南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用的制作方法
专利名称：南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用，尤其涉及南瓜蛋白与吉西 他滨联合应用治疗胰腺癌的用途。
背景技术：
胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率逐年上升。由于发病隐袭和高度进 展性，胰腺癌早期诊断十分困难，大多数患者在确诊时已是晚期(局部晚期或发生远处转 移)，手术切除率低(< 15%)，即使行根治性切除术，多数病人出现术后短期复发转移，治 疗棘手，病死率高，90%的病人在确诊后1年内死亡，5年生存率不到5%。化疗是手术后病 人和失去手术机会的病人提高生存率的主要治疗手段，也是胰腺癌综合治疗的重要组成部 分。多年来用于胰腺癌化疗的主要是细胞毒类抗肿瘤药物(氟尿嘧啶、吉西他滨和钼类等) 和近年来发展起来的靶向药物(如EGFR及VEGF的单抗及相应的酪氨酸激酶抑制剂)，其 中，吉西他滨疗效最好，美国NCCN指南已将吉西他滨和以其为基础的联合方案推荐为晚期 胰腺癌治疗及术后辅助化疗的标准方案。但目前疗效并不令人满意，尤其对晚期胰腺癌，吉 西他滨的客观缓解率也仅12%，而且无论是吉西他滨单药化疗还是联合化疗，患者的中位 生存期均未能超过9个月。因此积极开发高效、低毒、多靶点作用的新药，尤其是能与现有 化疗药物产生协同作用的药物与联合治疗方案已成为胰腺癌治疗的迫切任务与研究热点。核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)广泛存在于高等植物 中，通常按结构不同分为两型I型RIP为单链蛋白，如天花粉蛋白(TCS)，在植物RIP中占 多数；II型RIP是通过二硫键连接的双链蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。I型RIP与II型RIP 的A链一样，是一类RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷酶，能专一地水解真核细胞核糖体 28S rRNA第4324位上的腺嘌呤碱基与核糖之间的N-C糖苷键，释放出一个腺嘌呤碱基，从 而阻遏了延长因子与核糖体的结合，抑制蛋白质的生物合成，具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤 等多种生物学活性[21’22]。由于II型RIP的B链具有凝集素的功能，可识别正常细胞表面的 D-半乳糖，因而有很大的毒性，限制了其在人体内的应用。而I型RIP由于不具有B链，对 人体的毒性较小，作为抗肿瘤药物更具应用前景。然而，不同的I型RIP其抗肿瘤活性并不 相同(相差可达10倍以上)，因而从植物中筛选高活性的I型RIP成为有关研究人员努力 的方向。南瓜蛋白(cucurmosin，CUS)是从南瓜瓜瓤中提取的新的1型核糖体失活蛋白， 为碱性单肽链糖蛋白。我们测定了其氨基酸序列和DNA顺序，培养出单晶并测定了其结构 (Chen MH，Ye XM，Cai JH，et al. Crystallization andpreliminary crystallographic study of cucurmosin， a ribosome-inactivating proteinfrom the sarcocarp of cucurbita moschata[J]. Acta Cryst 2000 D56 665-666 ；Shi XL, Zhou EX, Ye XM, et al.Molecular replacement studies of cucurmosin from Cucurbitamoschata structure homology with trichosanthin[J]. Chinese J Struct Chem,2003,22 165-168;陈明晃，叶晓明.一种多肽-具有南瓜蛋白的N端顺序的多肽[P].中国，发明专利，03135045. 3，2003-09-29 ；陈明晃，谢捷明，等.南瓜蛋白及其编码基因[P].中国，发明 专利，200710008402. 