一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊及其制备方法
专利名称：一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及基因重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)脂质 体肠溶胶囊及其制备方法，特别涉及重组人铜_锌超氧化物歧化酶的脂质体包埋技术及肠 溶胶囊制备方法。
背景技术：
目前，人们认为自由基(也称游离基)与大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓自 由基就是当机体进行代谢时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基 很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，使被夺去电子的分子 也变成自由基。自由基有多种，如超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由 基等。由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起生物细胞膜 上的脂质过氧化，破坏膜的结构和功能。自由基也可以引起蛋白质变性和交联，使体内的许 多酶及激素失去生物活性，降低机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等，同时还能破 坏核酸结构和导致整个机体代谢失常，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾， 是促使某些疾病发生和机体衰老的根本原因。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下人体细胞内也存在着清 除自由基、抑制自由基反应的体系，它们有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。超氧化 物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基， 在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。SOD能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而 造成的机体损害，如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等。实验证明，SOD解 毒反应过程主要分两步第一步是作为有害物质的超氧阴离子在SOD的作用下和氢离子反 应，生成另一种物质_过氧化氢；第二步是，过氧化氢又在过氧化氢酶的作用下和氢反应， 最终生成了一种对人体无害的物质_水。超氧化物歧化酶(SOD)是目前临床上常用的治疗药物，可以制成SOD注射剂、SOD 口服液、SOD胶囊等。SOD注射剂采用直接注射给药的方式，避免了药物在胃肠道中被强酸 和蛋白酶的降解，因此作用显著，但缺点在于需要注射给药，给患者带来痛苦；SOD 口服液 和SOD胶囊采用口服给药，患者容易接受，但是由于SOD在消化系统中有较大的破坏，因此 大大影响其效果。本发明正是针对该问题，提出了采用脂质体包埋技术，制备SOD脂质体肠 溶胶囊，大大提高了 SOD的吸收率，延长了 SOD在体内的半衰期。另一方面，目前国内生产的SOD主要为猪血或牛血中提取SOD制品，存在着含量 低、提取成本高、原料不足等问题，而微生物发酵生产SOD的研究报道较少，如在申请号 01106224. X，申请日2001年02月27日的“SOD乳酸菌生产技术”，乳酸菌表达机制复杂， 营养物质的利用力低，产SOD量有限；代谢产乳酸易使培养环境的pH降低，影响SOD酶活 力。期刊号CNKI SUNiffSffX. 0. 1999-01-002的“酵母菌中超氧化物歧化酶的研究”，是通过筛选自身高表达超氧化物歧化酶的酵母为主的发酵提纯技术。酵母自身产超氧化物歧化 酶受自身机制调控，限定在一个较窄的范围内；细胞内提取中杂蛋白较多，工艺复杂，提取 过程酶损失较大，酶活的影响也较大。基因工程发酵生产SOD的研究报道更少，如申请号 97103939. 9的“重组人源铜-锌超氧化物歧化酶制备工艺”，工程菌表达的重组人铜_锌 超氧化物歧化酶为包涵体形式存在，纯化过程中采用超声破碎菌体，有机溶剂洗涤，这些过 程会有大量目的蛋白损失，而复性难度也较大，酶活较低。采用基因工程技术生产重组人 铜-锌S0D，再采用脂质体包埋技术制备重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体 肠溶胶囊则未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种采用基因工程技术制备人铜_锌超氧化物歧化 酶(Cu-Zn SOD)的方法，保持其应有的活性。本发明的第二个目的在于提供一种采用脂质体包埋技术，将上述人铜_锌超氧化 物歧化酶进行包埋，以提高其在人体中的吸收率。本发明的第三个目的在于提供一种含有上述人铜_锌超氧化物岐化酶脂质体肠 溶胶囊的保健食品。