一种精氨酸双糖苷检测方法及其医用用途
一种精氨酸双糖苷检测方法及其医用用途
【专利摘要】本发明提供了一种精氨酸双糖苷（AFG）半合成方法及一种新的检测方法。AFG具有提高机体免疫力的作用,AFG能够使由环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数恢复正常，提高淋巴细胞自然转化、T细胞转化和B细胞转化的转化率，并且可以改善小鼠的体内白细胞介素和肿瘤坏死因子水平，具有预防和改善免疫低下的潜质,AFG可应用于癌症患者恢复和提高机体免疫力。采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）定量检测AFG,建立了一种快速、简洁、准确的检测精氨酸双糖苷的方法。
【专利说明】-种精氨酸双糖音检测方法及其医用用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种精氨酸双糖巧(AFG)半合成及一种新检测方法，及其在增强免疫 方面的应用，属化学分析及新药开发领域。
【背景技术】
[0002] 红参系五加科人参属植物人参(化化?^:沪?nsi/w C. A. Meyer)根的加工品，属于传 统中药材，其含有多种生理活性成分，如皂巧，多糖，氨基酸及氨基酸衍生物等，其中皂巧类 成分研究报道较多W，而鲜有对非皂巧类成分尤其是氨基酸衍生物的研究报道。
[0003] 精氨酸双糖巧（Argin^-化uctos^-glucose，AFG)是一种精氨酸衍生物，由郑毅 男等首次从红参中分离得到，是鲜人参加工成红参的蒸制和干燥过程中精氨酸与麦芽糖发 生美拉德反应的中间产物，其化学结构如图10.所示W。据报道，精氨酸双糖巧在红参中含 量非常丰富W，通常采用水提法提取红参中的AFGW。郑毅男等模拟红参加工过程中精氨酸 与麦芽糖发生美拉德反应的条件，W冰醋酸为反应介质，按照一定比例使精氨酸和麦芽糖 发生美拉德反应，再用娃胶湿柱及生物胶柱进行分离纯化本发明对该种合成和提取分 离方法进行了进一步优化。对精氨酸双糖巧体内代谢W及各种药理活性的研究表明，精氨 酸双糖巧在抗氧化、扩张血管、促进微循环、增强免疫力、抗糖尿病、增强细胞膜渗透性、抗 炎、抗衰老、刺激一氧化氮产生等方面有着显著效果精氨酸双糖巧除了可W预防、治 疗疾病，还可W作为护肤品使用，该在很大范围上进一步扩展了精氨酸双糖巧的使用范 围。
[0004] 据报道，红参具有维持体内免疫系统平衡的作用，并能通过调节免疫机能来抵抗 疾病侵袭w，AFG在红参中含量丰富，因此可能在红参的免疫增强药理活性中发挥了重要的 作用。
[0005] 精氨酸及其衍生物的检测多采用柱前衍生化法该种方法本身要求衍生化反应 选择性强、定量进行，还需要对衍生化试剂，反应条件及产物的稳定性等进行考察，不利于 直接、快速地测定氨基酸W。此外，氨基酸自动分析仪的使用也较广泛，该种方法析时间短 检测成本更短，工作效率更高的优点，但是与其他液相色谱仪相比，氨基酸自动分析仪管路 更细，原理及结构更复杂，受缓冲液PH影响更大的因素，即使配制出的相同的缓冲液在不 同的仪器上，由于受到分离柱反应柱填充的紧密程度的影响，最终得到的氨基酸图谱也可 能有明显的差别为了更加快捷，准确的检测精氨酸及其衍生物，近年化，Gyeong Mi 等，建立了一种新的检测氨基酸衍生物的方法一离子色谱，该种方法不仅可W快速检测红 参中美拉德反应产物AFG，而且可W检测出动物血液等生物样本中AFG含量，可用于定量分 析。本专利报告，采用HPLC-LSD检测精氨酸及其衍生物的方法操作更加简单，检测时 间更短，且灵敏度较高。
[000引
【发明内容】
[0007] 本发明继续优化了 AFG的合成、分离方法，具有合成率高，试分离纯化成本低，该 化合物具有药用价值，并且适于工业化生产。
[0008] 本发明精氨酸糖巧的制备方法，包括W下步骤： 1) 将精氨酸与麦芽糖W 1:2的重量比例置入1:15 (精氨酸：冰醋酸，m:v)倍量的冰醋 酸中，在50-10(TC条件下，反应10-60min得总反应物； 2) 将总合成物过阳离子树脂柱，0. 2-2%氨水洗脱，收集各流份，薄层色谱检查，收集Rf 值为0. 2的洗脱液部分，低压浓缩，冷冻干燥成粉末，溶于2倍量的0. 2%醋酸水溶液中，过 聚丙帰醜胺柱W 0.2%醋酸水溶液洗脱，收集各流份，薄层色谱检查，收集Rf值为0.2的 洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥即得。
