3，19-二-O-己酰异穿心莲内酯D4:3，19-二-O-苯甲酰异穿心莲内酯D5:19-0_苯甲酰异穿心莲内酯D6:19-0_三苯甲基异穿心莲内酯D73-0-乙酰异穿心莲内酯D83-0-丙酰异穿心莲内酯D93-0-己酰异穿心莲内酯Dltl:3，19-二-0-(2-(6-甲氧基萘基)丙酰)异穿心莲内酯D11:3，19_二-0-(2-(4-苯甲酰基苯基)丙酰)异穿心莲内酯D12:3，19-二-0-(4-N_(2，6-二氯苯胺)苯乙酰)异穿心莲内酯D13:3，19-二-0-(2-乙酰氧基苯甲酰)异穿心莲内酯其化合物的制备方法已在本研究前期申请的发明专利CN=200710019984.8中公开，可以:Li,J.，W.Huang,H.Zhang,etal.，SynthesisofandrographolidederivativesandtheirTNF-αandIL_6expressioninhibitoryactivities[J].Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2007,17(24):6891_6894.。根据SFDA“抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则(2006)”采用国际通用实验方法对穿心莲内酯衍生物的抗HIV-I活性进行检测，结果显示穿心莲内酯衍生物具有较好的抗HIV活性，具有继续开发的潜力。具体实施例方式通过药理实验，详细说明穿心莲内酯及其衍生物的抗HIV活性。实施例1穿心莲内酯及其衍生物的细胞毒性实验和致细胞病变抑制实验I.材料和方法一、测定药物和化合物待测样品穿心莲内酯及衍生物1_22#。阳性对照化合物叠氮胸苷(3，-Azido-3，-deoxythymidine,AZT)购自Sigma公司。待测样品溶解于DMSO中，贮存液浓度为25mg/ml，储存条件为4°C;AZT溶解于RPMI-1640完全培养基中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存。二、试剂和溶液(1)试剂HEPES(N-2(2-Hydroxyothyl)piperazine-N'-(2-ethanesufonicacid)>MTT(3,(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)>DMF(N,N，-Dimethylformamine)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(Streptomycinsulfate)>谷氨酰胺(Glutamine)均购自Sigma公司；2-巯基乙醇(2-ME，2-Mercaptoethanol)为Bio-Rad公司产品。RPMI-1640和胎牛血清为Gibco公司产品。(2)培养基RPMI-1640完全培养基，含有10%胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，IOmMHEPES,50μΜ2-巯基乙醇，100，000IU青霉素，100μg/ml链霉素。三、细胞和病毒人T淋巴细胞系C8166、HIV-I实验株HIV-Iiiib均由英国MedicalResearchCouncil,AIDSReagentProject惠赠。所有细胞和病毒均以含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-Iiiib，滴定并计算出病毒的TCID5tlt5病毒贮存液分装后，置-70°C保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。四、HIV-I感染性滴定HIV-Iiiib按Johnson&Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下将HIV-I贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50μ1，每孔终体积为200μ1。37°C，5%CO2培养。第3天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100μ1，第7天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-I诱导的细胞病变效应(CytopathicEffect，CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID5tl(50%TissueCultureInfectionDose)。五、对C8166细胞的毒性实验4XlOVmlC8166细胞悬液100μ1与不同的待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，37°C，5%CO2培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC5tl值(50%CytotoxicConcentration)，即对50%的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。