本发明的第一个目的通过以下工艺步骤实现1、分泌表达重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的毕赤酵母菌种的构建 对人铜-锌超氧化物歧化酶进行基因测序，并对基因序列进行密码子优化，优化后的序列 为ATGGCTACTAAAGCTGTTTGTGTTTTGAAGGGTGATGGTCCAGTTCAAGGTATTATCAACTTTGAACAAAAGGAATCTAACGGTCCTGTAAAAGTTTGGGGTTCTATTAAGGGTTTGACTGAAGGTTTGCATGGTTTTCATGTCCATGAATTTGGTGATAACACTGCCGGATGTACTTCTGCTGGTCCACATTTTAACCCATTGTCTAGAAAGCACGGTGGTCCAAAGGATGAAGAAAGACATGTTGGCGATTTGGGTAACGTAACTGCTGATAAAGATGGTGTTGCTGACGTTTCTATTGAAGATTCTGTTATTTCTTTGTCTGGTGATCATTGCATTATTGGTAGAACTTTGGTTGTTCACGAGAAGGCTGATGATTTAGGTAAGGGTGGTAATGAAGAGTCTACTAAGACTGGTAACGCTGGTTCTAGATTGGCTTGCGGTGTTATAGGTATTGCTCAATAA优化的基因序列重组载入表达载体pPIC9k质粒中，重组为pPIC9K_hS0D工程质 粒。工程质粒重新转化、扩增，扩增质粒用Sal I完全酶切后转入毕赤酵母KM71菌株，在MD 平板上筛选阳性克隆。2、分泌表达重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的毕赤酵母菌的发酵工 艺2. 1菌种活化及扩增挑选MD平板阳性克隆单菌落，无菌环境下接种于60ml YPD配养基中，于摇床 30°C,250rpm活化10小时；活化的菌种按10%接种量分别接种于3个装有200mlYPD培养 基的500ml的锥形瓶中，30°C、250rpm活化10小时。按上述发酵条件和发酵时间扩增500ml菌种。2. 2发酵培养将500ml菌种接种于IOL发酵罐中，发酵罐装量为5L，发酵培养基为BMGY培养基， 发酵条件为转速400rpm ；pH 5. 0-5. 5 ；温度27°C -30°C ；溶氧40%以上；培养时间16小 时。培养16小时后对培养基进行补料，补料分2阶段，第一阶段补料培养基为 2XBMMY+6%甲醇；pH 5. 3 ；补料体积为10%发酵罐体积量。补料约5小时结束，发酵进入 诱导表达期。诱导期条件控制转速400rpm ；pH 4. 9-5. 2 ；温度26°C -28°C ；溶氧40%以 上，培养时间6天。第一阶段补料结束后，进行第二阶段补料，第二阶段补料培养基为分析纯甲醇。 甲醇控制量为总量占培养基的0. 6%，连续补加甲醇6天。每天取样检测目的蛋白表达量和 菌体湿重，约6天后表达达到最大值，即可放罐。上述步骤中培养基的配方为
MD 平板YNB 1. 34%、葡萄糖 0. 5%、琼脂 2% ；YPD培养基酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖0.5% ；BMGY培养基酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖0.5%、0.05mol/L磷酸盐缓冲液、 3(^11101/1硫酸铜、3(^11101/1 氯化锌、1. 34% YNB ；BMMY培养基酵母粉1%、蛋白胨2%、甲醇0. 5%、0.05mol/L磷酸盐缓冲液、 1. 34% YNB。3、基因重组人铜_锌超氧化物歧化酶的纯化发酵液经离心，取上清，再通过超滤浓缩，盐析，得到的盐析物为Cu-Zn SOD粗蛋 白，再溶解后脱盐，然后超滤浓缩、冻干，得到的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)冻干 粉纯度达93%以上，同时纯化过程酶活损失小，冻干粉酶比活可达18000U/mg以上。4、制备人铜-锌超氧化物歧化酶脂质体将磷脂、聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺、胆固 醇溶于适量的乙醇中，将人Cu-Zn超氧化物歧化酶用缓冲液溶解，在氮气的保护条件下将 两种溶液混勻，在高压均质机的作用下，即得人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体溶液。将该脂 质体药物溶液反复用超滤器超滤除去溶剂，并以0. 9%氯化钠溶液作补充液。将超滤液冷冻 干燥，除去水分，将内容物收集，即人铜_锌超氧化物歧化酶脂质体。该技术制备的重组人 铜_锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体包封率为80. 54 士 2. 26%。5、人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊的制备人铜-锌超氧化物 歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体-35%;低聚木糖20%-50%;维生素E0. 2%-10%;维生 素C 2%-10%;甘露醇10%-60%。将上述制备好的Cu-Zn SOD脂质体按量加入低聚木糖、 维生素E、维生素C、甘露醇和医用淀粉，搅勻，装入肠溶空心胶囊，即得人铜-锌超氧化物歧 化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊。该技术制备的重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn S0D) 脂质体肠溶胶囊体外模拟胃酸、胃蛋白酶、胰酶耐受力分别为95. 2%、91. 6%、86. 2%。
具体实施例方式本发明可以通过发明内容中说明的技术具体实施，通过下面的实施例可以对本发 明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
