一种免疫识别分子标记及其构建和应用的制作方法
专利名称：一种免疫识别分子标记及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种免疫识别分子标记及其构建和应用。
背景技术：
CpG-DNA是含有一个或多个未甲基化CpG的DNA序列，这种序列普遍存在于细菌 等微生物病原的基因组中，但很少出现在脊椎动物基因组中，并且其在脊椎动物DNA中的 上下游序列也与在细菌DNA中不同，因而CpG-DNA是一种微生物特有的分子标记，脊椎动物 免疫系统凭此可以识别入侵病原并做出相应的免疫反应。这种免疫识别依赖于脊椎动物一 种天然免疫识别分子，TLR9。TLR9是Toll样受体家族成员，其与CpG-DNA反应诱发一系列 免疫反应，包括激活自然杀伤细胞、单核细胞以及巨噬细胞，促使淋巴细胞繁殖和抗原递呈 等。这种免疫刺激特性使得CpG-DNA成为一种具有良好应用前景的免疫佐剂和抑菌分子。CpG-DNA具有种属特异性，即不同种动物的有效CpG-DNA序列不同。对于养殖鱼类 而言，目前已发现针对虹鳟、大西洋鲑鱼、鲤鱼等的CpG-DNA，但针对大菱鲆的有效CpG-DNA 尚未见报道。由于大菱鲆是我国重要养殖经济鱼类之一，微生物病害问题是影响其产业发 展的关键因素，因而开展大菱鲆特异性CpG-DNA研究对我国水产养殖业发展具有切实意 义。
发明内容
本发明目的在于提供一种免疫识别分子标记及其构建和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种免疫识别分子标记免疫识别分子标记为大菱鲆特异性CpG-DNA序列，为序 列表SEQ ID中的碱基序列所示。构建将质粒pCN3用BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG20用T4DNA连接酶于室温 连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 24-30小时，挑取转化子，提取质粒，即为具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的质粒；所 述寡聚核苷酸 CPG20 为 5’ -GATCGATCGCGTGCGTGCGTCTAT-3，。应用所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染或作为疫 苗佐剂，增强疫苗的特异性抑制致病性细菌的侵染。所序列表SEQID中的碱基序列能显著 抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。所述具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质 粒的PBS溶液至浓度为20ug/ml，具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒的PBS溶液以 100-120ul的剂量腹腔注射大菱鲆能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。本发明具有如下优点1.能够非特异性抑制病原侵染。本发明的大菱鲆特异性CpG-DNA能够使鱼类抵御 多种常见细菌病原的侵染。2.具有疫苗佐剂效应。本发明的大菱鲆特异性CpG-DNA可以作为疫苗佐剂使用， 能够增强疫苗的特异性免疫效应。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆 使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。4.所有寡核苷酸合成皆由“上海生工生物工程技术服务有限公司”合成。实施例1大菱鲆特异性CpG-DNA序列具序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列。序列表SEQ ID No. 1 为GATCGCGTGCGTGCGTCTAT(a)序列特征 长度20 类型核苷酸序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源人工设计实施例2 含有大菱鲆特异性CpG-DNA序列的质粒pC205的构建M pCN3( # JAL Jiao X, Zhang M, Hu Y, and sun L. Construction and evaluation of DNAvaccines encoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine. 2009 ； 27 :5195-5202.进行构建)用 BamHI 酶切后与寡聚核苷酸 CPG20(5，-GATCGATCGCGTGCGTGC GTCTAT-3，)用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有 安卡青霉素(lOOug/ml)的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取转化子，提取质粒，即为 具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的质粒，经测序可知质粒中包含序列表SEQ ID No. 1 中的碱基序列。实施例3抑菌应用1)迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德 华氏菌TX1 (保存于CGMCC，编号为CGMCC No. 2330)和哈氏弧菌T4(保存于CGMCC，编号为 CGMCC No. 1985)使菌悬液分别至0D_为0. 6，然后分别以5000g，4°C离心lOmin，分别收集菌体，将收集TX1菌体悬浮于PBS中至终浓度为5X106cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液； 将收集T4菌体悬浮于PBS中至终浓度为8X 107cfu/ml，即为哈氏弧菌悬液。