[0009] 3)本发明还披露液相色谱-蒸发光检测器（HPLC-ELSD)检测AFG的方法。
[0010] 4)本发明还公开了精氨酸糖巧及其组合物在制备治疗环磯醜胺导致的免疫低下 的药物中的新用途。
[0011] 本发明中的药物，其中AFG含量为92-99%，还含有氨基酸、微量元素等。本领域技 术人员可W理解到，该些物质的存在会维持或者增强本发明的药物的作用。
[0012] 实验例1精氨酸双糖巧AFG的合成 1仪器与试剂 抑-1D-50真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司）;EYELA-D阳2110系列旋转 蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；2110化action Collector (USA) ;KQ-250DB型数控 超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸觸器(上海亚荣生化仪器 厂);Sarto;rius BP211D型电子分析天平(十万分之一乂德国赛多利斯公司）;Smart-Ms 2021 磁力揽拌器（SCIF0畑）；电热恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂)。
[0013] k精氨酸（L-Arg)(北京奧博星生物技术有限责任公司）;麦芽糖（北京奧博星生 物技术有限责任公司）；醋酸(北京化工厂，分析纯）；己膳(美国Fisher公司，色谱纯）；阳离 子树脂、薄层层析娃胶H (青岛海阳化工厂）；聚丙帰醜胺凝胶；实验用水为二次蒸觸水。
[0014] 2.方法 2. 1精氨酸双糖巧（AFG)的合成：按质量比为1:2精确称取精氨酸和麦芽糖，加冰醋 酸适量，分别溶解后，80° C磁力揽拌合成30min。反应结束后，39° C水浴锅上挥去冰醋 酸，既得AFG粗品。
[0015] 2. 2精氨酸双糖巧（AFG)的分离及纯化：将得到的AFG粗品加水稀释后上阳离子 树脂柱，用2%氨水洗脱后薄层跟踪AFG，展开系统为；正下醇-冰醋酸-水（2:1:1);显色剂 为；0. 2%巧H丽己醇溶液，8(TC烤板显色，收集Rf值为0. 2的洗脱液。用低压旋转蒸发仪 将收集到的洗脱液浓缩，经真空冷冻干燥机冻干后，取冻干粉末W 0. 2%醋酸水配制成浓度 〇.5g/ml的溶液，过聚丙帰醜胺凝胶（Bio-gel P- II)柱纯化后冻干即可。
[001引 实验例2 HPLC-ELSD法测定红参中精氨酸双糖巧含量 1仪器与试剂 创新通恒高效液相色谱仪，Alltech 2000ES蒸发光散射检测器，N2000色谱工作站。 [0017] 精氨酸对照品（美国Sigma公司），纯度大于99. 0%。H氣己酸(Aladdin试剂有限 公司，GC)，走氣了酸（Aladdin试剂有限公司，GC)，己膳为色谱纯(美国Fisher公司），水 为二次蒸觸水。
[001引 2方法 2. 1色谱条件 色谱柱；Prevail?Ci8(4. 6mmX250mm, 5 y m);流动相 A :己膳，流动相 B 点 Ommol ? L-1 走氣下酸的0. 7% H氣己酸溶液，流动相A与B比例；Omin为0:100, 5min为0:100, 8min 为15:85,25min为35:65;漂移管温度；115°C ;气体流量；3.化-min-i;柱温35°C ;进样 量：20 y L。
[0019] 2. 2标准品及供试品溶液的制备 精密称取精氨酸及精氨酸双糖巧(AFG)适量，分别置容量瓶中，用H重水定溶至刻度， 配置成Img/mL溶液，W 0. 45 y m微孔滤膜过滤，取续滤液，置4°C冰箱保存，备用。
[0020] 3方法学考察 3. 1线性关系和检出限 称取适量AFG，置容量瓶中，用H重水定容至刻度，制成Img/mL AFG溶液，并用此溶液 作为母液，分别稀释出浓度为0. 8, 0. 6, 0. 4, 0. 2, 0. 002mg/mL的AFG水溶液，过0. 45 y m微 孔滤膜，备用。在上述色谱条件下分析，色谱图如图2所示，W各种氨基酸峰面积的对数值 Y为纵坐标，氨基酸质量浓度（g /L)的对数值X为横坐标进行线性回归，得到的线性 回归方程 y = 0. 4996X + 12. 721(R2 = 0. 999)。
[0021] 当信噪比为3时，测得AFG的最低检测限约为0. 002 mg /血。
[0022] 3. 2方法的精密度和重复性考察 取Img/mL标准品溶液20 uL连续进样5次，各组分色谱峰的保留时间波动小于 0. Imin,峰面积的相对标准偏差化SD)为0. 471〇/〇。