实施例1 (1)菌种筛选及扩增挑选MD平板阳性克隆单菌落，无菌环境下接种于60ml YPD配养基中，于摇床30°C、250rpm活化10小时；活化的菌种按10%接种量分别接种于3个装 有200ml YPD培养基的500ml的锥形瓶中，30°C、250rpm活化10小时。按上述发酵条件和 发酵时间扩增600ml菌种。(2)发酵培养将500ml菌种接种于IOL发酵罐中，发酵罐装量为5L，发酵培养 基为BMGY培养基，发酵条件为转速400rpm;pH 5. 0 ；温度30°C ；溶氧40%以上；培养 时间16小时。培养16小时后对培养基进行补料，补料分2阶段，第一阶段补料培养基为 2XBMMY+6%甲醇；pH 5. 3 ；补料体积为10%发酵罐体积量。补料约5小时结束，发酵进入 诱导表达期。诱导期条件控制转速400rpm ;pH 4. 9 ；温度26°C ；溶氧40%以上，培养时 间6天。第一阶段补料结束后，进行第二阶段补料，第二阶段补料培养基为纯甲醇。甲醇 控制量为总量占培养基的0. 6%，连续补加甲醇6天。每天取样检测目的蛋白表达量和菌体 湿重，约6天后表达达到最大值，即可放罐。(3)基因重组人铜-锌超氧化物歧化酶的纯化发酵液经离心，取上清，再通过超 滤浓缩，盐析，得到的盐析物为Cu-Zn SOD粗蛋白，再溶解后脱盐，然后超滤浓缩、冻干，得到 的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)冻干粉纯度达93. 22%，同时纯化过程酶活损失 小，冻干粉酶比活可达18250U/mg。(4)制备人铜-锌超氧化物歧化酶脂质体将磷脂、聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺、胆 固醇溶于适量的乙醇中，将人Cu-Zn超氧化物歧化酶用缓冲液溶解，在氮气的保护条件下 将两种溶液混勻，在高压均质机的作用下，即得人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体溶液。将该 脂质体药物溶液反复用超滤器超滤除去溶剂，并以0.9%氯化钠溶液作补充液。将超滤液冷 冻干燥，除去水分，将内容物收集，即人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体。该技术制备的重组 人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体包封率为80. 54%。各成分比例为人铜锌-超氧化物歧化酶 8%卵磷脂60%胆固醇 %聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 20%维生素E5%(5)人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊的制备人铜-锌超氧化 物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体5% ；低聚木糖40% ；维生素E 2% ；维生素C 3% ；甘露醇 30%;医用淀粉20%。将上述制备好的Cu-Zn SOD脂质体按量加入维生素E、维生素C和医 用淀粉，搅勻，装入肠溶空心胶囊，即得人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊。实施例2:(1)菌种筛选及扩增挑选MD平板阳性克隆单菌落，无菌环境下接种于60ml YPD 配养基中，于摇床30°C、250rpm活化10小时；活化的菌种按10%接种量分别接种于3个装 有200ml YPD培养基的500ml的锥形瓶中，30°C、250rpm活化10小时。按上述发酵条件和 发酵时间扩增600ml菌种。(2)发酵培养将500ml菌种接种于10L发酵罐中，发酵罐装量为5L，发酵培养 基为BMGY培养基，发酵条件为转速400rpm;pH 5. 5 ；温度30°C ；溶氧40%以上；培养时间16小时。培养16小时后对培养基进行补料，补料分2阶段，第一阶段补料培养基为 2XBMMY+6%甲醇；pH 5. 3 ；补料体积为10%发酵罐体积量。补料约5小时结束，发酵进入 诱导表达期。诱导期条件控制转速400rpm ;pH 5. 2 ；温度28°C ；溶氧40%以上，培养时 间6天。第一阶段补料结束后，进行第二阶段补料，第二阶段补料培养基为纯甲醇。甲醇 控制量为总量占培养基的0. 6%，连续补加甲醇6天。每天取样检测目的蛋白表达量和菌体 湿重，约6天后表达达到最大值，即可放罐。(3)基因重组人铜-锌超氧化物歧化酶的纯化发酵液经离心，取上清，再通过超 滤浓缩，盐析，得到的盐析物为Cu-Zn SOD粗蛋白，再溶解后脱盐，然后超滤浓缩、冻干，得到 的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)冻干粉纯度达93. 40%，同时纯化过程酶活损失 小，冻干粉酶比活可达18350U/mg。(4)制备人铜_锌超氧化物歧化酶脂质体将磷脂、聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺、胆 固醇溶于适量的乙醇中，将人Cu-Zn超氧化物歧化酶用缓冲液溶解，在氮气的保护条件下 将两种溶液混勻，在高压均质机的作用下，即得人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体溶液。将该 脂质体药物溶液反复用超滤器超滤除去溶剂，并以0. 9%氯化钠溶液作补充液。将超滤液冷 冻干燥，除去水分，将内容物收集，即人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体。该技术制备的重组 人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体包封率为82. 11%。各成分比例为人铜-锌超氧化物歧化酶 10%卵磷脂70%胆固醇6%聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 20%维生素E4%(5)人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊的制备人铜-锌超氧化物 歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体10% ；低聚木糖30% ；维生素E 5% ；维生素C 5% ；甘露醇 20%;医用淀粉30%。将上述制备好的Cu-Zn SOD脂质体按量加入维生素E、维生素C和医 用淀粉，搅勻，装入肠溶空心胶囊，即得人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊。
