一种治疗骨损伤细胞注射剂及其制备方法
专利名称：一种治疗骨损伤细胞注射剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗骨损伤注射剂及其制备方法，适用于骨科对骨关节炎、股骨头坏死、骨折延迟愈合或不愈合的治疗，属于组织工程领域。
背景技术：
随着我国人均寿命的延长以及饮食结构的变化、生活水平的日益提高，骨损伤患者也越来越多。目前诸如关节炎、股骨头坏死、骨折延迟愈合或不愈合等最为常见，病发率每年都是呈增长趋势，这些疾病给人民群众的生活带来了很大的影响，但是从目前的治疗的手段来看，效果也都不是很明显。第一类骨损伤关节炎，关节炎是一种常见的慢性疾病，最常见的是骨关节炎和类风湿关节炎两种，我国目前关节炎患者估计有1亿以上，且人数还在不断增加，同时人到老年都患有不同程度的骨关节炎。骨性关节炎是一种最常见的关节病变，骨关节炎的名称极多，如肥大性骨关节炎、退行性关节炎、变性性关节炎、增生性骨关节炎或骨关节病，均指一种病，国内统一使用骨关节炎。骨关节炎病发原因主要有1、组织老化关节软骨退化；2、关节受伤导致软骨损坏；3、过度肥胖使关节承受力增加，软骨随之发生缺损；4、工作习惯引起，如长期坐姿导致关节软骨磨损；5、个体基因发生变化引起软骨病变。其患病率随着年龄而增加，女性比男性多发。骨性关节炎最常发病的部位是膝、手指、颈、腰椎等处，症状主要为关节疼痛、僵硬(经轻微活动后会觉疼痛减轻)，重者可出现关节肿胀、肌肉萎缩等。第二类股骨头坏死，股骨头坏死全称股骨头无菌性坏死，或股骨头缺血性坏死，是由于多种原因导致的股骨头局部血运不良，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷的一种病变。自1888年世界医学界首次认识股骨头坏死这一疾病至今，股骨头坏死已由少见病转变为多发病、常见病。尤其是激素的问世及其广泛应用以来，股骨头坏死的发病率逐渐上升。加之交通工具变革后交通事故的增多，人们生活方式的改变均使得该病患者数量剧增。据不完全统计，目前全世界股骨头坏死3000万人，我国约有400万人。股骨头坏死可发生于任何年龄但以31-60岁最多，无性别差异，任何年龄均可患病，而有过激素应用史、髋部外伤史、酗酒史、相关疾病史者发病的机率明显增多，开始多表现为髋关节或其周围关节的隐痛、钝痛，活动后加重，进一步发展可导致髋关节的功能障碍，股骨头坏死严重影响患者的生活质量和劳动能力，若治疗不及时，还可导致终身残疾。第三类骨折延迟愈合和骨折不愈合。骨折延迟愈合指骨折在预期的时间内没有完全愈合。骨折间隙内主要充满着肉芽组织或不成熟的骨组织。如后继治疗恰当，骨折仍可能愈合。延迟愈合的病人局部有压痛和间接叩击痛，伴不同程度肿胀，局部皮温可升高。延迟愈合病人局部可呈现异常活动，可伴有成角或短缩畸形。骨折不愈合指骨折在预期的时间内没有愈合，骨折处的细胞活动及愈合进程已完全停止，骨折间隙内为致密纤维组织。除非采取干预措施，否则骨折处将无法连接。治疗以上骨损伤目前主要通过(1)非药物治疗；(2)药物治疗；(3)手术治疗；(4) 自体软骨/成骨细胞移植等4种方法。非药物治疗、药物治疗和手术治疗的方法均不能从根本上改善软骨损伤，药物治疗只能短时间内减轻病患者的痛苦，而手术治疗的方法不仅价格昂贵，多数病患难以承受，同时手术治疗给病患带来的创伤大，另外手术技术含量要求较高，一般医院因条件不足难以实施。自体软骨/成骨细胞移植对软骨损伤能够起到一定的修复作用，但是因为取样软骨/成骨来自病患自身，这样就不可避免地对原有的健康部位造成一定的损伤，同时骨损伤的病发原因不仅仅是软骨/成骨受损，还与骨损伤部位局部微环境、血供不足等有关。自体软骨/成骨细胞植入术无法改变缺损部位的局部微环境， 势必不能对损伤部位进行根本性的治愈。
