一种药物组合物在制备通过调节ampk-glut4途径而改善糖代谢紊乱药物中的应用的制作方法
专利名称：一种药物组合物在制备通过调节ampk-glut4途径而改善糖代谢紊乱药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药学领域，涉及一种药物组合物在制备通过调节AMPK-GLUT4途径而改善糖代谢紊乱药物中的应用。
背景技术：
2型糖尿病(T2DM)是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。国际糖尿病联合会(IDF) 2006发表的统计数据显示，在过去20年，全球糖尿病患者人数从3000万剧增到 2. 3亿。世界卫生组织专家预计，到2025年全球糖尿病患者将达到3. 5亿。印度、中国、美国依次为全球糖尿病患者数量最多的三个国家，估计中国糖尿病患者总人数近4000万，仅次于印度，居世界第二位，占世界的四.63%。T2DM的防治在可预见的相当长时期内都将是人类面临的严峻挑战。2型糖尿病也叫成人发病型糖尿病，多在35 40岁之后发病，占糖尿病患者90% 以上。2型糖尿病病友体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素可能处于一种相对缺乏的状态。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌。但到后期仍有部分病人需要像1型糖尿病那样进行胰岛素治疗。2型糖尿病大致具有以下3个特点第一个特点，2型糖尿病好发于成年人，尤其以中老年人为多。多次糖尿病流行病学研究结果都表明，2型糖尿病发病的年龄多在40-60岁，从40岁起，患病率逐渐增加，到老年期达到高峰。青年发病的成年型糖尿病相对来说，还是十分少见的。第二个特点是病情一般比较缓和、隐蔽，也就是说与1 型糖尿病相比，不那么来势汹汹。2型糖尿病病人症状不明显，不见得每个患者都有喝得多、 尿得多、吃得多的表现，多数人也没有显著的消瘦，当然体力和体重不同程度地下降还是比较常见的。第三个特点就是患者往往不需要靠胰岛素治疗来维持生命。也就是说，患者不打胰岛素也不至于很快就发生酮症酸中毒而危及生命。所以，2型糖尿病原来又叫非胰岛素依赖型糖尿病。2型糖尿病病人有时也需要使用胰岛素治疗，但多数是因为血糖控制不理想， 或者是因为发生了急性并发症或者糖尿病的慢性并发症较重，而不像1型糖尿病病人那样是为了维持生命。2型糖尿病是比1型糖尿病更为复杂的疾病，特别是在早期体内胰岛素仍然能自我产生时却更容易治疗。由于早期症状轻微(如无酮症酸中毒和昏迷等)且多散发，因此 2型糖尿病多在病情进展多年后方被诊断。然而，2型糖尿病的控制不当会导致诸如肾衰、 失明、伤口愈合慢、动脉病(包括冠状动脉疾病)等严重的并发症。2型糖尿病患者其主要特征为胰岛素抵抗，相对胰岛素缺乏和高血糖；肝脏葡萄糖产量的增加(如来源于肝糖原的降解)，特别是在不当时机的增加(典型的原因是胰岛素水平紊乱，而胰岛素的作用之一正是调控肝脏此功能)；肌肉和脂肪组织(主要)中胰岛素介导的葡萄糖转运的减少(受体和受体后途径缺陷)；胰岛β细胞功能受损——缺失了高血糖水平刺激时早期胰岛素释放的功能。
GLUT4是葡萄糖转运蛋白家族GLUTs成员之一，以往认为GLUT4主要存在于骨胳肌、心肌及脂肪组织中。研究表明，GLUT4还存在于人和鼠胰岛组织细胞等处，并有可能发挥着独特的作用。研究资料表明，全身70-80%的葡萄糖摄取由骨骼肌细胞的葡萄糖转运因子4(GLUT-4)完成，它是葡萄糖摄取及处置的限速因子。2型糖尿病GLUT4水平普遍下降， 使得胰岛素刺激的葡萄糖转运功能下降，诱导胰岛素抵抗。GLUT4的主要功能是在肌肉和脂肪组织中转运葡萄糖。在没有刺激时，90%以上的GLUT4分布于细胞内，如微粒体、高尔基复合体、管形囊等囊泡样结构中，这些囊泡样结构称作GLUT4储存囊泡。在胰岛素刺激或运动刺激下，脂肪细胞和骨骼肌细胞中的GLUT4 会从细胞内转位至细胞膜上并与细胞膜融合，而葡萄糖便顺着GLUT4的亲水性中央通道进入细胞，完成葡萄糖的摄取与转运。当细胞内总蛋白下降或GLUT-4从内膜向外膜转运障碍时，直接引起葡萄糖利用度降低，导致胰岛素敏感性降低，发生胰岛素抵抗，导致糖脂代谢紊乱。AMPK作为一种重要的蛋白激酶参与多种代谢过程，同时介导了细胞对营养和环境变化的适应，被称为“能量感受器”。Koistrnen等对T2DM患者和正常对照组进行的体外试验显示，AICAR通过增加细胞表面GLUT4含量，增加了葡萄糖转运，特别是在顶时的骨骼肌细胞中，这一过程依赖AMH(途径。MacLcan等对几种转基因鼠的研究发现，运动可增加 GLUT4基因的表达，与AMH(诱导GLUT4基因表达所用的时问和所作用的启动子基本一致，进一步证实运动是通过AMPK来增加GLOT4表达。目前，大部分糖尿病人存在胰岛素抵抗，糖代谢紊乱等问题。长年来没有得到很好的解决，发明人通过对糖敏灵深入的研究，意外的发现糖敏灵可以通过调节AMPK-GLUT4可以有效地改善胰岛素抵抗，改善糖代谢紊乱，为糖敏灵新的治疗用途提供了依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种药物组合物在制备通过调节AMPK-GLUT4途径而改善糖代谢紊乱的药物中的应用。本发明所述的药物组合物(又称为糖敏灵制剂，开郁清热制剂)，由下列重量份的中药原料药为组方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1_6份， 半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。上述组方中还可以加入中药山楂，得到的配方为天花粉10-30份、柴胡10-30份、 枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1_12份、白芍3-15份、乌梅 5-20份、山楂3-15份。上述组方中还可以加入中药山楂，黄精，人参和苦瓜，得到的配方为天花粉 10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄，1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1_12 份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份、黄精3_15份、人参3_15份、苦瓜3_15份。优选的本发明的配方为天花粉9份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、 黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅9份。或天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、 白芍9份、乌梅15份、山楂9份。