权利要求
一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊及其制备方法，其特征在于；a)构建分泌表达重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的毕赤酵母工程菌菌种；b)经a)步骤获得的工程菌菌种经筛选，筛选后的菌种用于重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的发酵工艺；c)经b)步骤获得的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)原料，应用于脂质体包埋技术制备人铜-锌超氧化物歧化酶脂质体；d)人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体肠溶胶囊制备技术。
2.根据权利要求书1所述的一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊及 其制备方法，其分泌表达重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的毕赤酵母菌种构建 特征根据毕赤酵母的表达机制，通过基因工程手段对人铜_锌超氧化物歧化酶进行基因 测序，并对基因序列进行密码子优化。优化的基因序列重组载入表达载体pPIC9k质粒中， 重组为pPIC9K-hS0D工程质粒。工程质粒重新转化、扩增，扩增质粒用Sal I完全酶切后电 转入毕赤酵母KM71菌株，在MD平板上筛选阳性克隆。
3.根据权利要求书1所述的一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体胶囊及其 制备方法，其重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的发酵工艺特征平板筛选的工程 菌经摇床活化、发酵罐扩增，最终按10%的接种量接入10吨发酵罐中进行培养。通过对发 酵培养阶段条件和发酵诱导期阶段条件的严格控制，使菌密度和酶表达量达到最大化，获 得高产人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)。发酵液经离心、超滤浓缩、盐析、脱盐、冻干 后，得到的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)纯度达93%以上，同时纯化过程酶活损失 小，酶比活可达18000U/mg以上。
4.根据权利要求书1所述的一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊及 其制备方法，其人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体包埋技术特征脂质体包材 采用粘膜吸收促透剂的磷脂50% -80%;脂质体包材的胆固醇0. 5% -8%;抗氧化剂的维生 素E 0% -8% ；聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺2% -20% ；人铜-锌超氧化物歧化酶-50%。 上述化合物制备的Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊能有效地延长药物的半衰期。
5.根据权利要求书1所述的一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体胶囊及 其制备方法，其人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体胶囊制备技术特征人 铜_锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体-35% ；低聚木糖20% -50% ；维生素E 0. 2% -10% ；维生素C 2% -10% ；甘露醇10% -60%。上述成分混合均勻后装入胶囊，该 填充胶囊膜为不被胃液分解和破坏的肠溶胶囊。
全文摘要
一种基因重组人超氧化物歧化酶脂质体胶囊的制备方法，是将工程菌发酵获得的人Cu-Zn超氧化物歧化酶(比活力18000U/mg)包埋于脂质体中，制备得到Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体胶囊。脂质体包材采用粘膜吸收促透剂的磷脂和胆固醇，再加入抗氧化剂的维生素E，采用保护脂质体药物不被胃液分解和破坏的肠溶胶囊，避免药物的破坏，可增强人Cu-Zn超氧化物歧化酶通过肠粘膜的吸收，提高血药浓度和药效，更好的去除人体自由基，延缓衰老。该技术制备的重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体包封率为80.54±2.26％，肠溶胶囊体外模拟胃酸、胃蛋白酶、胰酶耐受力分别为95.2％、91.6％、86.2％。
文档编号A61K9/48GK101816781SQ201010152650
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者梁华正, 楼秀余, 蔡刚, 赖建炫, 黄建荣 申请人:江西宇骏生物工程有限公司