发明内容
针对以上骨损伤治疗方法的缺陷，本发明的目的是提供了一种安全、可靠、有效的治疗骨损伤产品。本发明所选用的种子细胞来源于患者骨髓，骨髓抽取手术简单快速，一般的临床医生均能够单独操作。抽取一定量的骨髓对患者自身的影响很小，一般术后一两天内即可出院恢复正常工作。本发明所采用的自体骨髓来源的间充质干细胞为多潜能干细胞，能够在体外诱导或者体内微环境的作用下分化为多种类型的细胞，包括软骨细胞、成骨细胞、血管内皮细胞等，同时本发明在扩增骨髓源间充质干细胞的过程中，未添加任何动物血清，有效的避免了异种病毒的传染，减小了细胞移植的风险。骨髓源间充质干细胞在移植到病变部位后，可以分泌大量的细胞因子如血管生长因子等，这样就可以促使病变部位血管再生，进而改善病变部位的血液循环。本发明利用组织工程技术将温敏型凝胶和自体骨髓源间充质干细胞按照 IX IO5 IO8个细胞与1 5ml生物材料相结合形成移植复合物，同时在复合物内添加一定量的自体血清营养因子，这样就可以有效的控制病患部位移植细胞的浓度，并提高了移植细胞的存活率。本发明的优点是利用自体骨髓来源的间充质干细胞结合生物材料组织工程技术治疗骨关节炎、股骨头坏死、骨折延迟愈合或不愈合等临床病例，避免了免疫排斥，安全有效。以注射剂的方式回注治疗骨损伤部位，手术时间短，实施简单，可操作性强，对病人造成的痛苦小。
具体实施例方式具体实施方式
一骨髓来源的间充质干细胞提取分离、培养与鉴定1.骨髓来源的间充质干细胞提取分离与培养(1)患者骨髓抽取采用髂前上棘取骨髓术的方法抽取患者骨髓。常规消毒、铺单，一侧或双侧髂前上棘处局部麻醉后，用骨穿刺针于双侧髂前上棘穿刺，经不同方向用IOml注射器取骨髓。(2)患者血液营养因子提取与保存采集骨髓的同时，收集患者一定量的血液，并于实验室内分离其中的营养成分 (血小板和血浆)，将分装完毕的血液营养因子置于_20°C冷冻保存，并对保存信息进行实时登记。
(3)骨髓间充质干细胞的提取分离将新鲜的患者骨髓用DMEM稀释后，将悬液加于Percoll分离液液面上。20°C， 2500r/min，离心 30min。去上清，吸取白膜层，PBS 洗 2 遍，20°C，1 800r/min，离心 lOmin。 用含10%病患自体血清提取的营养成分的DMEM悬浮细胞，计数，将细胞密度调至2X IO5/ ml，接种于75mL培养瓶中。置于C02培养箱中，37°C、饱和湿度、5% C02条件下培养。每隔 3天换液一次。待两周后骨髓间充质干细胞融合时，加入含0. 25% Trypsin-O. 02% EDTA消化液消化，中止消化后反复吹打细胞，洗涤后以一定比例分瓶接种，扩增细胞。(4)骨髓间充质干细胞的扩大培养根据患者的症状决定细胞的需求量，不断扩增细胞直至达到手术需求量。2.骨髓间充质干细胞的鉴定将第3、4、5代骨髓间充质干细胞用0. 25%胰酶消化，PBS洗涤2次，制备106/ml 单细胞悬液，分别加入荧光标记的⑶四、⑶90、⑶106、⑶105、⑶44、⑶71、⑶34、⑶45单克隆抗体，置4°C孵育30min，PBS洗涤2遍，加入500 μ IPBS混勻，进行流式细胞仪检测，同时设立同型IgG对照管。实验结果可以看出三代骨髓间充质干细胞⑶四、⑶44、⑶106、⑶71、 ⑶90、⑶105等多种表面抗原阳性，而抗原⑶34、⑶45阴性。