或天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、 白芍9份、乌梅15份、山楂9份、黄精9份、人参9份、苦瓜9份。以上组成中，重量是以生药计算的，份为重量份，若以克为单位，以上组成可制成药物制剂5-50个制剂单位，所述制剂单位指，制成的成品药物制剂，如制成固体制剂5-50 单位，口服液5-50ml等。以上组成可制成1-6次服用剂量的制剂，如作为片剂，制成18片，每次服用剂量可以是3-18片，共可服用1-6次。如作为颗粒剂，制成6袋，每次服用1-2袋，共可服用3-6次。以上组成是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤为单位，或以吨为单位，小规模生产也可以以毫克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间的生药材重量配比的比例不变。以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，如重症或轻症，肥胖或瘦小的病人，可以相应调整组成的量的配比，增加或减少不超过300%，药效不变。以上组成中的单味中药，尤其是臣药和佐药，也可以被适当的具有相同药性的中药替换，替换后的中药制剂其药物作用不变。本发明的中药组合物，是通过将上述配方组成的中药原料经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成的。所述活性物质可以通过分别提取中药原料得到，也可以通过共同提取中药原料得到，也可以通过其他方式得到，如通过粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、层析等方法得到、这些活性物质可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根据制剂的不同需要决定制成不同的浓度。本发明的中药组合物中的药物活性物质，其在制剂中所占重量百分比可以是 0. 1-99.9%，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每衣寸。本发明的中药组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、 薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、
丹剂、膏剂等。本发明的中药组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，
5或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉齐U、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。本发明的中药组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA 二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、 麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β -环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次 1-20剂，如1-20袋或粒或片。本发明的组合物是经过以下方法制备，具体步骤如下本发明所述糖敏灵制剂的制备方法为(1)按比例取上述原料，( 加入4倍量 70-90%的乙醇，50-80°C减压回收乙醇，70-90°C真空干燥，粉碎过80目筛，得药物提取物； 加入辅料制成任意种药剂学上可以接受的剂型。本发明的药物组合物及其制备方法可参考中国专利CN1M6929。通过以下实验进一步说明本发明的药物组合物的治疗效果。1.材料与方法1. 1实验动物以自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病对照鼠LETO鼠为实验对象。大鼠皆为雄性，OLETF 40只，LETO大鼠10只，四周龄，由日本大冢制药株式会社德岛研究所引进。大鼠在无特定病原体级(SPF级，specific pathogen-free)条件下单笼饲养，饲以标准饲料。环境温度控制在22-25°C，湿度为55士5%，12/12小时光照黑暗循环(光照时间7:00-19:00)，自由获取食物和饮水。饲养地点中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心SPF级动物饲养房。1. 2分组及给药1. 2. 10LETF糖尿病诊断分组标准大鼠定期行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。试验前隔夜禁食15小时、不禁水，按2g/ kg予30 %葡萄糖溶液灌胃(取葡萄糖粉82. 5g，加蒸馏水定容至250ml，加热溶解为清壳液体，得到浓度为30%葡萄糖溶液)。于空腹及糖负荷后30、60、90和120min取血，以德国内卡BI0SEN5030快速葡萄糖分析仪测定血糖值。血糖峰值> 16. 7mmol/L和负荷后120min血糖> 11. lmmol/L诊为糖尿病，具备上述一条者为糖耐量减低。1.2.2实验动物分组及给药至30周时，共有成模OLETF鼠27只，随机分为模型组、罗格列酮组、糖敏灵组， LETO为空白对照组。罗格列酮组罗格列酮(文迪雅)史克必成天津有限公司产品每片含马来酸罗格列酮細g，购自由美国葛兰素史克(中国)投资有限公司，临用前搅拌至完全溶解，以蒸馏水稀释，给药剂量为ang/kg/cf1。糖敏灵组(即开郁清热组)，根据本发明实施例1配方提取制成浸膏，4°C冰箱保存，以蒸馏水稀释，灌胃剂量为tog/kg/cf1 (按所含原药材量计算)。模型组与空白组以等量蒸馏水灌胃，各组均灌胃给药12周，每日1次。2指标与检测2. 1高胰岛素正葡萄糖钳夹试验大鼠隔夜禁食，不禁水，称重后以2%的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，仰卧位固定，麻醉显效后，切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌肉，分离暴露右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉，进行右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉插管，穿线结扎，固定(美国产硬膜外麻醉用硅胶导管，内径0. 6mm，外径Imm)，并用含肝素50U/ml的生理盐水充满导管， 保持其通畅。动脉插管以取血测血糖，静脉插管连接小三通管，出口端与静脉相连，两进口端分别与微电脑数字式微量注射泵连接以输注胰岛素及葡萄糖。插管完毕后，将大鼠静置 30分钟后测定血糖。并同时对其进行保温。胰岛素、20%葡萄糖分别用2个微电脑数字式微量注射泵由颈静脉泵入，血液标本由颈动脉导管获取。将静置30分钟的插管大鼠颈动脉导管所接的注射器取下，取血一滴，用微型血糖仪在30s内测定基础血糖值。开始时先恒定输注短效猪胰岛素(输注速率为8mU/kg · mirT1，临用时胰岛素用 0. 5%牛血清白蛋白稀释)。每10分钟测定血糖一次，当血糖值超出基础值士0. 5mmol/L的范围时，即开始输注浓度为20%葡萄糖，调整葡萄糖输注速度(即葡萄糖输注率，GIR)，使血糖值控制在基础值士0. 5mmol/L的范围左右，如果血糖值超出基础值士0. 5mmol/L的范围，即可继续输注葡萄糖。输注葡萄糖后仍每10分钟测一次血糖，并根据血糖值在最短的时间内调整葡萄糖输注率，使血糖恢复到基础值士0. 5mmol/L的范围内。如此反复进行，当连续三次血糖值均稳定在上述范围内，即达到稳定状态。将钳夹的处于稳态的三个(HR值 (单位为mg · kg"1 · mirT1)求平均值。该指标用于判断是否存在顶及顶的程度。2. 2实验大鼠骨骼肌AMPK活性定量检测主要仪器=Herolab微型台式离心机、V-1800PC分光光度仪及比色皿主要试剂=GENMED公司组织AMPK激酶活性比色定量检测试剂盒2. 2. 1前期处理分别取出实验动物新鲜腓肠肌组织，并秤重500毫克组织重量放进预冷的15毫升锥形离心管