[0023] 取同一批样品按供试品溶液制备方法平行制备5份，分别进样20 uL同时取不 同浓度的标准品混合溶液各20 UL进样测定，按外标两点法分别取对数值，计算其含量 的 RSD，结果为 0. 439〇/〇。
[0024] 3. 3供试品溶液的稳定性和加样回收率考察 取同一供试品溶液，分别在保存0, 2, 4, 6, 8, 10 h后W新配制的标准品混合溶液为对 照，按外标两点法分别取对数值计算，其RSD为0.491%,说明供试品溶液在10 h内稳定 性良好。
[00巧]精密称取AFG样品粗粉约25 mg置于锥形瓶中，加入一定量的氨基酸标准品混 合溶液后，按供试品溶液制备方法制备后测定，其RSD为0. 441%，。
[002引 3. 4样品分析 合成粗品用蒸觸水稀释125倍，过0. 45 y m微孔滤膜，备用，进样量为20 y L。
[0027] 4 讨论 目前，氨基酸衍生物的测定方法有很多种，其中精氨酸双糖巧(AFG)可W用氨基酸自动 分析仪柱前衍生法，离子交换色谱法及电喷雾电离质谱法bu进行检测，但未 见采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD)检测AFG。
[0028] 本研究对精氨酸及人工合成精氨酸衍生物进行分析。研究中采用高效液相色 谱-蒸发光散射检测器法对精氨酸及精氨酸双糖巧进行定性和定量测定，样品无需衍生 化可直接进样分析，不需要繁琐的前处理，减小了测定误差，操作简便，结果可靠。
[002引 试验例3 AFG环磯醜胺（CT幻致免疫抑制小鼠免疫功能的影响 1材料与方法 1.1仪器、材料与试剂 离也机（Eppendo计，型号5430 R),酶标仪（BIO-RAD, iMark),超净工作台（博讯，型号 操作皿-1360)，显微镜（蔡康型号XDS-200)，培养箱（美国化ermo公司，型号3100)。 刀豆蛋白A(ConA, Sigma,批号C-2010);脂多糖（LPS，Sigma,批号L2880);二苯基四 氮哇漠盐（MTT，Sigma,批号0733);二甲基亚讽（DMS0,北京化工厂，批号20120210);小牛 血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，140207) ;RPMI1640培养基（GIBC0, 795681);白 细胞介素2试剂盒（IL-2试剂盒，美国R&D，DZE20054);肿瘤坏死因子试剂盒（TNF-a试剂 盒，美国 R&D，DZE30223)。
[0030] 精氨酸双糖AFG,由本实验室自制，纯度〉95%(HPLC) ;BALB/C小鼠（20±2g，吉林 大学实验动物中也提供，SCXK(吉））；SPF级ICR小鼠（1扩22g，吉林省亿斯实验动物中也 提供，SCXK (吉）-2011-0004)，雌性。
[0031] 1.2实验方法 1. 2. 1动物分组和给药 80只ICR小鼠，适应性饲养一周，随机分成8组，正常对照组，免疫抑制对照组，A1:免 疫抑制AFG高剂量组（50mg ? kg-i AFG)，A2 ;免疫抑制AFG中剂量组（30mg ? kg-i AFG)，A3 : 免疫抑制 AFG 低剂量组（lOmg ? kg-i AFG)，B1:AFG 高剂量组（50mg ? kg-i AFG)，B2 ;AFG 中 剂量组（30mg ? kg-i AFG), B3 ;AFG 低剂量组（lOmg ? kg-i AFG)。AFG 用生理盐水溶解，W 10 血*kg-i的体积灌胃给药，1次/d，连续30 d。模型组及A1，A2，A3组于第1、2、3、9、16和 23天腹腔注射环磯醜胺（CTX) 80 mg . kg-i。
[0032] 1. 2. 2小鼠免疫器官脏器指数测定 给药30天后，小鼠眼球采血，分离血清，分装后置-2(TC冰箱保存，待用。将小鼠颈 椎脱白处死，取其胸腺和脾脏用生理盐水漂洗，滤纸吸干水分，称量，计算脾脏指数和胸 腺指数。