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及基因重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)脂质 体肠溶胶囊及其制备方法，特别涉及重组人铜_锌超氧化物歧化酶的脂质体包埋技术及肠 溶胶囊制备方法。
背景技术：
目前，人们认为自由基(也称游离基)与大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓自 由基就是当机体进行代谢时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基 很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，使被夺去电子的分子 也变成自由基。自由基有多种，如超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由 基等。由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起生物细胞膜 上的脂质过氧化，破坏膜的结构和功能。自由基也可以引起蛋白质变性和交联，使体内的许 多酶及激素失去生物活性，降低机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等，同时还能破 坏核酸结构和导致整个机体代谢失常，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾， 是促使某些疾病发生和机体衰老的根本原因。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下人体细胞内也存在着清 除自由基、抑制自由基反应的体系，它们有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。超氧化 物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基， 在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。SOD能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而 造成的机体损害，如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等。实验证明，SOD解 毒反应过程主要分两步第一步是作为有害物质的超氧阴离子在SOD的作用下和氢离子反 应，生成另一种物质_过氧化氢；第二步是，过氧化氢又在过氧化氢酶的作用下和氢反应， 最终生成了一种对人体无害的物质_水。超氧化物歧化酶(SOD)是目前临床上常用的治疗药物，可以制成SOD注射剂、SOD 口服液、SOD胶囊等。SOD注射剂采用直接注射给药的方式，避免了药物在胃肠道中被强酸 和蛋白酶的降解，因此作用显著，但缺点在于需要注射给药，给患者带来痛苦；SOD 口服液 和SOD胶囊采用口服给药，患者容易接受，但是由于SOD在消化系统中有较大的破坏，因此 大大影响其效果。本发明正是针对该问题，提出了采用脂质体包埋技术，制备SOD脂质体肠 溶胶囊，大大提高了 SOD的吸收率，延长了 SOD在体内的半衰期。另一方面，目前国内生产的SOD主要为猪血或牛血中提取SOD制品，存在着含量 低、提取成本高、原料不足等问题，而微生物发酵生产SOD的研究报道较少，如在申请号 01106224. X，申请日2001年02月27日的“SOD乳酸菌生产技术”，乳酸菌表达机制复杂， 营养物质的利用力低，产SOD量有限；代谢产乳酸易使培养环境的pH降低，影响SOD酶活 力。期刊号CNKI SUNiffSffX. 0. 1999-01-002的“酵母菌中超氧化物歧化酶的研究”，是通过筛选自身高表达超氧化物歧化酶的酵母为主的发酵提纯技术。酵母自身产超氧化物歧化 酶受自身机制调控，限定在一个较窄的范围内；细胞内提取中杂蛋白较多，工艺复杂，提取 过程酶损失较大，酶活的影响也较大。基因工程发酵生产SOD的研究报道更少，如申请号 97103939. 9的“重组人源铜-锌超氧化物歧化酶制备工艺”，工程菌表达的重组人铜_锌 超氧化物歧化酶为包涵体形式存在，纯化过程中采用超声破碎菌体，有机溶剂洗涤，这些过 程会有大量目的蛋白损失，而复性难度也较大，酶活较低。采用基因工程技术生产重组人 铜-锌S0D，再采用脂质体包埋技术制备重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体 肠溶胶囊则未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种采用基因工程技术制备人铜_锌超氧化物歧化 酶(Cu-Zn SOD)的方法，保持其应有的活性。本发明的第二个目的在于提供一种采用脂质体包埋技术，将上述人铜_锌超氧化 物歧化酶进行包埋，以提高其在人体中的吸收率。本发明的第三个目的在于提供一种含有上述人铜_锌超氧化物岐化酶脂质体肠 溶胶囊的保健食品。