加入GENMED 清理液(Reagent Α)清洗抽去清理液移入到一个液氮冻存管即刻放进液氮罐过夜次日从液氮罐里取出，即刻用研磨棒碾碎组织成粉术状放进一个15毫升锥形离心管加入置于冰槽里的GENMED裂解液(Reagent B)强力涡旋震荡30秒，充分混勻放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒即刻放进4°C台式离心机离心10分钟，速度为IOOOOg小心移取上清液到新的无菌的1. 5毫升离心管，_80°C保存测定准备准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等)，置于冰槽里设定好分光光度仪(温度为30°C )波长为340nm，间隔1分钟，读数6次(共5分
钟)，并置零2. 2. 2背景对照测定移取GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿加入 GENMED 酶促液(Reagent D)加入GENMED 阴性液(Reagent G)放进30°C培养箱里静置2分钟分光光度仪，置零取出比色皿2. 2. 3样品测定移取GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿加入 GENMED 酶促液(Reagent D)加入5微升待测样品，放进30°C培养箱里静置2分钟加入 GENMED 反应液(Reagent Ε)
加入 GENMED 底物液(Reagent F)上下倾倒数次，混勻(限定在3秒之内)即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数340波长读数0分钟-340波长读数5分钟依照公式，计算AMPK酶活性定量指数2. 3免疫组织化学法检测实验大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表达仪器各种常规试剂及设备由中日友好医院临床研究所中心实验室提供。超低温冰箱ULTRA L0W-70 °C，日本SANYO公司；樱花平推式切片机，日本SAKURA PTERAT0MECRM-440 ；展片器，日本 SAKURA Slide warner PS-53 ；旋转式自动脱水机， 日本 SAKURATissue-Tek Tissue processor ；组织包埋机，日本 SAKURA Tissue-Tek TECTM5SMC1-042-S0试剂GLUT4兔抗鼠一抗抗体，Santa Cruz Biotechnology公司产品；二抗为EnVisionTM系统；DAB显色液(所有常规试剂均为，丹麦DAKO公司产品)。2. 3. 1固定、脱水、透明、浸蜡、包埋新鲜组织固定后，梯度酒精脱水(75%酒精1小时一80%酒精1小时一90%酒精 1小时一95%酒精1小时一100%酒精1小时一100%酒精1小时一二甲苯45分钟一二甲苯45分钟)，最后浸蜡包埋成蜡块。2. 3. 2切片处理载玻片处理新购载玻片经洗浸泡M-48小时，流水冲洗2-3小时，蒸馏水浸泡1 小时，60°C烤箱烤干，浸泡于新配制的铬酸明胶液，浸湿后捞出，自然干燥备用。在石蜡切片机上将蜡块切成4微米厚的切片，将组织片移入40°C的恒温热水容器中，待组织片完全展开后，附于载玻片上，平放在展片器上，裱好的切片56°C恒温箱过夜，取出备用。2. 3. 3免疫组化染色步骤脱蜡，水化组织切片。蒸馏水漂洗，滴加0. 3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，孵育15分钟。蒸馏水漂洗，置于TBS中5分钟共3次。一抗孵育2小时蒸馏水漂洗，置于TBS中5分钟共3次滴加EnvisionTM 孵育 60 分钟。TBS漂洗5分钟共3次。色源DAB溶液显色3分钟，蒸馏水终止显色。梯度酒精脱水，封片胶封片。显微镜下观察结果。实验时同时设阴性对照，采用TBS代替一抗作为空白阴性对照。肝细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。2. 3. 4图像分析骨骼肌的GLUT4的染色及定量采用中国中医研究院分子免疫室的医学图像分析系统分析，每张切片选5个视野，每组至少选8张切片，测定每个视野中染色阳性区域的总面积代表该物质细胞的数量，测量平均光密度(MOD)值代表单位面积细胞该物质的表达量，最后以每组的均值比较。2. 4实时荧光定量PCR法检测大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表达主要仪器GeneAmp 5700TaqMAN PCR 仪美国 Applied Biosystems 公司凝胶图像分析仪ImageMaster VDS 美国 pharmacia Biotech 公司高速冷冻离心机德国BACKMAN 公司 Allagra. 21R Centrifcige紫外线分光光度计德国BACKMAN公司而640型电泳仪北京六一仪器厂OYY-II1-5型主要试剂Trizol (Invitrogen)
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RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)引物采用primer premier5. 0设计，由赛百盛公司合成。2. 4. 1从组织中提取总RNA 取约IOOmg组织加Iml Trizol后，研磨至组织完全破碎、液体粘稠，室温放置5 分钟，使其充分裂解。 按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，摇勻15秒，室温放置15分钟。· 4"C 12000g 离心 15 分钟。 吸取上层水相，至另一个预冷的离心管中。 按0. 5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇(预冷)混勻，室温放置5-lOmin。· 4°C 12000g离心lOmin，弃上清，RNA沉于管底。 按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇(预冷)，温和震荡离心管，悬浮沉淀。· 4"C 7500g离心5min，尽量弃上清。 室温晾干 5-10min。 用 50μ1 RNase-free H2O,溶解 RNA 样品，55_60°C IOmin0 测0. D值定量RNA浓度。2. 4. 2分光光度法测定核酸的浓度带氩灯的分光光度计，使用前预热稳定15分钟。 吸取6 μ 1 RNA样品，加水至1. 5ml混勻后，转入分光光度计的石英比色杯中。 分光光度计先用Iml水校正零点。 在260nm和280nm分别读出光密度，RNA样品的浓度为0拟60*核酸稀释倍数 *40/1000 ；浓度单位为μ g/μ 1。2. 4. 3RNA样品反转录 取出RNA模板、试剂，于室温融化后，立即放在冰浴中，混旋器上混勻，短暂离心。眷模板变性Template RANχ ul (5. Oug)Oligo (dT)18primer 0. 5ug/ul 1. OulDEPC处理过的水至12. Oul混勻，短暂离心，70°C温浴10分钟，立即放在冰浴中至少1分钟。 配制反应混合液(每管按下述量配制)5 Xreaction buffer4. OulIOmMdNTPMix2. OulRNase Inhibitor (20U/ul)1. Oul混合液配制量为样品数N+2。 每管加7. OuL的上述混合液混勻。37°C温浴5分钟。 每管加入 1. OuL M-MuLV Reverse Transciptase (200u/uL)，42°C温浴 60 分钟， 70°C温浴10分钟。_20°C保存备用。