6，2007-01-10)。我们前期的研究表明能显著抑制多种肿瘤(肝癌、 胃癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌和黑色素瘤)细胞增殖及诱导凋亡(谢捷明，陈明晃，等.南瓜 蛋白在制药中的应用[P].中国，发明专利，200510119741. 2,2005-11-03)，且活性比同类 的天花粉蛋白强4-7倍，而对人正常肝细胞株和外周血淋巴细胞的抑制作用较小，表现出 明显的选择性。我们近期发现，南瓜蛋白对AsPC-l、BxPC-3、CFPAC-l和PANC-1等多株人胰 腺癌细胞均具有显著的增殖抑制作用，南瓜蛋白与吉西他滨具有协同抗PANC-1细胞作用。
发明内容
本发明的目的是通过研究南瓜蛋白单用及南瓜蛋白与吉西他滨联合应用时的抗 胰腺癌活性，提供南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用。本发明的发明人的研究表明，南瓜蛋白对体外培养的多种人胰腺癌细胞株均具有 显著的增殖抑制作用，对人胰腺癌小鼠皮下移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明显的抑制作 用；南瓜蛋白与吉西他滨联用时，对胰腺癌细胞的增殖抑制作用明显增强，具有协同作用。 因而，南瓜蛋白可单用及与吉西他滨联合用于治疗胰腺癌。
具体实施例方式下面用具体的实施例分别说明南瓜蛋白单用及南瓜蛋白与吉西他滨联合应用时 对人胰腺癌细胞的增殖抑制作用。实施例1 南瓜蛋白对体外培养的人胰腺癌细胞的增殖抑制作用(一 )南瓜蛋白对体外培养的人胰腺癌PANC-1细胞的增殖抑制作用(MTT法)方法取对数生长期的PANC-1细胞接种于96孔培养板上，每孔接种量为 3000/160 uL0培养24h后，实验组加不同浓度的南瓜蛋白40 y L，每个浓度做6个复孔； 阴性对照组加营养液40 y L，空白对照孔加营养液200 y L，用于仪器调零。作用不同时间 (24h、48h和72h)后，每孔加5g/L的MTT 20 y L，继续培养4h，甩去上清，每孔加二甲亚砜 150 uL.用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸光度值(A57C1)，各组取平均值，计算 抑制率抑制率=(1-实验组A5TO/对照组A57(i)X100%。用SPSS12.0进行统计学分析，并 计算IC5〇。结果见表1和表3。南瓜蛋白对人胰腺癌PANC-1细胞具有显著的增殖抑制作用， 并且表现为明显的时间依赖性和剂量依赖性。南瓜蛋白作用24h、48h和72h的IC5Q分别为 40. 245 mg/L(1. 427u mol/L)、8. 249 mg/L(0. 292u mol/L)和 1. 778mg/L(0. 063u mol/L)。表1不同浓度和不同时间CUS对胰腺癌细胞PNCA-1的抑制率(n = 4)
4 ^ 与对照组 A57Q 比较，P < 0. 05。( 二)南瓜蛋白对体外培养的人胰腺癌细胞系CFPAC-l、AsPC_l和BxPC_3的增殖 抑制作用(SRB法)方法分别取对数生长期的AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1细胞，接种于96孔培养板 上，每孔接种分别为量为3000/100 u L,5000/100 y L禾口 6000/100 u L。培养24h后，实验组 加不同浓度的南瓜蛋白100 y L，每个浓度做3个复孔；阴性对照组加营养液lOOy L，空白 对照孔加营养液200 u L，用于仪器调零。作用72h后，弃上清，每孔加预冷的10%的三氯乙 酸100 iiL，4°C固定lh;倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥；每孔加SRB液 (Sulforhodamine B，用1 %醋酸配成0. 4%溶液)50uL，在室温放置10分钟；未与蛋白结合 的SRB用醋酸液洗5遍，空气干燥；结合的SRB用150uL lOmmol/L非缓冲Tris碱液(pH 10. 5)溶解，用酶标仪(BI0-RAD产品)在570nm波长处测定每个小孔的吸光度值(A57C1)，各 组取平均值，计算抑制率抑制率=(1-实验组A570/对照组A570) X 100%。用SPSS12. 0进 行统计学分析，并计算IC5(1。实验重复一次。结果见表2和表3。南瓜蛋白对人胰腺癌细胞系BxPC-3、AsPC-1和CFPAC-1均 具有明显的的增殖抑制作用。南瓜蛋白对该三种细胞作用72h的IC5(1分别为0. 243umol/ L、0. 349 u mol/L 和 0. 387 u mol/L。表2 CUS对胰腺癌细胞CFPAC-1、AsPC-1和BxPC_3的增殖抑制作用(n = 3)