[0033] 脏器指数佩=脏器重量（g) /体重（g) X 100 1.2.3体外淋己细胞增殖实验 BALB/C小鼠，脱白处死，置体积分数为75%的酒精浸泡5 min,在无菌条件下取出 脾脏，去除被膜，用Hanks'液洗两次，剪碎，把组织碎块放入培养皿内，反复研磨， 制成脾细胞息液，用200目网过滤脾细胞，然后进行细胞计数，配成2X 106细胞息液待 用。实验分为空白组，阴性对照组，阳性对照组和样品组（AFG6个浓度，分别为1、2、4、6、8、 10 y g ?血-1)。将调整好的细胞息液加入96孔细胞培养板中，每组3个复孔，空白组加入 100 uL培养基，其他各组每孔加100 uL细胞息液，置培养箱中比后取出。空白组和阴性 对照组各加入100 y L培养基，阳性对照组加入50 y g ? m。Con A 10 y L置37°C，5%C02 赔箱中培养4她，取出，每孔加入5mg*mL-i MTT溶液20uL继续培养化后，取出培养板， 2000rmp.mirTi，离也lOmin，小也将上清液吸去，加入150UL DMS0,充分溶解结晶，用酶 标仪比色，490nm测定各孔0D值。
[0034] 1.2. 4淋己细胞转化实验 小鼠分组同上，灌胃给药，连续30天，末次给药后Ih，将小鼠脱白处死，置体积 分数为75%的酒精浸泡5 min,在无菌条件下取出脾脏，去除被膜，用Hank s'液洗两 次，剪碎，把组织碎块放入培养皿内，反复研磨，制成脾细胞息液，用200目网过滤脾 淋己细胞，然后进行细胞计数，配成2X106细胞息液待用。实验分为空白孔，自然转化 空，刀豆蛋白（Con A)刺激孔和脂多糖（LPS)刺激孔，每孔设3个复孔。将各组细胞分别加 入96孔板中，空白孔和自然转化孔分别加入100 ill培养液，Con A刺激孔加入100 y L浓 度为 5. 0 y g ?血-1 Con A, LPS 刺激孔加入 100 y L 浓度为 y g ?血LPS.置 37°C，5%C〇2 赔箱中培养4她，取出，每孔加入5mg*mL-i MTT溶液20uL继续培养化后，取出培养板， 2000rmp ? min4离也lOmin，小也将上清液吸去，加入150y LDMS0,充分溶解结晶，用酶标 仪比色，490nm测定各孔0D值。 1. 2. 5肿瘤坏死因子TNF-a及白细胞介素IL-2的测定 取分装好的小鼠血清，采用酶联免疫试剂盒的测定，严格按照化ISA说明书操作。
[00巧]1. 2. 6统计学处理 采用SPSS17.0软件，数据W(x±s)表示，统计方法应用单因素方差分析t可X0.01， ##V<0. 01，SSS户<0. 01表明具有极显著性，可X0. 05, #V<〇. 05, SS户<0. 05表明具有显著性。
[0036] 2实验结果 2. 1 AFG对小鼠脏器指数的影响 表1.可知与空白组相比模型组脾指数，胸腺指数均下降，且具有显著性如<〇. 05)， 说明造模成功。但各给药组脾指数，胸腺指数都明显上升，与模型组相比有显著性差异 (户<0.05)，但与空白组相比并无显著性差异。说明AFG对于免疫抑制小鼠的脾和胸腺具有 增重作用，可使脾和胸腺恢复正常水平，对正常小鼠无影响。
[0037] Tab. 1 Effects of AFG on thymus coefficient and spleen coefficient in mice (五 + s) 表1. AFG对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾指数的影响（7 ±s)
【权利要求】
1. 精氨酸双糖苷(AFG)的制备方法，其具体制备方法如下： (1)精氨酸双糖苷（AFG)的合成：按质量比1:2精确称取精氨酸和麦芽糖，加冰醋酸适 量，溶解后，在50-100° C条件下搅拌一种，反应10-60min，得AFG粗品； ⑵精氨酸双糖苷（AFG)的分离及纯化：取AFG粗品上阳离子交换树脂柱，用0. 2-2% 氨水洗脱，收集洗脱液，薄层色谱检查(展开剂为正丁醇-冰醋酸-水（2:1:1 )，以0. 2%茚三 酮乙醇溶液显色，Rf值为0. 2)，收集Rf值为0. 2部分洗脱液，真空冷冻干燥，得粉末，溶于 水中，过聚丙烯酰胺柱，以0.2%醋酸水溶液洗脱，收集Rf值为0.2的洗脱液，减压浓缩， 冷冻干燥即得。
2. 根据权利要求1，所得精氨酸双糖苷用高效液相-蒸发光散射（HPLC-ELSD)检测。
3. 根据权利要求1，所得精氨酸双糖苷能使环磷酰胺所致免疫力低下的小鼠提高免疫 力，因此可用于人癌症化疗期间的辅助治疗药。
4. 根据权利要求1，所得的精氨酸双糖苷(AFG)能够提高T淋巴细胞和B淋巴细胞的 转化率，能显著提高免疫抑制小鼠肿瘤坏死因子TNF- a含量，并使其保持在正常水平，可 用于抗炎及抗感染类药物。
【文档编号】C07H1/00GK104447892SQ201410461616
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】邵莹, 郑毅男, 孙荣花, 李慧萍, 丁传波 申请人:郑毅男