2. 4. 4荧光定量PCR检测 引物及试剂SYBR Green PCR Master Mix :ABI(Applied Biosystems)，Catalog No. 43049155 引物序列β -actin-FP :5，-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3，β -actin-RP :5，-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CC-3，扩增片段为 ^3bp。GLOT4 扩增片段为 39!3bp上游:5~-CACTGG TCC TTG CTG TAT TC_3~，下游:5~-CTGATG TTA GCC CTG AGT AG_3~， 引物稀释将引物按终浓度lOpmol/ul进行稀释，具体方法为V (ul)= 0. D.值X33ug/10M(V =所需DEPC处理水体积，M =引物分子量) 反应混合液的配制取出2 X Buffer，RNase-free water, cDNA放在室温中，融化，立即放在冰浴中，混旋器上混勻，短暂离心。每人份混合液(反应体系V = 25ul)所含试剂见下表Component Volnme2XSYBR Green PCR Master Mix, 12. 5ulχχχ-F primer(lOpmol/ul)Iulxxx-R primer(lOpmol/ul)IulNuclease-free H2O8. 5ulTotal Volume23ul配好混合液后，每个反应管中加入23ul混合液。 加样每个反应管加入2. Oul cDNA模板，混旋器上混勻，短暂离心(小于kec)。 在GeneAmp 5700荧光定量PCR仪进行，反应条件如下95. O0C =IOmin72. O0C :50sec72. 0°C :5min以上反应设定均在与PCR仪相连的计算机上进行，每个循环电脑自动记录反应管中的荧光信号值，并描绘曲线。反应结束由PE 5700软件分析结果，自动计算定量数值。实验结果以内参基因与目的基因的Ct值比值作为目的基因的mRNA相对表达量，(因为Ct值与实际表达量成反比关系，为了直观，我们在分析数据时将目的基因与 Beta-actin的Ct值比值取倒数，也就是Beta_actin与目标基因的Ct值比值作为其mRNA 的相对表达量)2. 5统计学处理由SPSS13.0统计软件包完成，计量资料用均数士标准差(JT± S )表示，同批次
11多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，两两比较采用最小显著差法(LSD)，以P <0.01为差异有显著意义。3.实验结果3. 1正葡萄糖钳夹试验结果如表1所示，模型组大鼠稳态葡萄糖输注率较LETO组显著下降，(P < 0. 01)，表明模型大鼠具有明显的胰岛素抵抗，中药组和西药组干预治疗后葡萄糖输注率均显著提高(P < 0. 01)，显示二者均具有良好的改善胰岛素抵抗的作用。表142W实验各组高胰岛素正葡萄糖钳夹试验结果
组别例数稳态葡萄糖胰岛素输注率葡萄糖输注率(GIR)(N)Cmmo 1/1)(mU · kg"1 · min"1)(mg · kg"1 · min"1)LETO85.0 士 0.18.023.5 士 3.89模型组85.0 士 0.28.08.85士2.76##幵郁清热组95.0±0.28.016.07±2.4罗格列酮组104.9 士 0.38.0am 17.67±4.24注与正常组比较##P < 0. 01, #P < 0. 05 ；与模型组比较< 0. 01，*P < 0. 053. 2实验大鼠骨骼肌AMPK活性定量检测经GENMED试剂盒测定，与LETO大鼠相比较，模型组AMPK酶活性明显降低，开郁清热组与罗格列酮较模型组显著上升。表2各组大鼠骨骼肌AMPK活性定量比较
组别LETO模型组幵郁清热组罗格列酮组数值3.5±0.231.5±0.45##2.1±0.31**1.9±0.19**注与正常组比较##P < 0. 01, #P < 0. 05 ；与模型组比较< 0. 01，*P < 0. 053. 3实验大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表达免疫组化显示，GLUT4的免疫反应阳性产物为棕黄色颗粒，表达于骨骼肌细胞内胞浆及细胞膜。LETO大鼠的GLUT4的免疫反应阳性产物表达区域较广泛，细胞膜表达较强。 模型组大鼠的GLUT4的表达范围与强度均明显减弱，在骨骼肌细胞膜表达较少，罗格列酮组与开郁清热组表达较模型组增加，细胞膜表达增加。表3各组大鼠骨骼肌GLUT4阳性表达区域面积及MOD值比较
权利要求
1.一种药物组合物在制备通过调节AMPK-GLUT4途径而改善糖代谢紊乱的药物中的应用，其中所述药物组合物由下列重量份的中药原料药为组方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3_15份、黄连1_12份、白芍 3-15份、乌梅5-20份。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方中还可以加入中药山楂， 得到的配方为天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1_6份，半夏1_12份、 黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5_20份、山楂3_15份。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方中还可以加入中药山楂， 黄精，人参和苦瓜，得到的配方为天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄， 1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3_15份、乌梅5_20份、山楂3_15份、 黄精3-15份、人参3-15份、苦瓜3-15份。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为天花粉9份、柴胡12 份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅9份。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为天花粉30份、柴胡12 份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为天花粉30份、柴胡12 份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份、 黄精9份、人参9份、苦瓜9份。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节 AMPK活性，从而增强GLOT4表达。
8.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节 AMPK活性，从而增强GLUT4细胞膜表达。
9.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节 AMPK-GLUT4活性，进而改善胰岛素抵抗、糖代谢紊乱。
10.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节 AMPK-GLUT4活性，治疗和预防2型糖尿病。
全文摘要
本发明属于药学领域，涉及一种药物组合物在制备提高骨骼肌AMPK活性的药物中的应用，其中所述药物组合物由下列重量份的中药原料药为组方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。
文档编号A61P3/10GK102233075SQ20101015632
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者仝小林, 周水平, 常柏, 甄重 申请人:天津天士力制药股份有限公司