5 ^ 与对照组 A570 比较，P < 0. 05。表3南瓜蛋白对胰腺癌细胞的半数抑制浓度 ^ 南瓜蛋白的分子质量为28203 Da上述两个实验结果表明，南瓜蛋白对体外培养的多种人胰腺癌细胞株(PANC-1、 BxPC-3、AsPC-1和CFPAC-1)均具有显著的增殖抑制作用，作用72h的IC5(1分别为0. 063、 0. 243,0. 349和0. 387 y mol/L，说明南瓜蛋白在体外具有抗胰腺癌作用。实施例2 南瓜蛋白对人胰腺癌小鼠移植瘤的抑制作用(一 )南瓜蛋白对人胰腺癌PANC-1细胞N0D/SCID小鼠皮下移植瘤的抑制作用方法取对数生长期人胰腺癌细胞株PANC_1，0. 125%胰酶消化后离心收集细胞， 用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，重悬成108/mL的细胞悬液。以75%酒精消毒NOD/ SCID小鼠皮肤后，将细胞悬液注射接种于小鼠右肩背部皮下，每只0. 2ml (含2 X 107细胞)。 待皮下移植瘤长至约1cm3大小时，颈椎脱白处死荷瘤小鼠，碘酒酒精消毒后，无菌剥取瘤 块；选择生长良好、无坏死、呈鱼肉状的瘤组织，剪切成直径约2mm的小块，用18号套管针接 种至其他N0D-SCID小鼠右肩背部皮下，如此反复进行鼠间传代。本实验以第6代皮下移植 瘤作为瘤源，皮下接种N0D/SCID小鼠[许可证编号SCXK(京)2005-0013]45只。14天后， 待皮下移植瘤长至体积彡100mm3时，将N0D/SCID小鼠按瘤块大小分群，并随机分为5组 南瓜蛋白0. 5mg/kg、lmg/kg和2mg/kg三个剂量组，吉西他滨组和生理盐水对照组。每2_3 天腹腔注射给药1次，共5次，各组小鼠称重后颈椎脱白处死，剥取瘤块并称重。按以下公 式计算肿瘤生长抑制率(％)肿瘤生长抑制率％= (1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤 重)X 100 ；并将结果进行统计学处理。结果给药剂量为0. 5mg/kg、lmg/kg和2mg/kg的南瓜蛋白对PANC-1皮下移植瘤 均具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为24. 06%,25. 90%和44. 55% (表4)。
表4南瓜蛋白对小鼠PANC-1瘤重的影响(x+s) ** 与对照组比较，p < 0. 01( 二)南瓜蛋白对PANC-1细胞的N0D/SCID小鼠胰腺原位移植瘤的抑制作用方法取上述第3代皮下移植瘤荷瘤N0D/SCID小鼠2只。待皮下移植瘤长至约
1.5cm3大小，颈椎脱位法处死荷瘤鼠，消毒皮肤，剥取肿瘤，浸入含100U/mL青霉素的无血 清培养基，去除中央坏死组织，选取周围健康肿瘤组织，剪成大小约1mm3的瘤块供原位移植 用。10%水合氯醛溶液(50mg/kg)腹腔注射麻醉N0D/SCID小鼠，碘伏消毒皮肤，左上腹肋缘 下行1cm的斜行切口，仔细分开胃与脾之间的薄膜，暴露胰腺，将脾及胰尾牵出腹腔外，轻 轻騷刮胰腺被膜，将1mm3瘤块植入胰体尾处，将胰腺被膜向反折盖住瘤块并以ZT胶固定。 将胰腺轻轻送回腹腔，3-0外科缝线单层缝合腹壁肌层及皮肤。以上所有操作均在超净台 内进行。接种肿瘤后，小鼠按体重随机分6组阳性对照组，阴性对照组(2组)及不同剂 量南瓜蛋白组(3组)，每组8只。阳性对照药为吉西他滨(100mg/kg，小鼠尾静脉iv)，阴 性对照组给予等体积的生理盐水，南瓜蛋白组给药剂量分别为0. 625mg/kg、l. 25mg/kg和