具体实施方式
二 骨髓间充质干细胞无外源动物血清的培养方法为了有效避免动物血清可能存在的病毒对细胞造成污染，本发明在培养骨髓间充质干细胞过程中，所使用的培养基中的添加物是从患者的血液中分离得到有效的营养成分血小板和血浆，并按照一定的比例与低糖DMEM基础培养基混合制备成完全培养基。
具体实施方式
三骨髓间充质干细胞与凝胶材料复合物安全性检测收集第三代至第五代的骨髓间充质干细胞，按照IX IO5 IO8个细胞与1 5ml 生物凝胶混合形成可注射型复合物，在其中添加一定量血液提取的生长因子。按照相关标准检测细胞的成活率、菌类、病毒、致瘤性，主要参照的标准有《中国药典》2005版第三部附录XII A第73页和《组织工程医疗产品第12部分细胞、组织、器官的加工指南》相关规定；《中国药典》2005版第三部附录规定；人的体细胞治疗申报临床试验指导原则、实验动物管理条例等。结果显示培养扩增的第三代到第五代的骨髓间充质干细胞与凝胶材料结合形成的复合物未受到任何微生物及病毒的污染，动物致瘤性实验未观察到动物体表及体内器官发生癌变。具体实施例方式四骨髓间充质干细胞与凝胶材料复合物的动物实验选取成年雄性Wistar大鼠若干只，利用半月板切除术诱发大鼠骨关节炎的发生。 骨关节炎大鼠分成实验组和对照组(药物组和安慰剂组)，实验组利用大鼠同种异体骨髓间充质干细胞注射剂(方法同本发明)治疗，药物对照组和安慰剂对照组分别使用治疗骨关节炎药物和生理盐水。在治疗的第1周、第2周、第4周、第6周、第8周观察骨关节炎大鼠的关节处局部活动状况，并于第4周、第8周解剖，病理切片观察，结果表明骨关节炎实验组在接受细胞移植后的活动状况明显好于药物组，安慰剂组最差。实验组损伤的骨关节处有移植的异体细胞存在，软骨恢复明显好于药物组和安慰剂组。具体烧伤例五自体骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的临床实验1.病例选择根据中华医学会骨科学分会骨关节炎诊治指南(2007年版)选择病例。优先选择关节肿大和关节僵硬的病患，所选病例均进行实验室检查(血常规、蛋白电泳、免疫复合物及血清补体等)和X线检查(观察非对称性关节间隙变化情况及有无关节边缘增生和关节积液)。2.治疗方法抽取患者骨髓后，提取分离骨髓间充质干细胞，体外扩增培养骨髓间充质干细胞， 同时按照具体实施方式
三的方法对骨髓间充质干细胞和凝胶复合物进行安全性检测。根据病患的症状制备一定量的注射剂，手术实施前，取20 50μ 1的复合物对临床试验患者进行皮试检测，观察有无免疫反应出现。经皮试后，患者未出项典型的免疫排斥反应。骨关节炎部位局部消毒麻醉后，注射本发明注射剂，注射部位为骨关节腔。手术结束后，冰敷注射部位1小时，病人留院观察2 3小时，注意病人注射部位有无红肿、疼痛等症状发生。3.效果分析患者接受手术后的第1周、第4周、第6周、第8周、第M周来院复诊，观察骨关节炎部位症状变化情况。并于第8周和第M周对注射部位进行X线观察。结果显示通过本发明注射剂治疗后，患者日常生活逐渐得到恢复，运动时的疼痛感有显著缓解。通过X线观察发现通过自体骨髓间充质干细胞与凝胶复合物的治疗，不但有效阻止了软骨缺损的发展趋势，同时原有软骨缺损部位也得到了一定程度的修复。
权利要求
1.一种治疗骨损伤注射剂及其制备方法，其特征在于取患者自体骨髓，经过分离提取、培养扩增后得到自体多潜能间充质干细胞，同时结合可降解、生物相容性好的温敏型凝胶材料形成可注射型复合物，注射部位主要为骨损伤部位，如骨关节腔、股骨头坏死处、骨折未愈合的腔隙处等。