本发明的第一个目的通过以下工艺步骤实现1、分泌表达重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的毕赤酵母菌种的构建 对人铜-锌超氧化物歧化酶进行基因测序，并对基因序列进行密码子优化，优化后的序列 为ATGGCTACTAAAGCTGTTTGTGTTTTGAAGGGTGATGGTCCAGTTCAAGGTATTATCAACTTTGAACAAAAGGAATCTAACGGTCCTGTAAAAGTTTGGGGTTCTATTAAGGGTTTGACTGAAGGTTTGCATGGTTTTCATGTCCATGAATTTGGTGATAACACTGCCGGATGTACTTCTGCTGGTCCACATTTTAACCCATTGTCTAGAAAGCACGGTGGTCCAAAGGATGAAGAAAGACATGTTGGCGATTTGGGTAACGTAACTGCTGATAAAGATGGTGTTGCTGACGTTTCTATTGAAGATTCTGTTATTTCTTTGTCTGGTGATCATTGCATTATTGGTAGAACTTTGGTTGTTCACGAGAAGGCTGATGATTTAGGTAAGGGTGGTAATGAAGAGTCTACTAAGACTGGTAACGCTGGTTCTAGATTGGCTTGCGGTGTTATAGGTATTGCTCAATAA优化的基因序列重组载入表达载体pPIC9k质粒中，重组为pPIC9K_hS0D工程质 粒。工程质粒重新转化、扩增，扩增质粒用Sal I完全酶切后转入毕赤酵母KM71菌株，在MD 平板上筛选阳性克隆。2、分泌表达重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的毕赤酵母菌的发酵工 艺2. 1菌种活化及扩增挑选MD平板阳性克隆单菌落，无菌环境下接种于60ml YPD配养基中，于摇床 30°C,250rpm活化10小时；活化的菌种按10%接种量分别接种于3个装有200mlYPD培养 基的500ml的锥形瓶中，30°C、250rpm活化10小时。按上述发酵条件和发酵时间扩增500ml菌种。2. 2发酵培养将500ml菌种接种于IOL发酵罐中，发酵罐装量为5L，发酵培养基为BMGY培养基， 发酵条件为转速400rpm ；pH 5. 0-5. 5 ；温度27°C -30°C ；溶氧40%以上；培养时间16小 时。培养16小时后对培养基进行补料，补料分2阶段，第一阶段补料培养基为 2XBMMY+6%甲醇；pH 5. 3 ；补料体积为10%发酵罐体积量。补料约5小时结束，发酵进入 诱导表达期。诱导期条件控制转速400rpm ；pH 4. 9-5. 2 ；温度26°C -28°C ；溶氧40%以 上，培养时间6天。第一阶段补料结束后，进行第二阶段补料，第二阶段补料培养基为分析纯甲醇。 甲醇控制量为总量占培养基的0. 6%，连续补加甲醇6天。每天取样检测目的蛋白表达量和 菌体湿重，约6天后表达达到最大值，即可放罐。上述步骤中培养基的配方为
MD 平板YNB 1. 34%、葡萄糖 0. 5%、琼脂 2% ；YPD培养基酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖0.5% ；BMGY培养基酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖0.5%、0.05mol/L磷酸盐缓冲液、 3(^11101/1硫酸铜、3(^11101/1 氯化锌、1. 34% YNB ；BMMY培养基酵母粉1%、蛋白胨2%、甲醇0. 5%、0.05mol/L磷酸盐缓冲液、 1. 34% YNB。3、基因重组人铜_锌超氧化物歧化酶的纯化发酵液经离心，取上清，再通过超滤浓缩，盐析，得到的盐析物为Cu-Zn SOD粗蛋 白，再溶解后脱盐，然后超滤浓缩、冻干，得到的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)冻干 粉纯度达93%以上，同时纯化过程酶活损失小，冻干粉酶比活可达18000U/mg以上。4、制备人铜-锌超氧化物歧化酶脂质体将磷脂、聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺、胆固 醇溶于适量的乙醇中，将人Cu-Zn超氧化物歧化酶用缓冲液溶解，在氮气的保护条件下将 两种溶液混勻，在高压均质机的作用下，即得人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体溶液。将该脂 质体药物溶液反复用超滤器超滤除去溶剂，并以0. 9%氯化钠溶液作补充液。将超滤液冷冻 干燥，除去水分，将内容物收集，即人铜_锌超氧化物歧化酶脂质体。该技术制备的重组人 铜_锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体包封率为80. 54 士 2. 26%。5、人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊的制备人铜-锌超氧化物 歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体-35%;低聚木糖20%-50%;维生素E0. 2%-10%;维生 素C 2%-10%;甘露醇10%-60%。将上述制备好的Cu-Zn SOD脂质体按量加入低聚木糖、 维生素E、维生素C、甘露醇和医用淀粉，搅勻，装入肠溶空心胶囊，即得人铜-锌超氧化物歧 化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊。该技术制备的重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn S0D) 脂质体肠溶胶囊体外模拟胃酸、胃蛋白酶、胰酶耐受力分别为95. 2%、91. 6%、86. 2%。
具体实施例方式本发明可以通过发明内容中说明的技术具体实施，通过下面的实施例可以对本发 明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