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl，0. 02 % KC1，0. 358 % Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04，98. 798%蒸馏水。2)将96条大菱鲆(每条重约7g)随机分为4组，每组24条。将这4组分别命名 为A、B、C和D组。将A和C组的每条鱼腹腔注射lOOul具有序列表SEQ ID中的碱基序列 的质粒的PBS溶液，其中每lOOul含有2ug具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒。将B 和D组(对照组)的每条鱼腹腔注射lOOul PBS。2天后将A和B组鱼每条腹腔注射lOOul 上述步骤1)的迟缓爱德华氏菌悬液；将C和D组鱼每条腹腔注射lOOul上述步骤1)的哈 氏弧菌悬液。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼 的总死亡数目A组，6条；B组，16条，C组，4条；D组，14条。利用下列公式计算相对免疫 保护效率(RPS)RPS = 100 X (1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出pC205针对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的免疫保护效率分别为62. 5% 和 71. 4%。实施例4作为疫苗佐剂的应用1)哈氏弧菌悬液的制备，同实施例3中步骤1)。2)将72条大菱鲆随机分为3组，每组24条。将这3组分别命名为A、B和C 组。将A组的每条鱼腹腔注射lOOul含有15ug疫苗DegQ的PBS(DegQ为一种哈氏弧菌 ^SlSf ^JAL Zhang ff, Sun S, Cheng S, and Sun L. Characterization of DegQvh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl EnvironMicrobiol. 2008 ；74 :6254_6262.所得)，将 B 组的每条鱼腹腔注射 lOOul 含 有2ug具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒和15ug DegQ的PBS溶液，将C组(对照 组)的每条鱼腹腔注射lOOul PBS。4周后将3组鱼每条腹腔注射lOOul上述步骤1)的哈 氏弧菌悬液。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼 的总死亡数目A组，12条；B组，7条，C组，21条。由此得出疫苗DegQ的免疫保护效率为42. 9%，疫苗DegQ加具有序列表SEQID中 的碱基序列的质粒的免疫保护效率为66.7%。故具有序列表SEQ ID中的碱基序列将疫苗 DegQ的免疫保护效率提高了 23. 8%，即具有序列表SEQID中的碱基序列具有明显的免疫佐 齐U效应。结论具有序列表SEQ ID中的碱基序列既具有抑菌效应也具有疫苗佐剂效应。
权利要求
一种免疫识别分子标记，其特征在于免疫识别分子标记为大菱鲆特异性CpG-DNA序列，为序列表SEQ ID中的碱基序列所示。
2.一种按权利要求1所述的免疫识别分子标记的构建，其特征在于将质粒PCN3用 BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG20用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化入 大肠杆菌DH5 a后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取转化子， 提取质粒，即为具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的质粒；所述寡聚核苷酸CPG20为 5’ -GATCGATCGCGTGCGTGCGTCTAT-3’。
3.一种按权利要求1所述的免疫识别分子标记的应用，其特征在于所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染或作为疫苗佐剂，增强疫苗的特异性抑制致 病性细菌的侵染。
4.按权利要求3所述的免疫识别分子标记的应用，其特征在于所序列表SEQID中的 碱基序列能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。
5.按权利要求3所述的免疫识别分子标记的应用，其特征在于所述具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒的PBS溶液至浓度为20ug/ml，具有序列表SEQ ID中的碱基序列的 质粒的PBS溶液以100-120ul的剂量腹腔注射大菱鲆能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气 单胞菌侵染。
全文摘要
本本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种免疫识别分子标记及其构建和应用。免疫识别分子标记为大菱鲆特异性CpG-DNA序列，为序列表SEQ ID中的碱基序列所示。所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染或作为疫苗佐剂，增强疫苗的特异性抑制致病性细菌的侵染。本发明所得大菱鲆特异性CpG-DNA序列既有直接的抗菌能力又有疫苗佐剂作用，因而在大菱鲆病害防治中具有良好的应用前景。
文档编号A61P31/04GK101857861SQ201010151848
公开日2010年10月13日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者刘春胜, 孙黎 申请人:中国科学院海洋研究所