技术领域：
本发明属于药学领域，涉及一种药物组合物在制备通过调节AMPK-GLUT4途径而改善糖代谢紊乱药物中的应用。
背景技术：
2型糖尿病(T2DM)是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。国际糖尿病联合会(IDF) 2006发表的统计数据显示，在过去20年，全球糖尿病患者人数从3000万剧增到 2. 3亿。世界卫生组织专家预计，到2025年全球糖尿病患者将达到3. 5亿。印度、中国、美国依次为全球糖尿病患者数量最多的三个国家，估计中国糖尿病患者总人数近4000万，仅次于印度，居世界第二位，占世界的四.63%。T2DM的防治在可预见的相当长时期内都将是人类面临的严峻挑战。2型糖尿病也叫成人发病型糖尿病，多在35 40岁之后发病，占糖尿病患者90% 以上。2型糖尿病病友体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素可能处于一种相对缺乏的状态。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌。但到后期仍有部分病人需要像1型糖尿病那样进行胰岛素治疗。2型糖尿病大致具有以下3个特点第一个特点，2型糖尿病好发于成年人，尤其以中老年人为多。多次糖尿病流行病学研究结果都表明，2型糖尿病发病的年龄多在40-60岁，从40岁起，患病率逐渐增加，到老年期达到高峰。青年发病的成年型糖尿病相对来说，还是十分少见的。第二个特点是病情一般比较缓和、隐蔽，也就是说与1 型糖尿病相比，不那么来势汹汹。2型糖尿病病人症状不明显，不见得每个患者都有喝得多、 尿得多、吃得多的表现，多数人也没有显著的消瘦，当然体力和体重不同程度地下降还是比较常见的。第三个特点就是患者往往不需要靠胰岛素治疗来维持生命。也就是说，患者不打胰岛素也不至于很快就发生酮症酸中毒而危及生命。所以，2型糖尿病原来又叫非胰岛素依赖型糖尿病。2型糖尿病病人有时也需要使用胰岛素治疗，但多数是因为血糖控制不理想， 或者是因为发生了急性并发症或者糖尿病的慢性并发症较重，而不像1型糖尿病病人那样是为了维持生命。2型糖尿病是比1型糖尿病更为复杂的疾病，特别是在早期体内胰岛素仍然能自我产生时却更容易治疗。由于早期症状轻微(如无酮症酸中毒和昏迷等)且多散发，因此 2型糖尿病多在病情进展多年后方被诊断。然而，2型糖尿病的控制不当会导致诸如肾衰、 失明、伤口愈合慢、动脉病(包括冠状动脉疾病)等严重的并发症。2型糖尿病患者其主要特征为胰岛素抵抗，相对胰岛素缺乏和高血糖；肝脏葡萄糖产量的增加(如来源于肝糖原的降解)，特别是在不当时机的增加(典型的原因是胰岛素水平紊乱，而胰岛素的作用之一正是调控肝脏此功能)；肌肉和脂肪组织(主要)中胰岛素介导的葡萄糖转运的减少(受体和受体后途径缺陷)；胰岛β细胞功能受损——缺失了高血糖水平刺激时早期胰岛素释放的功能。
GLUT4是葡萄糖转运蛋白家族GLUTs成员之一，以往认为GLUT4主要存在于骨胳肌、心肌及脂肪组织中。研究表明，GLUT4还存在于人和鼠胰岛组织细胞等处，并有可能发挥着独特的作用。研究资料表明，全身70-80%的葡萄糖摄取由骨骼肌细胞的葡萄糖转运因子4(GLUT-4)完成，它是葡萄糖摄取及处置的限速因子。2型糖尿病GLUT4水平普遍下降， 使得胰岛素刺激的葡萄糖转运功能下降，诱导胰岛素抵抗。GLUT4的主要功能是在肌肉和脂肪组织中转运葡萄糖。在没有刺激时，90%以上的GLUT4分布于细胞内，如微粒体、高尔基复合体、管形囊等囊泡样结构中，这些囊泡样结构称作GLUT4储存囊泡。在胰岛素刺激或运动刺激下，脂肪细胞和骨骼肌细胞中的GLUT4 会从细胞内转位至细胞膜上并与细胞膜融合，而葡萄糖便顺着GLUT4的亲水性中央通道进入细胞，完成葡萄糖的摄取与转运。当细胞内总蛋白下降或GLUT-4从内膜向外膜转运障碍时，直接引起葡萄糖利用度降低，导致胰岛素敏感性降低，发生胰岛素抵抗，导致糖脂代谢紊乱。AMPK作为一种重要的蛋白激酶参与多种代谢过程，同时介导了细胞对营养和环境变化的适应，被称为“能量感受器”。Koistrnen等对T2DM患者和正常对照组进行的体外试验显示，AICAR通过增加细胞表面GLUT4含量，增加了葡萄糖转运，特别是在顶时的骨骼肌细胞中，这一过程依赖AMH(途径。MacLcan等对几种转基因鼠的研究发现，运动可增加 GLUT4基因的表达，与AMH(诱导GLUT4基因表达所用的时问和所作用的启动子基本一致，进一步证实运动是通过AMPK来增加GLOT4表达。目前，大部分糖尿病人存在胰岛素抵抗，糖代谢紊乱等问题。长年来没有得到很好的解决，发明人通过对糖敏灵深入的研究，意外的发现糖敏灵可以通过调节AMPK-GLUT4可以有效地改善胰岛素抵抗，改善糖代谢紊乱，为糖敏灵新的治疗用途提供了依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种药物组合物在制备通过调节AMPK-GLUT4途径而改善糖代谢紊乱的药物中的应用。本发明所述的药物组合物(又称为糖敏灵制剂，开郁清热制剂)，由下列重量份的中药原料药为组方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1_6份， 半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。上述组方中还可以加入中药山楂，得到的配方为天花粉10-30份、柴胡10-30份、 枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1_12份、白芍3-15份、乌梅 5-20份、山楂3-15份。上述组方中还可以加入中药山楂，黄精，人参和苦瓜，得到的配方为天花粉 10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄，1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1_12 份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份、黄精3_15份、人参3_15份、苦瓜3_15份。优选的本发明的配方为天花粉9份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、 黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅9份。或天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、 白芍9份、乌梅15份、山楂9份。