实施例1 (1)菌种筛选及扩增挑选MD平板阳性克隆单菌落，无菌环境下接种于60ml YPD配养基中，于摇床30°C、250rpm活化10小时；活化的菌种按10%接种量分别接种于3个装 有200ml YPD培养基的500ml的锥形瓶中，30°C、250rpm活化10小时。按上述发酵条件和 发酵时间扩增600ml菌种。(2)发酵培养将500ml菌种接种于IOL发酵罐中，发酵罐装量为5L，发酵培养 基为BMGY培养基，发酵条件为转速400rpm;pH 5. 0 ；温度30°C ；溶氧40%以上；培养 时间16小时。培养16小时后对培养基进行补料，补料分2阶段，第一阶段补料培养基为 2XBMMY+6%甲醇；pH 5. 3 ；补料体积为10%发酵罐体积量。补料约5小时结束，发酵进入 诱导表达期。诱导期条件控制转速400rpm ;pH 4. 9 ；温度26°C ；溶氧40%以上，培养时 间6天。第一阶段补料结束后，进行第二阶段补料，第二阶段补料培养基为纯甲醇。甲醇 控制量为总量占培养基的0. 6%，连续补加甲醇6天。每天取样检测目的蛋白表达量和菌体 湿重，约6天后表达达到最大值，即可放罐。(3)基因重组人铜-锌超氧化物歧化酶的纯化发酵液经离心，取上清，再通过超 滤浓缩，盐析，得到的盐析物为Cu-Zn SOD粗蛋白，再溶解后脱盐，然后超滤浓缩、冻干，得到 的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)冻干粉纯度达93. 22%，同时纯化过程酶活损失 小，冻干粉酶比活可达18250U/mg。(4)制备人铜-锌超氧化物歧化酶脂质体将磷脂、聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺、胆 固醇溶于适量的乙醇中，将人Cu-Zn超氧化物歧化酶用缓冲液溶解，在氮气的保护条件下 将两种溶液混勻，在高压均质机的作用下，即得人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体溶液。将该 脂质体药物溶液反复用超滤器超滤除去溶剂，并以0.9%氯化钠溶液作补充液。将超滤液冷 冻干燥，除去水分，将内容物收集，即人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体。该技术制备的重组 人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体包封率为80. 54%。各成分比例为人铜锌-超氧化物歧化酶 8%卵磷脂60%胆固醇 %聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 20%维生素E5%(5)人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊的制备人铜-锌超氧化 物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体5% ；低聚木糖40% ；维生素E 2% ；维生素C 3% ；甘露醇 30%;医用淀粉20%。将上述制备好的Cu-Zn SOD脂质体按量加入维生素E、维生素C和医 用淀粉，搅勻，装入肠溶空心胶囊，即得人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊。实施例2:(1)菌种筛选及扩增挑选MD平板阳性克隆单菌落，无菌环境下接种于60ml YPD 配养基中，于摇床30°C、250rpm活化10小时；活化的菌种按10%接种量分别接种于3个装 有200ml YPD培养基的500ml的锥形瓶中，30°C、250rpm活化10小时。按上述发酵条件和 发酵时间扩增600ml菌种。(2)发酵培养将500ml菌种接种于10L发酵罐中，发酵罐装量为5L，发酵培养 基为BMGY培养基，发酵条件为转速400rpm;pH 5. 5 ；温度30°C ；溶氧40%以上；培养时间16小时。培养16小时后对培养基进行补料，补料分2阶段，第一阶段补料培养基为 2XBMMY+6%甲醇；pH 5. 3 ；补料体积为10%发酵罐体积量。补料约5小时结束，发酵进入 诱导表达期。诱导期条件控制转速400rpm ;pH 5. 2 ；温度28°C ；溶氧40%以上，培养时 间6天。第一阶段补料结束后，进行第二阶段补料，第二阶段补料培养基为纯甲醇。甲醇 控制量为总量占培养基的0. 6%，连续补加甲醇6天。每天取样检测目的蛋白表达量和菌体 湿重，约6天后表达达到最大值，即可放罐。(3)基因重组人铜-锌超氧化物歧化酶的纯化发酵液经离心，取上清，再通过超 滤浓缩，盐析，得到的盐析物为Cu-Zn SOD粗蛋白，再溶解后脱盐，然后超滤浓缩、冻干，得到 的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)冻干粉纯度达93. 40%，同时纯化过程酶活损失 小，冻干粉酶比活可达18350U/mg。(4)制备人铜_锌超氧化物歧化酶脂质体将磷脂、聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺、胆 固醇溶于适量的乙醇中，将人Cu-Zn超氧化物歧化酶用缓冲液溶解，在氮气的保护条件下 将两种溶液混勻，在高压均质机的作用下，即得人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体溶液。将该 脂质体药物溶液反复用超滤器超滤除去溶剂，并以0. 9%氯化钠溶液作补充液。将超滤液冷 冻干燥，除去水分，将内容物收集，即人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体。该技术制备的重组 人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体包封率为82. 11%。各成分比例为人铜-锌超氧化物歧化酶 10%卵磷脂70%胆固醇6%聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 20%维生素E4%(5)人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊的制备人铜-锌超氧化物 歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体10% ；低聚木糖30% ；维生素E 5% ；维生素C 5% ；甘露醇 20%;医用淀粉30%。将上述制备好的Cu-Zn SOD脂质体按量加入维生素E、维生素C和医 用淀粉，搅勻，装入肠溶空心胶囊，即得人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的肠溶胶囊。