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种免疫识别分子标记及其构建和应用。
背景技术：
CpG-DNA是含有一个或多个未甲基化CpG的DNA序列，这种序列普遍存在于细菌 等微生物病原的基因组中，但很少出现在脊椎动物基因组中，并且其在脊椎动物DNA中的 上下游序列也与在细菌DNA中不同，因而CpG-DNA是一种微生物特有的分子标记，脊椎动物 免疫系统凭此可以识别入侵病原并做出相应的免疫反应。这种免疫识别依赖于脊椎动物一 种天然免疫识别分子，TLR9。TLR9是Toll样受体家族成员，其与CpG-DNA反应诱发一系列 免疫反应，包括激活自然杀伤细胞、单核细胞以及巨噬细胞，促使淋巴细胞繁殖和抗原递呈 等。这种免疫刺激特性使得CpG-DNA成为一种具有良好应用前景的免疫佐剂和抑菌分子。CpG-DNA具有种属特异性，即不同种动物的有效CpG-DNA序列不同。对于养殖鱼类 而言，目前已发现针对虹鳟、大西洋鲑鱼、鲤鱼等的CpG-DNA，但针对大菱鲆的有效CpG-DNA 尚未见报道。由于大菱鲆是我国重要养殖经济鱼类之一，微生物病害问题是影响其产业发 展的关键因素，因而开展大菱鲆特异性CpG-DNA研究对我国水产养殖业发展具有切实意 义。
发明内容
本发明目的在于提供一种免疫识别分子标记及其构建和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种免疫识别分子标记免疫识别分子标记为大菱鲆特异性CpG-DNA序列，为序 列表SEQ ID中的碱基序列所示。构建将质粒pCN3用BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG20用T4DNA连接酶于室温 连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 24-30小时，挑取转化子，提取质粒，即为具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的质粒；所 述寡聚核苷酸 CPG20 为 5’ -GATCGATCGCGTGCGTGCGTCTAT-3，。应用所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染或作为疫 苗佐剂，增强疫苗的特异性抑制致病性细菌的侵染。所序列表SEQID中的碱基序列能显著 抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。所述具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质 粒的PBS溶液至浓度为20ug/ml，具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒的PBS溶液以 100-120ul的剂量腹腔注射大菱鲆能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。本发明具有如下优点1.能够非特异性抑制病原侵染。本发明的大菱鲆特异性CpG-DNA能够使鱼类抵御 多种常见细菌病原的侵染。2.具有疫苗佐剂效应。本发明的大菱鲆特异性CpG-DNA可以作为疫苗佐剂使用， 能够增强疫苗的特异性免疫效应。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆 使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。4.所有寡核苷酸合成皆由“上海生工生物工程技术服务有限公司”合成。实施例1大菱鲆特异性CpG-DNA序列具序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列。序列表SEQ ID No. 1 为GATCGCGTGCGTGCGTCTAT(a)序列特征 长度20 类型核苷酸序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源人工设计实施例2 含有大菱鲆特异性CpG-DNA序列的质粒pC205的构建M pCN3( # JAL Jiao X, Zhang M, Hu Y, and sun L. Construction and evaluation of DNAvaccines encoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine. 2009 ； 27 :5195-5202.进行构建)用 BamHI 酶切后与寡聚核苷酸 CPG20(5，-GATCGATCGCGTGCGTGC GTCTAT-3，)用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有 安卡青霉素(lOOug/ml)的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取转化子，提取质粒，即为 具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的质粒，经测序可知质粒中包含序列表SEQ ID No. 1 中的碱基序列。实施例3抑菌应用1)迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德 华氏菌TX1 (保存于CGMCC，编号为CGMCC No. 2330)和哈氏弧菌T4(保存于CGMCC，编号为 CGMCC No. 1985)使菌悬液分别至0D_为0. 6，然后分别以5000g，4°C离心lOmin，分别收集菌体，将收集TX1菌体悬浮于PBS中至终浓度为5X106cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液； 将收集T4菌体悬浮于PBS中至终浓度为8X 107cfu/ml，即为哈氏弧菌悬液。