2.如权利要求书所述治疗骨损伤注射剂，其特征在于骨髓间充质干细胞来源于自体，避免了免疫排斥和伦理问题，在其培养过程中利用自体血液有效营养成分作为细胞营养添加物，无外源动物血清，提高了细胞移植安全性；自体细胞植入骨损伤部位后能够分化为软骨或成骨细胞，修复骨缺损部位；
3.如权利要求书1所述治疗骨损伤注射剂制备的方法，其特征在于1X IO5 IO8个细胞与1 5ml生物支架材料混合形成复合物。
4.如权利要求书1所述骨损伤注射剂制备的方法，其特征在于生物材料为相容性好、 可降解的温敏型凝胶支架，主要为泊洛沙姆(poloxamer)凝胶，凝胶一细胞复合物内添加一定量的来源于自体的血清有效营养因子。
5.如权利要求书1所述的骨损伤注射剂制备的方法，其应用范围为骨关节炎、股骨头坏死、骨折延迟愈合或骨折不愈合的治疗。
全文摘要
本发明涉及了一种治疗骨损伤细胞注射剂及其制备方法，属于组织工程领域。该注射剂是由自体骨髓来源的间充质干细胞和温敏型凝胶及自体血液分离提取的有效营养因子组成的复合物。其制备方法是抽取患者骨髓后，分离提取骨髓间充质干细胞，扩增培养的过程中不添加任何动物源血清，按照1×105～108个细胞与1～5ml生物支架材料混合形成可注射型复合物。本发明的主要使用范围为骨损伤的治疗，包括骨关节炎、股骨头坏死及骨折延迟愈合和不愈合，使用方便，无免疫排斥现象，效果显著，能缓解病人因骨损伤所带来的巨大痛苦。
文档编号A61K35/28GK102232970SQ20101015246
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者董运海 申请人:董运海
技术领域：
本发明涉及一种治疗骨损伤注射剂及其制备方法，适用于骨科对骨关节炎、股骨头坏死、骨折延迟愈合或不愈合的治疗，属于组织工程领域。
背景技术：
随着我国人均寿命的延长以及饮食结构的变化、生活水平的日益提高，骨损伤患者也越来越多。目前诸如关节炎、股骨头坏死、骨折延迟愈合或不愈合等最为常见，病发率每年都是呈增长趋势，这些疾病给人民群众的生活带来了很大的影响，但是从目前的治疗的手段来看，效果也都不是很明显。第一类骨损伤关节炎，关节炎是一种常见的慢性疾病，最常见的是骨关节炎和类风湿关节炎两种，我国目前关节炎患者估计有1亿以上，且人数还在不断增加，同时人到老年都患有不同程度的骨关节炎。骨性关节炎是一种最常见的关节病变，骨关节炎的名称极多，如肥大性骨关节炎、退行性关节炎、变性性关节炎、增生性骨关节炎或骨关节病，均指一种病，国内统一使用骨关节炎。骨关节炎病发原因主要有1、组织老化关节软骨退化；2、关节受伤导致软骨损坏；3、过度肥胖使关节承受力增加，软骨随之发生缺损；4、工作习惯引起，如长期坐姿导致关节软骨磨损；5、个体基因发生变化引起软骨病变。其患病率随着年龄而增加，女性比男性多发。骨性关节炎最常发病的部位是膝、手指、颈、腰椎等处，症状主要为关节疼痛、僵硬(经轻微活动后会觉疼痛减轻)，重者可出现关节肿胀、肌肉萎缩等。第二类股骨头坏死，股骨头坏死全称股骨头无菌性坏死，或股骨头缺血性坏死，是由于多种原因导致的股骨头局部血运不良，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷的一种病变。自1888年世界医学界首次认识股骨头坏死这一疾病至今，股骨头坏死已由少见病转变为多发病、常见病。