权利要求
一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊及其制备方法，其特征在于；a)构建分泌表达重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的毕赤酵母工程菌菌种；b)经a)步骤获得的工程菌菌种经筛选，筛选后的菌种用于重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的发酵工艺；c)经b)步骤获得的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)原料，应用于脂质体包埋技术制备人铜-锌超氧化物歧化酶脂质体；d)人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体肠溶胶囊制备技术。
2.根据权利要求书1所述的一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊及 其制备方法，其分泌表达重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的毕赤酵母菌种构建 特征根据毕赤酵母的表达机制，通过基因工程手段对人铜_锌超氧化物歧化酶进行基因 测序，并对基因序列进行密码子优化。优化的基因序列重组载入表达载体pPIC9k质粒中， 重组为pPIC9K-hS0D工程质粒。工程质粒重新转化、扩增，扩增质粒用Sal I完全酶切后电 转入毕赤酵母KM71菌株，在MD平板上筛选阳性克隆。
3.根据权利要求书1所述的一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体胶囊及其 制备方法，其重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的发酵工艺特征平板筛选的工程 菌经摇床活化、发酵罐扩增，最终按10%的接种量接入10吨发酵罐中进行培养。通过对发 酵培养阶段条件和发酵诱导期阶段条件的严格控制，使菌密度和酶表达量达到最大化，获 得高产人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)。发酵液经离心、超滤浓缩、盐析、脱盐、冻干 后，得到的人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)纯度达93%以上，同时纯化过程酶活损失 小，酶比活可达18000U/mg以上。
4.根据权利要求书1所述的一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊及 其制备方法，其人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体包埋技术特征脂质体包材 采用粘膜吸收促透剂的磷脂50% -80%;脂质体包材的胆固醇0. 5% -8%;抗氧化剂的维生 素E 0% -8% ；聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺2% -20% ；人铜-锌超氧化物歧化酶-50%。 上述化合物制备的Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体肠溶胶囊能有效地延长药物的半衰期。
5.根据权利要求书1所述的一种基因重组人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体胶囊及 其制备方法，其人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体胶囊制备技术特征人 铜_锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)的脂质体-35% ；低聚木糖20% -50% ；维生素E 0. 2% -10% ；维生素C 2% -10% ；甘露醇10% -60%。上述成分混合均勻后装入胶囊，该 填充胶囊膜为不被胃液分解和破坏的肠溶胶囊。
全文摘要
一种基因重组人超氧化物歧化酶脂质体胶囊的制备方法，是将工程菌发酵获得的人Cu-Zn超氧化物歧化酶(比活力18000U/mg)包埋于脂质体中，制备得到Cu-Zn超氧化物歧化酶脂质体胶囊。脂质体包材采用粘膜吸收促透剂的磷脂和胆固醇，再加入抗氧化剂的维生素E，采用保护脂质体药物不被胃液分解和破坏的肠溶胶囊，避免药物的破坏，可增强人Cu-Zn超氧化物歧化酶通过肠粘膜的吸收，提高血药浓度和药效，更好的去除人体自由基，延缓衰老。该技术制备的重组人铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)脂质体包封率为80.54±2.26％，肠溶胶囊体外模拟胃酸、胃蛋白酶、胰酶耐受力分别为95.2％、91.6％、86.2％。
文档编号A61K9/48GK101816781SQ201010152650
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者梁华正, 楼秀余, 蔡刚, 赖建炫, 黄建荣 申请人:江西宇骏生物工程有限公司
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