2.5mg/kg。瘤块接种后的第3天开始给药，每7 10天给药1次，共4次(小鼠尾静脉iv d4，ll，21，31d)。实验第49天，各组小鼠称重后处死，完整剥取胰腺原位瘤块并称重。按下 列公式计算肿瘤生长抑制率(％)肿瘤生长抑制率％= (1-给药组平均瘤重/对照组平均 瘤重)X 100 ；并将结果进行统计学处理。结果南瓜蛋白3个剂量组(0. 25mg/kg、0. 5 mg/kg和lmg/kg)对PANC-1细胞的 N0D/SCID小鼠胰腺原位移植瘤均具有显著的抑制作用，抑瘤率分别为45. 17%,50. 00%和 59. 68% (表 5)表5南瓜蛋白对小鼠胰腺移植瘤的抑制作用 ** 与对照组比较，p < 0. 01上述两个实验结果表明，南瓜蛋白对人胰腺癌PANC-1细胞的N0D/SCID小鼠皮下 移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明显的抑制作用，说明南瓜蛋白在小鼠体内具有抗胰腺癌 作用。实施例3 南瓜蛋白和吉西他滨联合应用时对PANC-1细胞的增殖抑制作用方法取对数生长期的PANC-1细胞，接种于96孔培养板上，每孔接种量 3000/160ii L。培养24h后加药。实验组分南瓜蛋白(⑶S)组、吉西他滨(GEM)组及⑶S+GEM 组，每孔加药量为40 yL，设4个复孔。两药合用时体积比例为1 1，每种单药浓缩1倍各 加 20 iil，CUS 的终浓度为 0. 3125,0. 625、1. 25,2. 5、5 和 10 u g/mL, GEM 的终浓度为 6. 25、 12. 5、25、50、100和200nmol/L。阴性对照组每孔加等量溶剂，设8个复孔，空白对照孔加营 养液200 u L，用于仪器调零。置5% C02、37°C培养72h，每孔加5mg/mL的MTT20 u L，继续培 养4h，甩去上清，每孔加二甲亚砜150 ii L。用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸 光度值(A5TO)。计算联合用药指数(CDI)。CDI = SA+B/(SAXSB)，SA+B表示药物联合作用组细 胞的存活部分与阴性对照的比值，SA和SB分别代表A药和B药单独使用组细胞的存活部分 与阴性对照的比值；⑶I < 1、⑶I = 1和⑶I > 1分别表示两药有协同、相加和拮抗作用， 当⑶I < 0. 75时，表示两药协同作用非常显著。结果见表6和表7表6不同浓度的CUS和GEM合用时对PANC-1细胞的增殖抑制率(％ ) 表7不同浓度的CUS和GEM联合抗PANC-1细胞的CD I 上述结果表明，不同浓度的南瓜蛋白与不同浓度的吉西他滨联合应用时，对人胰 腺癌PANC-1细胞的增殖抑制作用均明显增强，两者联合抗胰腺癌具有显著的协同作用。
权利要求
南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用，南瓜蛋白为南瓜瓜瓤中提取的I型核糖体失活蛋白。
2.如权利要求1所述的南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于南瓜蛋 白单用时在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
3.如权利要求1所述的南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于南瓜蛋 白与吉西他滨联合在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用。南瓜蛋白单用时对体外培养的多株胰腺癌细胞均具有显著的增殖抑制作用，对人胰腺癌小鼠皮下移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明显的抑制作用，说明南瓜蛋白在体外及体内均具有抗胰腺癌作用；南瓜蛋白与吉西他滨联用时，对胰腺癌细胞的增殖抑制作用明显增强，具有协同作用。因而，南瓜蛋白可单用及与吉西他滨联合用于治疗胰腺癌。
文档编号A61P35/00GK101850106SQ201010155008
公开日2010年10月6日 申请日期2010年3月31日 优先权日2010年3月31日
发明者吴正财, 许春森, 谢捷明, 陈明晃, 黄鹤光 申请人:福建医科大学;中国科学院福建物质结构研究所
技术领域：