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl，0. 02 % KC1，0. 358 % Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04，98. 798%蒸馏水。2)将96条大菱鲆(每条重约7g)随机分为4组，每组24条。将这4组分别命名 为A、B、C和D组。将A和C组的每条鱼腹腔注射lOOul具有序列表SEQ ID中的碱基序列 的质粒的PBS溶液，其中每lOOul含有2ug具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒。将B 和D组(对照组)的每条鱼腹腔注射lOOul PBS。2天后将A和B组鱼每条腹腔注射lOOul 上述步骤1)的迟缓爱德华氏菌悬液；将C和D组鱼每条腹腔注射lOOul上述步骤1)的哈 氏弧菌悬液。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼 的总死亡数目A组，6条；B组，16条，C组，4条；D组，14条。利用下列公式计算相对免疫 保护效率(RPS)RPS = 100 X (1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出pC205针对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的免疫保护效率分别为62. 5% 和 71. 4%。实施例4作为疫苗佐剂的应用1)哈氏弧菌悬液的制备，同实施例3中步骤1)。2)将72条大菱鲆随机分为3组，每组24条。将这3组分别命名为A、B和C 组。将A组的每条鱼腹腔注射lOOul含有15ug疫苗DegQ的PBS(DegQ为一种哈氏弧菌 ^SlSf ^JAL Zhang ff, Sun S, Cheng S, and Sun L. Characterization of DegQvh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl EnvironMicrobiol. 2008 ；74 :6254_6262.所得)，将 B 组的每条鱼腹腔注射 lOOul 含 有2ug具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒和15ug DegQ的PBS溶液，将C组(对照 组)的每条鱼腹腔注射lOOul PBS。4周后将3组鱼每条腹腔注射lOOul上述步骤1)的哈 氏弧菌悬液。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼 的总死亡数目A组，12条；B组，7条，C组，21条。由此得出疫苗DegQ的免疫保护效率为42. 9%，疫苗DegQ加具有序列表SEQID中 的碱基序列的质粒的免疫保护效率为66.7%。故具有序列表SEQ ID中的碱基序列将疫苗 DegQ的免疫保护效率提高了 23. 8%，即具有序列表SEQID中的碱基序列具有明显的免疫佐 齐U效应。结论具有序列表SEQ ID中的碱基序列既具有抑菌效应也具有疫苗佐剂效应。
权利要求
一种免疫识别分子标记，其特征在于免疫识别分子标记为大菱鲆特异性CpG-DNA序列，为序列表SEQ ID中的碱基序列所示。
2.一种按权利要求1所述的免疫识别分子标记的构建，其特征在于将质粒PCN3用 BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG20用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化入 大肠杆菌DH5 a后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取转化子， 提取质粒，即为具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的质粒；所述寡聚核苷酸CPG20为 5’ -GATCGATCGCGTGCGTGCGTCTAT-3’。
3.一种按权利要求1所述的免疫识别分子标记的应用，其特征在于所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染或作为疫苗佐剂，增强疫苗的特异性抑制致 病性细菌的侵染。
4.按权利要求3所述的免疫识别分子标记的应用，其特征在于所序列表SEQID中的 碱基序列能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。
5.按权利要求3所述的免疫识别分子标记的应用，其特征在于所述具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒的PBS溶液至浓度为20ug/ml，具有序列表SEQ ID中的碱基序列的 质粒的PBS溶液以100-120ul的剂量腹腔注射大菱鲆能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气 单胞菌侵染。
全文摘要
本本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种免疫识别分子标记及其构建和应用。免疫识别分子标记为大菱鲆特异性CpG-DNA序列，为序列表SEQ ID中的碱基序列所示。所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染或作为疫苗佐剂，增强疫苗的特异性抑制致病性细菌的侵染。本发明所得大菱鲆特异性CpG-DNA序列既有直接的抗菌能力又有疫苗佐剂作用，因而在大菱鲆病害防治中具有良好的应用前景。
文档编号A61P31/04GK101857861SQ201010151848
公开日2010年10月13日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者刘春胜, 孙黎 申请人:中国科学院海洋研究所
最新回复(0)