【专利摘要】本发明提供了一种精氨酸双糖苷（AFG）半合成方法及一种新的检测方法。AFG具有提高机体免疫力的作用,AFG能够使由环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数恢复正常，提高淋巴细胞自然转化、T细胞转化和B细胞转化的转化率，并且可以改善小鼠的体内白细胞介素和肿瘤坏死因子水平，具有预防和改善免疫低下的潜质,AFG可应用于癌症患者恢复和提高机体免疫力。采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）定量检测AFG,建立了一种快速、简洁、准确的检测精氨酸双糖苷的方法。
【专利说明】-种精氨酸双糖音检测方法及其医用用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种精氨酸双糖巧(AFG)半合成及一种新检测方法，及其在增强免疫 方面的应用，属化学分析及新药开发领域。
【背景技术】
[0002] 红参系五加科人参属植物人参(化化?^:沪?nsi/w C. A. Meyer)根的加工品，属于传 统中药材，其含有多种生理活性成分，如皂巧，多糖，氨基酸及氨基酸衍生物等，其中皂巧类 成分研究报道较多W，而鲜有对非皂巧类成分尤其是氨基酸衍生物的研究报道。
[0003] 精氨酸双糖巧（Argin^-化uctos^-glucose，AFG)是一种精氨酸衍生物，由郑毅 男等首次从红参中分离得到，是鲜人参加工成红参的蒸制和干燥过程中精氨酸与麦芽糖发 生美拉德反应的中间产物，其化学结构如图10.所示W。据报道，精氨酸双糖巧在红参中含 量非常丰富W，通常采用水提法提取红参中的AFGW。郑毅男等模拟红参加工过程中精氨酸 与麦芽糖发生美拉德反应的条件，W冰醋酸为反应介质，按照一定比例使精氨酸和麦芽糖 发生美拉德反应，再用娃胶湿柱及生物胶柱进行分离纯化本发明对该种合成和提取分 离方法进行了进一步优化。对精氨酸双糖巧体内代谢W及各种药理活性的研究表明，精氨 酸双糖巧在抗氧化、扩张血管、促进微循环、增强免疫力、抗糖尿病、增强细胞膜渗透性、抗 炎、抗衰老、刺激一氧化氮产生等方面有着显著效果精氨酸双糖巧除了可W预防、治 疗疾病，还可W作为护肤品使用，该在很大范围上进一步扩展了精氨酸双糖巧的使用范 围。
[0004] 据报道，红参具有维持体内免疫系统平衡的作用，并能通过调节免疫机能来抵抗 疾病侵袭w，AFG在红参中含量丰富，因此可能在红参的免疫增强药理活性中发挥了重要的 作用。
[0005] 精氨酸及其衍生物的检测多采用柱前衍生化法该种方法本身要求衍生化反应 选择性强、定量进行，还需要对衍生化试剂，反应条件及产物的稳定性等进行考察，不利于 直接、快速地测定氨基酸W。此外，氨基酸自动分析仪的使用也较广泛，该种方法析时间短 检测成本更短，工作效率更高的优点，但是与其他液相色谱仪相比，氨基酸自动分析仪管路 更细，原理及结构更复杂，受缓冲液PH影响更大的因素，即使配制出的相同的缓冲液在不 同的仪器上，由于受到分离柱反应柱填充的紧密程度的影响，最终得到的氨基酸图谱也可 能有明显的差别为了更加快捷，准确的检测精氨酸及其衍生物，近年化，Gyeong Mi 等，建立了一种新的检测氨基酸衍生物的方法一离子色谱，该种方法不仅可W快速检测红 参中美拉德反应产物AFG，而且可W检测出动物血液等生物样本中AFG含量，可用于定量分 析。本专利报告，采用HPLC-LSD检测精氨酸及其衍生物的方法操作更加简单，检测时 间更短，且灵敏度较高。
[000引
【发明内容】
[0007] 本发明继续优化了 AFG的合成、分离方法，具有合成率高，试分离纯化成本低，该 化合物具有药用价值，并且适于工业化生产。
[0008] 本发明精氨酸糖巧的制备方法，包括W下步骤： 1) 将精氨酸与麦芽糖W 1:2的重量比例置入1:15 (精氨酸：冰醋酸，m:v)倍量的冰醋 酸中，在50-10(TC条件下，反应10-60min得总反应物； 2) 将总合成物过阳离子树脂柱，0. 2-2%氨水洗脱，收集各流份，薄层色谱检查，收集Rf 值为0. 2的洗脱液部分，低压浓缩，冷冻干燥成粉末，溶于2倍量的0. 2%醋酸水溶液中，过 聚丙帰醜胺柱W 0.2%醋酸水溶液洗脱，收集各流份，薄层色谱检查，收集Rf值为0.2的 洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥即得。
[0009] 3)本发明还披露液相色谱-蒸发光检测器（HPLC-ELSD)检测AFG的方法。