本发明涉及南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用，尤其涉及南瓜蛋白与吉西 他滨联合应用治疗胰腺癌的用途。
背景技术：
胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率逐年上升。由于发病隐袭和高度进 展性，胰腺癌早期诊断十分困难，大多数患者在确诊时已是晚期(局部晚期或发生远处转 移)，手术切除率低(< 15%)，即使行根治性切除术，多数病人出现术后短期复发转移，治 疗棘手，病死率高，90%的病人在确诊后1年内死亡，5年生存率不到5%。化疗是手术后病 人和失去手术机会的病人提高生存率的主要治疗手段，也是胰腺癌综合治疗的重要组成部 分。多年来用于胰腺癌化疗的主要是细胞毒类抗肿瘤药物(氟尿嘧啶、吉西他滨和钼类等) 和近年来发展起来的靶向药物(如EGFR及VEGF的单抗及相应的酪氨酸激酶抑制剂)，其 中，吉西他滨疗效最好，美国NCCN指南已将吉西他滨和以其为基础的联合方案推荐为晚期 胰腺癌治疗及术后辅助化疗的标准方案。但目前疗效并不令人满意，尤其对晚期胰腺癌，吉 西他滨的客观缓解率也仅12%，而且无论是吉西他滨单药化疗还是联合化疗，患者的中位 生存期均未能超过9个月。因此积极开发高效、低毒、多靶点作用的新药，尤其是能与现有 化疗药物产生协同作用的药物与联合治疗方案已成为胰腺癌治疗的迫切任务与研究热点。核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)广泛存在于高等植物 中，通常按结构不同分为两型I型RIP为单链蛋白，如天花粉蛋白(TCS)，在植物RIP中占 多数；II型RIP是通过二硫键连接的双链蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。I型RIP与II型RIP 的A链一样，是一类RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷酶，能专一地水解真核细胞核糖体 28S rRNA第4324位上的腺嘌呤碱基与核糖之间的N-C糖苷键，释放出一个腺嘌呤碱基，从 而阻遏了延长因子与核糖体的结合，抑制蛋白质的生物合成，具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤 等多种生物学活性[21’22]。由于II型RIP的B链具有凝集素的功能，可识别正常细胞表面的 D-半乳糖，因而有很大的毒性，限制了其在人体内的应用。而I型RIP由于不具有B链，对 人体的毒性较小，作为抗肿瘤药物更具应用前景。然而，不同的I型RIP其抗肿瘤活性并不 相同(相差可达10倍以上)，因而从植物中筛选高活性的I型RIP成为有关研究人员努力 的方向。南瓜蛋白(cucurmosin，CUS)是从南瓜瓜瓤中提取的新的1型核糖体失活蛋白， 为碱性单肽链糖蛋白。我们测定了其氨基酸序列和DNA顺序，培养出单晶并测定了其结构 (Chen MH，Ye XM，Cai JH，et al. Crystallization andpreliminary crystallographic study of cucurmosin， a ribosome-inactivating proteinfrom the sarcocarp of cucurbita moschata[J]. Acta Cryst 2000 D56 665-666 ；Shi XL, Zhou EX, Ye XM, et al.Molecular replacement studies of cucurmosin from Cucurbitamoschata structure homology with trichosanthin[J]. Chinese J Struct Chem,2003,22 165-168;陈明晃，叶晓明.一种多肽-具有南瓜蛋白的N端顺序的多肽[P].中国，发明专利，03135045. 3，2003-09-29 ；陈明晃，谢捷明，等.南瓜蛋白及其编码基因[P].中国，发明 专利，200710008402. 6，2007-01-10)。我们前期的研究表明能显著抑制多种肿瘤(肝癌、 胃癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌和黑色素瘤)细胞增殖及诱导凋亡(谢捷明，陈明晃，等.南瓜 蛋白在制药中的应用[P].中国，发明专利，200510119741. 2,2005-11-03)，且活性比同类 的天花粉蛋白强4-7倍，而对人正常肝细胞株和外周血淋巴细胞的抑制作用较小，表现出 明显的选择性。我们近期发现，南瓜蛋白对AsPC-l、BxPC-3、CFPAC-l和PANC-1等多株人胰 腺癌细胞均具有显著的增殖抑制作用，南瓜蛋白与吉西他滨具有协同抗PANC-1细胞作用。