或天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、 白芍9份、乌梅15份、山楂9份、黄精9份、人参9份、苦瓜9份。以上组成中，重量是以生药计算的，份为重量份，若以克为单位，以上组成可制成药物制剂5-50个制剂单位，所述制剂单位指，制成的成品药物制剂，如制成固体制剂5-50 单位，口服液5-50ml等。以上组成可制成1-6次服用剂量的制剂，如作为片剂，制成18片，每次服用剂量可以是3-18片，共可服用1-6次。如作为颗粒剂，制成6袋，每次服用1-2袋，共可服用3-6次。以上组成是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤为单位，或以吨为单位，小规模生产也可以以毫克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间的生药材重量配比的比例不变。以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，如重症或轻症，肥胖或瘦小的病人，可以相应调整组成的量的配比，增加或减少不超过300%，药效不变。以上组成中的单味中药，尤其是臣药和佐药，也可以被适当的具有相同药性的中药替换，替换后的中药制剂其药物作用不变。本发明的中药组合物，是通过将上述配方组成的中药原料经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成的。所述活性物质可以通过分别提取中药原料得到，也可以通过共同提取中药原料得到，也可以通过其他方式得到，如通过粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、层析等方法得到、这些活性物质可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根据制剂的不同需要决定制成不同的浓度。本发明的中药组合物中的药物活性物质，其在制剂中所占重量百分比可以是 0. 1-99.9%，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每衣寸。本发明的中药组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、 薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、
丹剂、膏剂等。本发明的中药组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，
5或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉齐U、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。本发明的中药组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA 二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、 麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β -环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次 1-20剂，如1-20袋或粒或片。本发明的组合物是经过以下方法制备，具体步骤如下本发明所述糖敏灵制剂的制备方法为(1)按比例取上述原料，( 加入4倍量 70-90%的乙醇，50-80°C减压回收乙醇，70-90°C真空干燥，粉碎过80目筛，得药物提取物； 加入辅料制成任意种药剂学上可以接受的剂型。本发明的药物组合物及其制备方法可参考中国专利CN1M6929。通过以下实验进一步说明本发明的药物组合物的治疗效果。1.材料与方法1. 1实验动物以自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病对照鼠LETO鼠为实验对象。大鼠皆为雄性，OLETF 40只，LETO大鼠10只，四周龄，由日本大冢制药株式会社德岛研究所引进。大鼠在无特定病原体级(SPF级，specific pathogen-free)条件下单笼饲养，饲以标准饲料。环境温度控制在22-25°C，湿度为55士5%，12/12小时光照黑暗循环(光照时间7:00-19:00)，自由获取食物和饮水。饲养地点中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心SPF级动物饲养房。1. 2分组及给药1. 2. 10LETF糖尿病诊断分组标准大鼠定期行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。试验前隔夜禁食15小时、不禁水，按2g/ kg予30 %葡萄糖溶液灌胃(取葡萄糖粉82. 5g，加蒸馏水定容至250ml，加热溶解为清壳液体，得到浓度为30%葡萄糖溶液)。于空腹及糖负荷后30、60、90和120min取血，以德国内卡BI0SEN5030快速葡萄糖分析仪测定血糖值。血糖峰值> 16. 7mmol/L和负荷后120min血糖> 11. lmmol/L诊为糖尿病，具备上述一条者为糖耐量减低。1.2.2实验动物分组及给药至30周时，共有成模OLETF鼠27只，随机分为模型组、罗格列酮组、糖敏灵组， LETO为空白对照组。罗格列酮组罗格列酮(文迪雅)史克必成天津有限公司产品每片含马来酸罗格列酮細g，购自由美国葛兰素史克(中国)投资有限公司，临用前搅拌至完全溶解，以蒸馏水稀释，给药剂量为ang/kg/cf1。糖敏灵组(即开郁清热组)，根据本发明实施例1配方提取制成浸膏，4°C冰箱保存，以蒸馏水稀释，灌胃剂量为tog/kg/cf1 (按所含原药材量计算)。模型组与空白组以等量蒸馏水灌胃，各组均灌胃给药12周，每日1次。2指标与检测2. 1高胰岛素正葡萄糖钳夹试验大鼠隔夜禁食，不禁水，称重后以2%的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，仰卧位固定，麻醉显效后，切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌肉，分离暴露右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉，进行右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉插管，穿线结扎，固定(美国产硬膜外麻醉用硅胶导管，内径0. 6mm，外径Imm)，并用含肝素50U/ml的生理盐水充满导管， 保持其通畅。动脉插管以取血测血糖，静脉插管连接小三通管，出口端与静脉相连，两进口端分别与微电脑数字式微量注射泵连接以输注胰岛素及葡萄糖。插管完毕后，将大鼠静置 30分钟后测定血糖。并同时对其进行保温。胰岛素、20%葡萄糖分别用2个微电脑数字式微量注射泵由颈静脉泵入，血液标本由颈动脉导管获取。将静置30分钟的插管大鼠颈动脉导管所接的注射器取下，取血一滴，用微型血糖仪在30s内测定基础血糖值。开始时先恒定输注短效猪胰岛素(输注速率为8mU/kg · mirT1，临用时胰岛素用 0. 5%牛血清白蛋白稀释)。每10分钟测定血糖一次，当血糖值超出基础值士0. 5mmol/L的范围时，即开始输注浓度为20%葡萄糖，调整葡萄糖输注速度(即葡萄糖输注率，GIR)，使血糖值控制在基础值士0. 5mmol/L的范围左右，如果血糖值超出基础值士0. 5mmol/L的范围，即可继续输注葡萄糖。输注葡萄糖后仍每10分钟测一次血糖，并根据血糖值在最短的时间内调整葡萄糖输注率，使血糖恢复到基础值士0. 5mmol/L的范围内。如此反复进行，当连续三次血糖值均稳定在上述范围内，即达到稳定状态。将钳夹的处于稳态的三个(HR值 (单位为mg · kg"1 · mirT1)求平均值。该指标用于判断是否存在顶及顶的程度。2. 2实验大鼠骨骼肌AMPK活性定量检测主要仪器=Herolab微型台式离心机、V-1800PC分光光度仪及比色皿主要试剂=GENMED公司组织AMPK激酶活性比色定量检测试剂盒2. 2. 1前期处理分别取出实验动物新鲜腓肠肌组织，并秤重500毫克组织重量放进预冷的15毫升锥形离心管
加入GENMED 清理液(Reagent Α)清洗抽去清理液移入到一个液氮冻存管即刻放进液氮罐过夜次日从液氮罐里取出，即刻用研磨棒碾碎组织成粉术状放进一个15毫升锥形离心管加入置于冰槽里的GENMED裂解液(Reagent B)强力涡旋震荡30秒，充分混勻放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒即刻放进4°C台式离心机离心10分钟，速度为IOOOOg小心移取上清液到新的无菌的1. 5毫升离心管，_80°C保存测定准备准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等)，置于冰槽里设定好分光光度仪(温度为30°C )波长为340nm，间隔1分钟，读数6次(共5分