[0010] 4)本发明还公开了精氨酸糖巧及其组合物在制备治疗环磯醜胺导致的免疫低下 的药物中的新用途。
[0011] 本发明中的药物，其中AFG含量为92-99%，还含有氨基酸、微量元素等。本领域技 术人员可W理解到，该些物质的存在会维持或者增强本发明的药物的作用。
[0012] 实验例1精氨酸双糖巧AFG的合成 1仪器与试剂 抑-1D-50真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司）;EYELA-D阳2110系列旋转 蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；2110化action Collector (USA) ;KQ-250DB型数控 超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸觸器(上海亚荣生化仪器 厂);Sarto;rius BP211D型电子分析天平(十万分之一乂德国赛多利斯公司）;Smart-Ms 2021 磁力揽拌器（SCIF0畑）；电热恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂)。
[0013] k精氨酸（L-Arg)(北京奧博星生物技术有限责任公司）;麦芽糖（北京奧博星生 物技术有限责任公司）；醋酸(北京化工厂，分析纯）；己膳(美国Fisher公司，色谱纯）；阳离 子树脂、薄层层析娃胶H (青岛海阳化工厂）；聚丙帰醜胺凝胶；实验用水为二次蒸觸水。
[0014] 2.方法 2. 1精氨酸双糖巧（AFG)的合成：按质量比为1:2精确称取精氨酸和麦芽糖，加冰醋 酸适量，分别溶解后，80° C磁力揽拌合成30min。反应结束后，39° C水浴锅上挥去冰醋 酸，既得AFG粗品。
[0015] 2. 2精氨酸双糖巧（AFG)的分离及纯化：将得到的AFG粗品加水稀释后上阳离子 树脂柱，用2%氨水洗脱后薄层跟踪AFG，展开系统为；正下醇-冰醋酸-水（2:1:1);显色剂 为；0. 2%巧H丽己醇溶液，8(TC烤板显色，收集Rf值为0. 2的洗脱液。用低压旋转蒸发仪 将收集到的洗脱液浓缩，经真空冷冻干燥机冻干后，取冻干粉末W 0. 2%醋酸水配制成浓度 〇.5g/ml的溶液，过聚丙帰醜胺凝胶（Bio-gel P- II)柱纯化后冻干即可。
[001引 实验例2 HPLC-ELSD法测定红参中精氨酸双糖巧含量 1仪器与试剂 创新通恒高效液相色谱仪，Alltech 2000ES蒸发光散射检测器，N2000色谱工作站。 [0017] 精氨酸对照品（美国Sigma公司），纯度大于99. 0%。H氣己酸(Aladdin试剂有限 公司，GC)，走氣了酸（Aladdin试剂有限公司，GC)，己膳为色谱纯(美国Fisher公司），水 为二次蒸觸水。
[001引 2方法 2. 1色谱条件 色谱柱；Prevail?Ci8(4. 6mmX250mm, 5 y m);流动相 A :己膳，流动相 B 点 Ommol ? L-1 走氣下酸的0. 7% H氣己酸溶液，流动相A与B比例；Omin为0:100, 5min为0:100, 8min 为15:85,25min为35:65;漂移管温度；115°C ;气体流量；3.化-min-i;柱温35°C ;进样 量：20 y L。
[0019] 2. 2标准品及供试品溶液的制备 精密称取精氨酸及精氨酸双糖巧(AFG)适量，分别置容量瓶中，用H重水定溶至刻度， 配置成Img/mL溶液，W 0. 45 y m微孔滤膜过滤，取续滤液，置4°C冰箱保存，备用。
[0020] 3方法学考察 3. 1线性关系和检出限 称取适量AFG，置容量瓶中，用H重水定容至刻度，制成Img/mL AFG溶液，并用此溶液 作为母液，分别稀释出浓度为0. 8, 0. 6, 0. 4, 0. 2, 0. 002mg/mL的AFG水溶液，过0. 45 y m微 孔滤膜，备用。在上述色谱条件下分析，色谱图如图2所示，W各种氨基酸峰面积的对数值 Y为纵坐标，氨基酸质量浓度（g /L)的对数值X为横坐标进行线性回归，得到的线性 回归方程 y = 0. 4996X + 12. 721(R2 = 0. 999)。
[0021] 当信噪比为3时，测得AFG的最低检测限约为0. 002 mg /血。
[0022] 3. 2方法的精密度和重复性考察 取Img/mL标准品溶液20 uL连续进样5次，各组分色谱峰的保留时间波动小于 0. Imin,峰面积的相对标准偏差化SD)为0. 471〇/〇。