发明内容
本发明的目的是通过研究南瓜蛋白单用及南瓜蛋白与吉西他滨联合应用时的抗 胰腺癌活性，提供南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用。本发明的发明人的研究表明，南瓜蛋白对体外培养的多种人胰腺癌细胞株均具有 显著的增殖抑制作用，对人胰腺癌小鼠皮下移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明显的抑制作 用；南瓜蛋白与吉西他滨联用时，对胰腺癌细胞的增殖抑制作用明显增强，具有协同作用。 因而，南瓜蛋白可单用及与吉西他滨联合用于治疗胰腺癌。
具体实施例方式下面用具体的实施例分别说明南瓜蛋白单用及南瓜蛋白与吉西他滨联合应用时 对人胰腺癌细胞的增殖抑制作用。实施例1 南瓜蛋白对体外培养的人胰腺癌细胞的增殖抑制作用(一 )南瓜蛋白对体外培养的人胰腺癌PANC-1细胞的增殖抑制作用(MTT法)方法取对数生长期的PANC-1细胞接种于96孔培养板上，每孔接种量为 3000/160 uL0培养24h后，实验组加不同浓度的南瓜蛋白40 y L，每个浓度做6个复孔； 阴性对照组加营养液40 y L，空白对照孔加营养液200 y L，用于仪器调零。作用不同时间 (24h、48h和72h)后，每孔加5g/L的MTT 20 y L，继续培养4h，甩去上清，每孔加二甲亚砜 150 uL.用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸光度值(A57C1)，各组取平均值，计算 抑制率抑制率=(1-实验组A5TO/对照组A57(i)X100%。用SPSS12.0进行统计学分析，并 计算IC5〇。结果见表1和表3。南瓜蛋白对人胰腺癌PANC-1细胞具有显著的增殖抑制作用， 并且表现为明显的时间依赖性和剂量依赖性。南瓜蛋白作用24h、48h和72h的IC5Q分别为 40. 245 mg/L(1. 427u mol/L)、8. 249 mg/L(0. 292u mol/L)和 1. 778mg/L(0. 063u mol/L)。表1不同浓度和不同时间CUS对胰腺癌细胞PNCA-1的抑制率(n = 4)
4 ^ 与对照组 A57Q 比较，P < 0. 05。( 二)南瓜蛋白对体外培养的人胰腺癌细胞系CFPAC-l、AsPC_l和BxPC_3的增殖 抑制作用(SRB法)方法分别取对数生长期的AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1细胞，接种于96孔培养板 上，每孔接种分别为量为3000/100 u L,5000/100 y L禾口 6000/100 u L。培养24h后，实验组 加不同浓度的南瓜蛋白100 y L，每个浓度做3个复孔；阴性对照组加营养液lOOy L，空白 对照孔加营养液200 u L，用于仪器调零。作用72h后，弃上清，每孔加预冷的10%的三氯乙 酸100 iiL，4°C固定lh;倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥；每孔加SRB液 (Sulforhodamine B，用1 %醋酸配成0. 4%溶液)50uL，在室温放置10分钟；未与蛋白结合 的SRB用醋酸液洗5遍，空气干燥；结合的SRB用150uL lOmmol/L非缓冲Tris碱液(pH 10. 5)溶解，用酶标仪(BI0-RAD产品)在570nm波长处测定每个小孔的吸光度值(A57C1)，各 组取平均值，计算抑制率抑制率=(1-实验组A570/对照组A570) X 100%。用SPSS12. 0进 行统计学分析，并计算IC5(1。实验重复一次。结果见表2和表3。南瓜蛋白对人胰腺癌细胞系BxPC-3、AsPC-1和CFPAC-1均 具有明显的的增殖抑制作用。南瓜蛋白对该三种细胞作用72h的IC5(1分别为0. 243umol/ L、0. 349 u mol/L 和 0. 387 u mol/L。表2 CUS对胰腺癌细胞CFPAC-1、AsPC-1和BxPC_3的增殖抑制作用(n = 3)