尤其是激素的问世及其广泛应用以来，股骨头坏死的发病率逐渐上升。加之交通工具变革后交通事故的增多，人们生活方式的改变均使得该病患者数量剧增。据不完全统计，目前全世界股骨头坏死3000万人，我国约有400万人。股骨头坏死可发生于任何年龄但以31-60岁最多，无性别差异，任何年龄均可患病，而有过激素应用史、髋部外伤史、酗酒史、相关疾病史者发病的机率明显增多，开始多表现为髋关节或其周围关节的隐痛、钝痛，活动后加重，进一步发展可导致髋关节的功能障碍，股骨头坏死严重影响患者的生活质量和劳动能力，若治疗不及时，还可导致终身残疾。第三类骨折延迟愈合和骨折不愈合。骨折延迟愈合指骨折在预期的时间内没有完全愈合。骨折间隙内主要充满着肉芽组织或不成熟的骨组织。如后继治疗恰当，骨折仍可能愈合。延迟愈合的病人局部有压痛和间接叩击痛，伴不同程度肿胀，局部皮温可升高。延迟愈合病人局部可呈现异常活动，可伴有成角或短缩畸形。骨折不愈合指骨折在预期的时间内没有愈合，骨折处的细胞活动及愈合进程已完全停止，骨折间隙内为致密纤维组织。除非采取干预措施，否则骨折处将无法连接。治疗以上骨损伤目前主要通过(1)非药物治疗；(2)药物治疗；(3)手术治疗；(4) 自体软骨/成骨细胞移植等4种方法。非药物治疗、药物治疗和手术治疗的方法均不能从根本上改善软骨损伤，药物治疗只能短时间内减轻病患者的痛苦，而手术治疗的方法不仅价格昂贵，多数病患难以承受，同时手术治疗给病患带来的创伤大，另外手术技术含量要求较高，一般医院因条件不足难以实施。自体软骨/成骨细胞移植对软骨损伤能够起到一定的修复作用，但是因为取样软骨/成骨来自病患自身，这样就不可避免地对原有的健康部位造成一定的损伤，同时骨损伤的病发原因不仅仅是软骨/成骨受损，还与骨损伤部位局部微环境、血供不足等有关。自体软骨/成骨细胞植入术无法改变缺损部位的局部微环境， 势必不能对损伤部位进行根本性的治愈。
发明内容
针对以上骨损伤治疗方法的缺陷，本发明的目的是提供了一种安全、可靠、有效的治疗骨损伤产品。本发明所选用的种子细胞来源于患者骨髓，骨髓抽取手术简单快速，一般的临床医生均能够单独操作。抽取一定量的骨髓对患者自身的影响很小，一般术后一两天内即可出院恢复正常工作。本发明所采用的自体骨髓来源的间充质干细胞为多潜能干细胞，能够在体外诱导或者体内微环境的作用下分化为多种类型的细胞，包括软骨细胞、成骨细胞、血管内皮细胞等，同时本发明在扩增骨髓源间充质干细胞的过程中，未添加任何动物血清，有效的避免了异种病毒的传染，减小了细胞移植的风险。骨髓源间充质干细胞在移植到病变部位后，可以分泌大量的细胞因子如血管生长因子等，这样就可以促使病变部位血管再生，进而改善病变部位的血液循环。本发明利用组织工程技术将温敏型凝胶和自体骨髓源间充质干细胞按照 IX IO5 IO8个细胞与1 5ml生物材料相结合形成移植复合物，同时在复合物内添加一定量的自体血清营养因子，这样就可以有效的控制病患部位移植细胞的浓度，并提高了移植细胞的存活率。本发明的优点是利用自体骨髓来源的间充质干细胞结合生物材料组织工程技术治疗骨关节炎、股骨头坏死、骨折延迟愈合或不愈合等临床病例，避免了免疫排斥，安全有效。以注射剂的方式回注治疗骨损伤部位，手术时间短，实施简单，可操作性强，对病人造成的痛苦小。
具体实施例方式具体实施方式