[0023] 取同一批样品按供试品溶液制备方法平行制备5份，分别进样20 uL同时取不 同浓度的标准品混合溶液各20 UL进样测定，按外标两点法分别取对数值，计算其含量 的 RSD，结果为 0. 439〇/〇。
[0024] 3. 3供试品溶液的稳定性和加样回收率考察 取同一供试品溶液，分别在保存0, 2, 4, 6, 8, 10 h后W新配制的标准品混合溶液为对 照，按外标两点法分别取对数值计算，其RSD为0.491%,说明供试品溶液在10 h内稳定 性良好。
[00巧]精密称取AFG样品粗粉约25 mg置于锥形瓶中，加入一定量的氨基酸标准品混 合溶液后，按供试品溶液制备方法制备后测定，其RSD为0. 441%，。
[002引 3. 4样品分析 合成粗品用蒸觸水稀释125倍，过0. 45 y m微孔滤膜，备用，进样量为20 y L。
[0027] 4 讨论 目前，氨基酸衍生物的测定方法有很多种，其中精氨酸双糖巧(AFG)可W用氨基酸自动 分析仪柱前衍生法，离子交换色谱法及电喷雾电离质谱法bu进行检测，但未 见采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD)检测AFG。
[0028] 本研究对精氨酸及人工合成精氨酸衍生物进行分析。研究中采用高效液相色 谱-蒸发光散射检测器法对精氨酸及精氨酸双糖巧进行定性和定量测定，样品无需衍生 化可直接进样分析，不需要繁琐的前处理，减小了测定误差，操作简便，结果可靠。
[002引 试验例3 AFG环磯醜胺（CT幻致免疫抑制小鼠免疫功能的影响 1材料与方法 1.1仪器、材料与试剂 离也机（Eppendo计，型号5430 R),酶标仪（BIO-RAD, iMark),超净工作台（博讯，型号 操作皿-1360)，显微镜（蔡康型号XDS-200)，培养箱（美国化ermo公司，型号3100)。 刀豆蛋白A(ConA, Sigma,批号C-2010);脂多糖（LPS，Sigma,批号L2880);二苯基四 氮哇漠盐（MTT，Sigma,批号0733);二甲基亚讽（DMS0,北京化工厂，批号20120210);小牛 血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，140207) ;RPMI1640培养基（GIBC0, 795681);白 细胞介素2试剂盒（IL-2试剂盒，美国R&D，DZE20054);肿瘤坏死因子试剂盒（TNF-a试剂 盒，美国 R&D，DZE30223)。
[0030] 精氨酸双糖AFG,由本实验室自制，纯度〉95%(HPLC) ;BALB/C小鼠（20±2g，吉林 大学实验动物中也提供，SCXK(吉））；SPF级ICR小鼠（1扩22g，吉林省亿斯实验动物中也 提供，SCXK (吉）-2011-0004)，雌性。
[0031] 1.2实验方法 1. 2. 1动物分组和给药 80只ICR小鼠，适应性饲养一周，随机分成8组，正常对照组，免疫抑制对照组，A1:免 疫抑制AFG高剂量组（50mg ? kg-i AFG)，A2 ;免疫抑制AFG中剂量组（30mg ? kg-i AFG)，A3 : 免疫抑制 AFG 低剂量组（lOmg ? kg-i AFG)，B1:AFG 高剂量组（50mg ? kg-i AFG)，B2 ;AFG 中 剂量组（30mg ? kg-i AFG), B3 ;AFG 低剂量组（lOmg ? kg-i AFG)。AFG 用生理盐水溶解，W 10 血*kg-i的体积灌胃给药，1次/d，连续30 d。模型组及A1，A2，A3组于第1、2、3、9、16和 23天腹腔注射环磯醜胺（CTX) 80 mg . kg-i。
[0032] 1. 2. 2小鼠免疫器官脏器指数测定 给药30天后，小鼠眼球采血，分离血清，分装后置-2(TC冰箱保存，待用。将小鼠颈 椎脱白处死，取其胸腺和脾脏用生理盐水漂洗，滤纸吸干水分，称量，计算脾脏指数和胸 腺指数。
[0033] 脏器指数佩=脏器重量（g) /体重（g) X 100 1.2.3体外淋己细胞增殖实验 BALB/C小鼠，脱白处死，置体积分数为75%的酒精浸泡5 min,在无菌条件下取出 脾脏，去除被膜，用Hanks'液洗两次，剪碎，把组织碎块放入培养皿内，反复研磨， 制成脾细胞息液，用200目网过滤脾细胞，然后进行细胞计数，配成2X 106细胞息液待 用。实验分为空白组，阴性对照组，阳性对照组和样品组（AFG6个浓度，分别为1、2、4、6、8、 10 y g ?血-1)。将调整好的细胞息液加入96孔细胞培养板中，每组3个复孔，空白组加入 100 uL培养基，其他各组每孔加100 uL细胞息液，置培养箱中比后取出。空白组和阴性 对照组各加入100 y L培养基，阳性对照组加入50 y g ? m。Con A 10 y L置37°C，5%C02 赔箱中培养4她，取出，每孔加入5mg*mL-i MTT溶液20uL继续培养化后，取出培养板， 2000rmp.mirTi，离也lOmin，小也将上清液吸去，加入150UL DMS0,充分溶解结晶，用酶 标仪比色，490nm测定各孔0D值。