5 ^ 与对照组 A570 比较，P < 0. 05。表3南瓜蛋白对胰腺癌细胞的半数抑制浓度 ^ 南瓜蛋白的分子质量为28203 Da上述两个实验结果表明，南瓜蛋白对体外培养的多种人胰腺癌细胞株(PANC-1、 BxPC-3、AsPC-1和CFPAC-1)均具有显著的增殖抑制作用，作用72h的IC5(1分别为0. 063、 0. 243,0. 349和0. 387 y mol/L，说明南瓜蛋白在体外具有抗胰腺癌作用。实施例2 南瓜蛋白对人胰腺癌小鼠移植瘤的抑制作用(一 )南瓜蛋白对人胰腺癌PANC-1细胞N0D/SCID小鼠皮下移植瘤的抑制作用方法取对数生长期人胰腺癌细胞株PANC_1，0. 125%胰酶消化后离心收集细胞， 用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，重悬成108/mL的细胞悬液。以75%酒精消毒NOD/ SCID小鼠皮肤后，将细胞悬液注射接种于小鼠右肩背部皮下，每只0. 2ml (含2 X 107细胞)。 待皮下移植瘤长至约1cm3大小时，颈椎脱白处死荷瘤小鼠，碘酒酒精消毒后，无菌剥取瘤 块；选择生长良好、无坏死、呈鱼肉状的瘤组织，剪切成直径约2mm的小块，用18号套管针接 种至其他N0D-SCID小鼠右肩背部皮下，如此反复进行鼠间传代。本实验以第6代皮下移植 瘤作为瘤源，皮下接种N0D/SCID小鼠[许可证编号SCXK(京)2005-0013]45只。14天后， 待皮下移植瘤长至体积彡100mm3时，将N0D/SCID小鼠按瘤块大小分群，并随机分为5组 南瓜蛋白0. 5mg/kg、lmg/kg和2mg/kg三个剂量组，吉西他滨组和生理盐水对照组。每2_3 天腹腔注射给药1次，共5次，各组小鼠称重后颈椎脱白处死，剥取瘤块并称重。按以下公 式计算肿瘤生长抑制率(％)肿瘤生长抑制率％= (1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤 重)X 100 ；并将结果进行统计学处理。结果给药剂量为0. 5mg/kg、lmg/kg和2mg/kg的南瓜蛋白对PANC-1皮下移植瘤 均具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为24. 06%,25. 90%和44. 55% (表4)。
表4南瓜蛋白对小鼠PANC-1瘤重的影响(x+s) ** 与对照组比较，p < 0. 01( 二)南瓜蛋白对PANC-1细胞的N0D/SCID小鼠胰腺原位移植瘤的抑制作用方法取上述第3代皮下移植瘤荷瘤N0D/SCID小鼠2只。待皮下移植瘤长至约
1.5cm3大小，颈椎脱位法处死荷瘤鼠，消毒皮肤，剥取肿瘤，浸入含100U/mL青霉素的无血 清培养基，去除中央坏死组织，选取周围健康肿瘤组织，剪成大小约1mm3的瘤块供原位移植 用。10%水合氯醛溶液(50mg/kg)腹腔注射麻醉N0D/SCID小鼠，碘伏消毒皮肤，左上腹肋缘 下行1cm的斜行切口，仔细分开胃与脾之间的薄膜，暴露胰腺，将脾及胰尾牵出腹腔外，轻 轻騷刮胰腺被膜，将1mm3瘤块植入胰体尾处，将胰腺被膜向反折盖住瘤块并以ZT胶固定。 将胰腺轻轻送回腹腔，3-0外科缝线单层缝合腹壁肌层及皮肤。以上所有操作均在超净台 内进行。接种肿瘤后，小鼠按体重随机分6组阳性对照组，阴性对照组(2组)及不同剂 量南瓜蛋白组(3组)，每组8只。阳性对照药为吉西他滨(100mg/kg，小鼠尾静脉iv)，阴 性对照组给予等体积的生理盐水，南瓜蛋白组给药剂量分别为0. 625mg/kg、l. 25mg/kg和