六、对HIV-Iiiib致细胞病变(CPE)的抑制实验将8X105/mlC8166细胞50μ1/孔接种到含有100μ1/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μ1的HIV-Iiiib稀释上清，1300TCID50/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。AZT为阳性药物对照。37°C，5%C02培养3天，倒置显微镜下(100X)计数合胞体的形成。EC5tl(50%EffectiveConcentration)为抑制合胞体形成50%时的药物浓度。II.药理活性数据表1.穿心莲内酯及衍生物体外细胞毒性和抗HIV-I活性结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>莲内致细胞病变抑制epEQ7250819酯实验_.细胞毒性实验MTT2.682.7432A1致细胞病变抑制CPE09490.5222^"5'25实验细胞毒性实验MTT2.482.2373A2致细胞病变抑制cPE06922.232⑶0-3·58实验细胞毐性实验MTT2.712.232.4A3致细胞病变抑制CPE10950.4822·47"4·63实验.细胞毒性实验MTT2.712.4665A4.致细胞病变抻制CPE06100.648⑶1"4·44实验细胞毒性实验MTT>200>2006B1.致细胞病变抑制CPE17.06111.188⑷·723实验细胞毒性实验MTT21.2112.317762致细胞病变抑制ePE1066410.554彳.17-1."实验细胞毒性实验MTT>200>2008C1致细胞病变抑制cpE>200>200.实验细胞毒性实验MTT59.7253.9299C2致细胞病变抑制428212·59"12·67实验..‘细胞毒性实验MTT128.0265.5361001致细胞病变抑制CPE9704149.087^1·34实验细胞毒性实验MTT37.38126.53711D2致细胞病变抑制1729920.8581^"2'16实验’细胞毒性实验Μπ44.75137.27712D3致细胞病变抑制323944028.47-13.82实验’细胞毒性实验MTT138.11962.773.13D4致细胞病变抑制4776284822_Q4_28·91实验‘细胞毒性实验MTT158.006158.2021405.致细胞病变抑制cpE92130111.169^^^实验_细胞毒性实验MTT4.4322.98115D6致细胞病变抑制cpEQ67212842_32_6·60实验’16D7细胞毒性实验MTT168.807124.3471.27-2.64■致细胞病变抑制CPE63.93298.020实验细胞毒性实验MTT126.917104.31317D8致细朐病变抑伟(I1.23-2.95^mmm^tmicpE43.06084.651实验细胞毒性实验MTT23.72434.3741809致细胞实病验变抑制CPE3.5194.0486^8'49细胞毒性实验MTT>200>20019°10致细胞、病胁变抑制CPE44.38577.754>2.57.买验细胞毒性实验MTT100.013170.11820011致细H变抑制CPE20.31217.5234^"971.实验细胞毒性实验MTT>200>20021D12致细胞病变抑制>1-68CPE101.816118.954t头验细胞毒性实验MTT>200>20022D13致细胞病变抑制>33·19实验CPE25775237细胞毒性实验MTT137123AZT致细胞病变抑制274200_实验CPE_^5_通过对以上化合物的活性筛选，发现B1,C2,D3,D4及D13的TI值大于10，具有一定的体外抗HIV-I活性；其中D13有较高的体外抗HIV-I活性，TI值>33.19，具有继续开发的潜力，为幵发抗HIV药物提供了新的药物途径，扩大了临床用药的选择范围，对充分利用和发掘穿心莲资源具有重要意义。权利要求下列任一化合物的医药用途，其特征在于将其应用于制备抗HIV药物A112-O-苯甲酰-14-脱氧穿心莲内酯A212-O-对硝基苯甲酰-14-脱氧穿心莲内酯A312-O-(3，4-亚甲二氧基肉桂酰)-14-脱氧穿心莲内酯A412-O-(3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯甲酰)-14-脱氧穿心莲内酯B13-肟脱水穿心莲内酯B23-O-对氯苯甲酰肟脱水穿心莲内酯C112，13-二氢穿心莲内酰胺C13-N-甲基-12，13-二氢穿心莲内酰胺D13，19-二-O-乙酰异穿心莲内酯D23，19-二-O-丙酰异穿心莲内酯D33，19-二-O-己酰异穿心莲内酯D43，19-二-O-苯甲酰异穿心莲内酯D519-O-苯甲酰异穿心莲内酯D619-O-三苯甲基异穿心莲内酯D73-O-乙酰异穿心莲内酯D83-O-丙酰异穿心莲内酯D93-O-己酰异穿心莲内酯D103，19-二-O-(2-(6-甲氧基萘基)丙酰)异穿心莲内酯D113，19-二-O-(2-(4-苯甲酰基苯基)丙酰)异穿心莲内酯D123，19-二-O-(4-N-(2，6-二氯苯胺)苯乙酰)异穿心莲内酯D133，19-二-O-(2-乙酰氧基苯甲酰)异穿心莲内酯。全文摘要本发明涉及穿心莲内酯衍生物A1-4，B1-2，C1-2和D1-13在制备抗HIV药物中的应用。文档编号A61K31/4015GK101829110SQ20101017795公开日2010年9月15日申请日期2010年5月20日优先权日2010年5月20日发明者张惠斌,李晶,王彬,罗荣华,郑永唐,钱海,黄文龙申请人:中国药科大学