一骨髓来源的间充质干细胞提取分离、培养与鉴定1.骨髓来源的间充质干细胞提取分离与培养(1)患者骨髓抽取采用髂前上棘取骨髓术的方法抽取患者骨髓。常规消毒、铺单，一侧或双侧髂前上棘处局部麻醉后，用骨穿刺针于双侧髂前上棘穿刺，经不同方向用IOml注射器取骨髓。(2)患者血液营养因子提取与保存采集骨髓的同时，收集患者一定量的血液，并于实验室内分离其中的营养成分 (血小板和血浆)，将分装完毕的血液营养因子置于_20°C冷冻保存，并对保存信息进行实时登记。
(3)骨髓间充质干细胞的提取分离将新鲜的患者骨髓用DMEM稀释后，将悬液加于Percoll分离液液面上。20°C， 2500r/min，离心 30min。去上清，吸取白膜层，PBS 洗 2 遍，20°C，1 800r/min，离心 lOmin。 用含10%病患自体血清提取的营养成分的DMEM悬浮细胞，计数，将细胞密度调至2X IO5/ ml，接种于75mL培养瓶中。置于C02培养箱中，37°C、饱和湿度、5% C02条件下培养。每隔 3天换液一次。待两周后骨髓间充质干细胞融合时，加入含0. 25% Trypsin-O. 02% EDTA消化液消化，中止消化后反复吹打细胞，洗涤后以一定比例分瓶接种，扩增细胞。(4)骨髓间充质干细胞的扩大培养根据患者的症状决定细胞的需求量，不断扩增细胞直至达到手术需求量。2.骨髓间充质干细胞的鉴定将第3、4、5代骨髓间充质干细胞用0. 25%胰酶消化，PBS洗涤2次，制备106/ml 单细胞悬液，分别加入荧光标记的⑶四、⑶90、⑶106、⑶105、⑶44、⑶71、⑶34、⑶45单克隆抗体，置4°C孵育30min，PBS洗涤2遍，加入500 μ IPBS混勻，进行流式细胞仪检测，同时设立同型IgG对照管。实验结果可以看出三代骨髓间充质干细胞⑶四、⑶44、⑶106、⑶71、 ⑶90、⑶105等多种表面抗原阳性，而抗原⑶34、⑶45阴性。
具体实施方式
二 骨髓间充质干细胞无外源动物血清的培养方法为了有效避免动物血清可能存在的病毒对细胞造成污染，本发明在培养骨髓间充质干细胞过程中，所使用的培养基中的添加物是从患者的血液中分离得到有效的营养成分血小板和血浆，并按照一定的比例与低糖DMEM基础培养基混合制备成完全培养基。
具体实施方式
三骨髓间充质干细胞与凝胶材料复合物安全性检测收集第三代至第五代的骨髓间充质干细胞，按照IX IO5 IO8个细胞与1 5ml 生物凝胶混合形成可注射型复合物，在其中添加一定量血液提取的生长因子。按照相关标准检测细胞的成活率、菌类、病毒、致瘤性，主要参照的标准有《中国药典》2005版第三部附录XII A第73页和《组织工程医疗产品第12部分细胞、组织、器官的加工指南》相关规定；《中国药典》2005版第三部附录规定；人的体细胞治疗申报临床试验指导原则、实验动物管理条例等。结果显示培养扩增的第三代到第五代的骨髓间充质干细胞与凝胶材料结合形成的复合物未受到任何微生物及病毒的污染，动物致瘤性实验未观察到动物体表及体内器官发生癌变。具体实施例方式四骨髓间充质干细胞与凝胶材料复合物的动物实验选取成年雄性Wistar大鼠若干只，利用半月板切除术诱发大鼠骨关节炎的发生。 骨关节炎大鼠分成实验组和对照组(药物组和安慰剂组)，实验组利用大鼠同种异体骨髓间充质干细胞注射剂(方法同本发明)治疗，药物对照组和安慰剂对照组分别使用治疗骨关节炎药物和生理盐水。在治疗的第1周、第2周、第4周、第6周、第8周观察骨关节炎大鼠的关节处局部活动状况，并于第4周、第8周解剖，病理切片观察，结果表明骨关节炎实验组在接受细胞移植后的活动状况明显好于药物组，安慰剂组最差。实验组损伤的骨关节处有移植的异体细胞存在，软骨恢复明显好于药物组和安慰剂组。具体烧伤例五自体骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的临床实验1.病例选择根据中华医学会骨科学分会骨关节炎诊治指南(2007年版)选择病例。优先选择关节肿大和关节僵硬的病患，所选病例均进行实验室检查(血常规、蛋白电泳、免疫复合物及血清补体等)和X线检查(观察非对称性关节间隙变化情况及有无关节边缘增生和关节积液)。2.治疗方法抽取患者骨髓后，提取分离骨髓间充质干细胞，体外扩增培养骨髓间充质干细胞， 同时按照具体实施方式