2.5mg/kg。瘤块接种后的第3天开始给药，每7 10天给药1次，共4次(小鼠尾静脉iv d4，ll，21，31d)。实验第49天，各组小鼠称重后处死，完整剥取胰腺原位瘤块并称重。按下 列公式计算肿瘤生长抑制率(％)肿瘤生长抑制率％= (1-给药组平均瘤重/对照组平均 瘤重)X 100 ；并将结果进行统计学处理。结果南瓜蛋白3个剂量组(0. 25mg/kg、0. 5 mg/kg和lmg/kg)对PANC-1细胞的 N0D/SCID小鼠胰腺原位移植瘤均具有显著的抑制作用，抑瘤率分别为45. 17%,50. 00%和 59. 68% (表 5)表5南瓜蛋白对小鼠胰腺移植瘤的抑制作用 ** 与对照组比较，p < 0. 01上述两个实验结果表明，南瓜蛋白对人胰腺癌PANC-1细胞的N0D/SCID小鼠皮下 移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明显的抑制作用，说明南瓜蛋白在小鼠体内具有抗胰腺癌 作用。实施例3 南瓜蛋白和吉西他滨联合应用时对PANC-1细胞的增殖抑制作用方法取对数生长期的PANC-1细胞，接种于96孔培养板上，每孔接种量 3000/160ii L。培养24h后加药。实验组分南瓜蛋白(⑶S)组、吉西他滨(GEM)组及⑶S+GEM 组，每孔加药量为40 yL，设4个复孔。两药合用时体积比例为1 1，每种单药浓缩1倍各 加 20 iil，CUS 的终浓度为 0. 3125,0. 625、1. 25,2. 5、5 和 10 u g/mL, GEM 的终浓度为 6. 25、 12. 5、25、50、100和200nmol/L。阴性对照组每孔加等量溶剂，设8个复孔，空白对照孔加营 养液200 u L，用于仪器调零。置5% C02、37°C培养72h，每孔加5mg/mL的MTT20 u L，继续培 养4h，甩去上清，每孔加二甲亚砜150 ii L。用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸 光度值(A5TO)。计算联合用药指数(CDI)。CDI = SA+B/(SAXSB)，SA+B表示药物联合作用组细 胞的存活部分与阴性对照的比值，SA和SB分别代表A药和B药单独使用组细胞的存活部分 与阴性对照的比值；⑶I < 1、⑶I = 1和⑶I > 1分别表示两药有协同、相加和拮抗作用， 当⑶I < 0. 75时，表示两药协同作用非常显著。结果见表6和表7表6不同浓度的CUS和GEM合用时对PANC-1细胞的增殖抑制率(％ ) 表7不同浓度的CUS和GEM联合抗PANC-1细胞的CD I 上述结果表明，不同浓度的南瓜蛋白与不同浓度的吉西他滨联合应用时，对人胰 腺癌PANC-1细胞的增殖抑制作用均明显增强，两者联合抗胰腺癌具有显著的协同作用。
权利要求
南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用，南瓜蛋白为南瓜瓜瓤中提取的I型核糖体失活蛋白。
2.如权利要求1所述的南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于南瓜蛋 白单用时在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
3.如权利要求1所述的南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于南瓜蛋 白与吉西他滨联合在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了南瓜蛋白在制备治疗胰腺癌药物中的应用。南瓜蛋白单用时对体外培养的多株胰腺癌细胞均具有显著的增殖抑制作用，对人胰腺癌小鼠皮下移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明显的抑制作用，说明南瓜蛋白在体外及体内均具有抗胰腺癌作用；南瓜蛋白与吉西他滨联用时，对胰腺癌细胞的增殖抑制作用明显增强，具有协同作用。因而，南瓜蛋白可单用及与吉西他滨联合用于治疗胰腺癌。
文档编号A61P35/00GK101850106SQ201010155008
公开日2010年10月6日 申请日期2010年3月31日 优先权日2010年3月31日
发明者吴正财, 许春森, 谢捷明, 陈明晃, 黄鹤光 申请人:福建医科大学;中国科学院福建物质结构研究所
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