钟)，并置零2. 2. 2背景对照测定移取GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿加入 GENMED 酶促液(Reagent D)加入GENMED 阴性液(Reagent G)放进30°C培养箱里静置2分钟分光光度仪，置零取出比色皿2. 2. 3样品测定移取GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿加入 GENMED 酶促液(Reagent D)加入5微升待测样品，放进30°C培养箱里静置2分钟加入 GENMED 反应液(Reagent Ε)
加入 GENMED 底物液(Reagent F)上下倾倒数次，混勻(限定在3秒之内)即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数340波长读数0分钟-340波长读数5分钟依照公式，计算AMPK酶活性定量指数2. 3免疫组织化学法检测实验大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表达仪器各种常规试剂及设备由中日友好医院临床研究所中心实验室提供。超低温冰箱ULTRA L0W-70 °C，日本SANYO公司；樱花平推式切片机，日本SAKURA PTERAT0MECRM-440 ；展片器，日本 SAKURA Slide warner PS-53 ；旋转式自动脱水机， 日本 SAKURATissue-Tek Tissue processor ；组织包埋机，日本 SAKURA Tissue-Tek TECTM5SMC1-042-S0试剂GLUT4兔抗鼠一抗抗体，Santa Cruz Biotechnology公司产品；二抗为EnVisionTM系统；DAB显色液(所有常规试剂均为，丹麦DAKO公司产品)。2. 3. 1固定、脱水、透明、浸蜡、包埋新鲜组织固定后，梯度酒精脱水(75%酒精1小时一80%酒精1小时一90%酒精 1小时一95%酒精1小时一100%酒精1小时一100%酒精1小时一二甲苯45分钟一二甲苯45分钟)，最后浸蜡包埋成蜡块。2. 3. 2切片处理载玻片处理新购载玻片经洗浸泡M-48小时，流水冲洗2-3小时，蒸馏水浸泡1 小时，60°C烤箱烤干，浸泡于新配制的铬酸明胶液，浸湿后捞出，自然干燥备用。在石蜡切片机上将蜡块切成4微米厚的切片，将组织片移入40°C的恒温热水容器中，待组织片完全展开后，附于载玻片上，平放在展片器上，裱好的切片56°C恒温箱过夜，取出备用。2. 3. 3免疫组化染色步骤脱蜡，水化组织切片。蒸馏水漂洗，滴加0. 3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，孵育15分钟。蒸馏水漂洗，置于TBS中5分钟共3次。一抗孵育2小时蒸馏水漂洗，置于TBS中5分钟共3次滴加EnvisionTM 孵育 60 分钟。TBS漂洗5分钟共3次。色源DAB溶液显色3分钟，蒸馏水终止显色。梯度酒精脱水，封片胶封片。显微镜下观察结果。实验时同时设阴性对照，采用TBS代替一抗作为空白阴性对照。肝细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。2. 3. 4图像分析骨骼肌的GLUT4的染色及定量采用中国中医研究院分子免疫室的医学图像分析系统分析，每张切片选5个视野，每组至少选8张切片，测定每个视野中染色阳性区域的总面积代表该物质细胞的数量，测量平均光密度(MOD)值代表单位面积细胞该物质的表达量，最后以每组的均值比较。2. 4实时荧光定量PCR法检测大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表达主要仪器GeneAmp 5700TaqMAN PCR 仪美国 Applied Biosystems 公司凝胶图像分析仪ImageMaster VDS 美国 pharmacia Biotech 公司高速冷冻离心机德国BACKMAN 公司 Allagra. 21R Centrifcige紫外线分光光度计德国BACKMAN公司而640型电泳仪北京六一仪器厂OYY-II1-5型主要试剂Trizol (Invitrogen)
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RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)引物采用primer premier5. 0设计，由赛百盛公司合成。2. 4. 1从组织中提取总RNA 取约IOOmg组织加Iml Trizol后，研磨至组织完全破碎、液体粘稠，室温放置5 分钟，使其充分裂解。 按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，摇勻15秒，室温放置15分钟。· 4"C 12000g 离心 15 分钟。 吸取上层水相，至另一个预冷的离心管中。 按0. 5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇(预冷)混勻，室温放置5-lOmin。· 4°C 12000g离心lOmin，弃上清，RNA沉于管底。 按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇(预冷)，温和震荡离心管，悬浮沉淀。· 4"C 7500g离心5min，尽量弃上清。 室温晾干 5-10min。 用 50μ1 RNase-free H2O,溶解 RNA 样品，55_60°C IOmin0 测0. D值定量RNA浓度。2. 4. 2分光光度法测定核酸的浓度带氩灯的分光光度计，使用前预热稳定15分钟。 吸取6 μ 1 RNA样品，加水至1. 5ml混勻后，转入分光光度计的石英比色杯中。 分光光度计先用Iml水校正零点。 在260nm和280nm分别读出光密度，RNA样品的浓度为0拟60*核酸稀释倍数 *40/1000 ；浓度单位为μ g/μ 1。2. 4. 3RNA样品反转录 取出RNA模板、试剂，于室温融化后，立即放在冰浴中，混旋器上混勻，短暂离心。眷模板变性Template RANχ ul (5. Oug)Oligo (dT)18primer 0. 5ug/ul 1. OulDEPC处理过的水至12. Oul混勻，短暂离心，70°C温浴10分钟，立即放在冰浴中至少1分钟。 配制反应混合液(每管按下述量配制)5 Xreaction buffer4. OulIOmMdNTPMix2. OulRNase Inhibitor (20U/ul)1. Oul混合液配制量为样品数N+2。 每管加7. OuL的上述混合液混勻。37°C温浴5分钟。 每管加入 1. OuL M-MuLV Reverse Transciptase (200u/uL)，42°C温浴 60 分钟， 70°C温浴10分钟。_20°C保存备用。