三的方法对骨髓间充质干细胞和凝胶复合物进行安全性检测。根据病患的症状制备一定量的注射剂，手术实施前，取20 50μ 1的复合物对临床试验患者进行皮试检测，观察有无免疫反应出现。经皮试后，患者未出项典型的免疫排斥反应。骨关节炎部位局部消毒麻醉后，注射本发明注射剂，注射部位为骨关节腔。手术结束后，冰敷注射部位1小时，病人留院观察2 3小时，注意病人注射部位有无红肿、疼痛等症状发生。3.效果分析患者接受手术后的第1周、第4周、第6周、第8周、第M周来院复诊，观察骨关节炎部位症状变化情况。并于第8周和第M周对注射部位进行X线观察。结果显示通过本发明注射剂治疗后，患者日常生活逐渐得到恢复，运动时的疼痛感有显著缓解。通过X线观察发现通过自体骨髓间充质干细胞与凝胶复合物的治疗，不但有效阻止了软骨缺损的发展趋势，同时原有软骨缺损部位也得到了一定程度的修复。
权利要求
1.一种治疗骨损伤注射剂及其制备方法，其特征在于取患者自体骨髓，经过分离提取、培养扩增后得到自体多潜能间充质干细胞，同时结合可降解、生物相容性好的温敏型凝胶材料形成可注射型复合物，注射部位主要为骨损伤部位，如骨关节腔、股骨头坏死处、骨折未愈合的腔隙处等。
2.如权利要求书所述治疗骨损伤注射剂，其特征在于骨髓间充质干细胞来源于自体，避免了免疫排斥和伦理问题，在其培养过程中利用自体血液有效营养成分作为细胞营养添加物，无外源动物血清，提高了细胞移植安全性；自体细胞植入骨损伤部位后能够分化为软骨或成骨细胞，修复骨缺损部位；
3.如权利要求书1所述治疗骨损伤注射剂制备的方法，其特征在于1X IO5 IO8个细胞与1 5ml生物支架材料混合形成复合物。
4.如权利要求书1所述骨损伤注射剂制备的方法，其特征在于生物材料为相容性好、 可降解的温敏型凝胶支架，主要为泊洛沙姆(poloxamer)凝胶，凝胶一细胞复合物内添加一定量的来源于自体的血清有效营养因子。
5.如权利要求书1所述的骨损伤注射剂制备的方法，其应用范围为骨关节炎、股骨头坏死、骨折延迟愈合或骨折不愈合的治疗。
全文摘要
本发明涉及了一种治疗骨损伤细胞注射剂及其制备方法，属于组织工程领域。该注射剂是由自体骨髓来源的间充质干细胞和温敏型凝胶及自体血液分离提取的有效营养因子组成的复合物。其制备方法是抽取患者骨髓后，分离提取骨髓间充质干细胞，扩增培养的过程中不添加任何动物源血清，按照1×105～108个细胞与1～5ml生物支架材料混合形成可注射型复合物。本发明的主要使用范围为骨损伤的治疗，包括骨关节炎、股骨头坏死及骨折延迟愈合和不愈合，使用方便，无免疫排斥现象，效果显著，能缓解病人因骨损伤所带来的巨大痛苦。
文档编号A61K35/28GK102232970SQ20101015246
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者董运海 申请人:董运海
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