[0034] 1.2. 4淋己细胞转化实验 小鼠分组同上，灌胃给药，连续30天，末次给药后Ih，将小鼠脱白处死，置体积 分数为75%的酒精浸泡5 min,在无菌条件下取出脾脏，去除被膜，用Hank s'液洗两 次，剪碎，把组织碎块放入培养皿内，反复研磨，制成脾细胞息液，用200目网过滤脾 淋己细胞，然后进行细胞计数，配成2X106细胞息液待用。实验分为空白孔，自然转化 空，刀豆蛋白（Con A)刺激孔和脂多糖（LPS)刺激孔，每孔设3个复孔。将各组细胞分别加 入96孔板中，空白孔和自然转化孔分别加入100 ill培养液，Con A刺激孔加入100 y L浓 度为 5. 0 y g ?血-1 Con A, LPS 刺激孔加入 100 y L 浓度为 y g ?血LPS.置 37°C，5%C〇2 赔箱中培养4她，取出，每孔加入5mg*mL-i MTT溶液20uL继续培养化后，取出培养板， 2000rmp ? min4离也lOmin，小也将上清液吸去，加入150y LDMS0,充分溶解结晶，用酶标 仪比色，490nm测定各孔0D值。 1. 2. 5肿瘤坏死因子TNF-a及白细胞介素IL-2的测定 取分装好的小鼠血清，采用酶联免疫试剂盒的测定，严格按照化ISA说明书操作。
[00巧]1. 2. 6统计学处理 采用SPSS17.0软件，数据W(x±s)表示，统计方法应用单因素方差分析t可X0.01， ##V<0. 01，SSS户<0. 01表明具有极显著性，可X0. 05, #V<〇. 05, SS户<0. 05表明具有显著性。
[0036] 2实验结果 2. 1 AFG对小鼠脏器指数的影响 表1.可知与空白组相比模型组脾指数，胸腺指数均下降，且具有显著性如<〇. 05)， 说明造模成功。但各给药组脾指数，胸腺指数都明显上升，与模型组相比有显著性差异 (户<0.05)，但与空白组相比并无显著性差异。说明AFG对于免疫抑制小鼠的脾和胸腺具有 增重作用，可使脾和胸腺恢复正常水平，对正常小鼠无影响。
[0037] Tab. 1 Effects of AFG on thymus coefficient and spleen coefficient in mice (五 + s) 表1. AFG对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾指数的影响（7 ±s)
【权利要求】
1. 精氨酸双糖苷(AFG)的制备方法，其具体制备方法如下： (1)精氨酸双糖苷（AFG)的合成：按质量比1:2精确称取精氨酸和麦芽糖，加冰醋酸适 量，溶解后，在50-100° C条件下搅拌一种，反应10-60min，得AFG粗品； ⑵精氨酸双糖苷（AFG)的分离及纯化：取AFG粗品上阳离子交换树脂柱，用0. 2-2% 氨水洗脱，收集洗脱液，薄层色谱检查(展开剂为正丁醇-冰醋酸-水（2:1:1 )，以0. 2%茚三 酮乙醇溶液显色，Rf值为0. 2)，收集Rf值为0. 2部分洗脱液，真空冷冻干燥，得粉末，溶于 水中，过聚丙烯酰胺柱，以0.2%醋酸水溶液洗脱，收集Rf值为0.2的洗脱液，减压浓缩， 冷冻干燥即得。
2. 根据权利要求1，所得精氨酸双糖苷用高效液相-蒸发光散射（HPLC-ELSD)检测。
3. 根据权利要求1，所得精氨酸双糖苷能使环磷酰胺所致免疫力低下的小鼠提高免疫 力，因此可用于人癌症化疗期间的辅助治疗药。
4. 根据权利要求1，所得的精氨酸双糖苷(AFG)能够提高T淋巴细胞和B淋巴细胞的 转化率，能显著提高免疫抑制小鼠肿瘤坏死因子TNF- a含量，并使其保持在正常水平，可 用于抗炎及抗感染类药物。
【文档编号】C07H1/00GK104447892SQ201410461616
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】邵莹, 郑毅男, 孙荣花, 李慧萍, 丁传波 申请人:郑毅男
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