2. 4. 4荧光定量PCR检测 引物及试剂SYBR Green PCR Master Mix :ABI(Applied Biosystems)，Catalog No. 43049155 引物序列β -actin-FP :5，-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3，β -actin-RP :5，-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CC-3，扩增片段为 ^3bp。GLOT4 扩增片段为 39!3bp上游:5~-CACTGG TCC TTG CTG TAT TC_3~，下游:5~-CTGATG TTA GCC CTG AGT AG_3~， 引物稀释将引物按终浓度lOpmol/ul进行稀释，具体方法为V (ul)= 0. D.值X33ug/10M(V =所需DEPC处理水体积，M =引物分子量) 反应混合液的配制取出2 X Buffer，RNase-free water, cDNA放在室温中，融化，立即放在冰浴中，混旋器上混勻，短暂离心。每人份混合液(反应体系V = 25ul)所含试剂见下表Component Volnme2XSYBR Green PCR Master Mix, 12. 5ulχχχ-F primer(lOpmol/ul)Iulxxx-R primer(lOpmol/ul)IulNuclease-free H2O8. 5ulTotal Volume23ul配好混合液后，每个反应管中加入23ul混合液。 加样每个反应管加入2. Oul cDNA模板，混旋器上混勻，短暂离心(小于kec)。 在GeneAmp 5700荧光定量PCR仪进行，反应条件如下95. O0C =IOmin72. O0C :50sec72. 0°C :5min以上反应设定均在与PCR仪相连的计算机上进行，每个循环电脑自动记录反应管中的荧光信号值，并描绘曲线。反应结束由PE 5700软件分析结果，自动计算定量数值。实验结果以内参基因与目的基因的Ct值比值作为目的基因的mRNA相对表达量，(因为Ct值与实际表达量成反比关系，为了直观，我们在分析数据时将目的基因与 Beta-actin的Ct值比值取倒数，也就是Beta_actin与目标基因的Ct值比值作为其mRNA 的相对表达量)2. 5统计学处理由SPSS13.0统计软件包完成，计量资料用均数士标准差(JT± S )表示，同批次
11多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，两两比较采用最小显著差法(LSD)，以P <0.01为差异有显著意义。3.实验结果3. 1正葡萄糖钳夹试验结果如表1所示，模型组大鼠稳态葡萄糖输注率较LETO组显著下降，(P < 0. 01)，表明模型大鼠具有明显的胰岛素抵抗，中药组和西药组干预治疗后葡萄糖输注率均显著提高(P < 0. 01)，显示二者均具有良好的改善胰岛素抵抗的作用。表142W实验各组高胰岛素正葡萄糖钳夹试验结果
组别例数稳态葡萄糖胰岛素输注率葡萄糖输注率(GIR)(N)Cmmo 1/1)(mU · kg"1 · min"1)(mg · kg"1 · min"1)LETO85.0 士 0.18.023.5 士 3.89模型组85.0 士 0.28.08.85士2.76##幵郁清热组95.0±0.28.016.07±2.4罗格列酮组104.9 士 0.38.0am 17.67±4.24注与正常组比较##P < 0. 01, #P < 0. 05 ；与模型组比较< 0. 01，*P < 0. 053. 2实验大鼠骨骼肌AMPK活性定量检测经GENMED试剂盒测定，与LETO大鼠相比较，模型组AMPK酶活性明显降低，开郁清热组与罗格列酮较模型组显著上升。表2各组大鼠骨骼肌AMPK活性定量比较
组别LETO模型组幵郁清热组罗格列酮组数值3.5±0.231.5±0.45##2.1±0.31**1.9±0.19**注与正常组比较##P < 0. 01, #P < 0. 05 ；与模型组比较< 0. 01，*P < 0. 053. 3实验大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表达免疫组化显示，GLUT4的免疫反应阳性产物为棕黄色颗粒，表达于骨骼肌细胞内胞浆及细胞膜。LETO大鼠的GLUT4的免疫反应阳性产物表达区域较广泛，细胞膜表达较强。 模型组大鼠的GLUT4的表达范围与强度均明显减弱，在骨骼肌细胞膜表达较少，罗格列酮组与开郁清热组表达较模型组增加，细胞膜表达增加。表3各组大鼠骨骼肌GLUT4阳性表达区域面积及MOD值比较
权利要求
1.一种药物组合物在制备通过调节AMPK-GLUT4途径而改善糖代谢紊乱的药物中的应用，其中所述药物组合物由下列重量份的中药原料药为组方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3_15份、黄连1_12份、白芍 3-15份、乌梅5-20份。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方中还可以加入中药山楂， 得到的配方为天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1_6份，半夏1_12份、 黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5_20份、山楂3_15份。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方中还可以加入中药山楂， 黄精，人参和苦瓜，得到的配方为天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄， 1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3_15份、乌梅5_20份、山楂3_15份、 黄精3-15份、人参3-15份、苦瓜3-15份。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为天花粉9份、柴胡12 份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅9份。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为天花粉30份、柴胡12 份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为天花粉30份、柴胡12 份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份、 黄精9份、人参9份、苦瓜9份。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节 AMPK活性，从而增强GLOT4表达。
8.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节 AMPK活性，从而增强GLUT4细胞膜表达。
9.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节 AMPK-GLUT4活性，进而改善胰岛素抵抗、糖代谢紊乱。
10.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节 AMPK-GLUT4活性，治疗和预防2型糖尿病。
全文摘要
本发明属于药学领域，涉及一种药物组合物在制备提高骨骼肌AMPK活性的药物中的应用，其中所述药物组合物由下列重量份的中药原料药为组方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。
文档编号A61P3/10GK102233075SQ20101015632
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者仝小林, 周水平, 常柏, 甄重 申请人:天津天士力制药股份有限公司
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