重组人干扰素α1b的纯化工艺的制作方法
专利名称：重组人干扰素α1b的纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及含肽的医药配制品，特别是涉及蛋白质的分离纯化方法，尤其涉及重组人干扰素α1b的分离纯化工艺。
背景技术：
干扰素具有广泛的抗病毒活性，1957年Isaacs和Lindenmann在研究流感病毒的干扰现象时发现了这种物质用灭活的流感病毒作用于细胞后，细胞会产生一种可溶性物质，使得活病毒细胞的繁殖受到干扰，故称之为干扰素(Interferon，简写IFN)。干扰素具有三大功能抑制病毒繁殖活性、抑制细胞分裂活性和抑制免疫调节活性。
干扰素是一类调节细胞功能的蛋白质。根据抗原特异性和分子结构的不同，分为α、β、γ、ω等型别。而在一特定的干扰素型别内，再根据氨基酸序列或组成方面的差异，划分出不同的亚型，比如HuIFN(人干扰素)α1、α2等。而在一特定的干扰素亚型内，又会根据个别或少数氨基酸的变易，以a、b、c在亚型后面进行标记，比如HuIFNα1a，1b，2b等。
HuIFNα已经可以通过基因重组和其他生物工程技术，进行量产。而HuIFNα1b相对其他的诸如HuIFNα2来说，一个重要的区别在于，根据中国科学家多年的研究发现中国人白细胞经病毒刺激后，诱生的所有干扰素中最主要的亚型是α1b。并且试验还证明，中国人使用干扰素后，产生中和抗体的几率以α1b最低，所以α1b更符合中国人的自然状态。目前在中国普遍采用的由本申请人，深圳科兴生物工程股份有限公司生产的商品名称为赛若金的HuIFNα1b是由中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室的候云德教授等于1982年首次利用新城疫病毒F株(NDV-F)刺激脐血白细胞，提取mRNA，反转录成cDNA，成功克隆了IFNα1b cDNA无性繁殖系，并在大肠杆菌中得到了高效表达。
从干扰素的应用现状来看，HuIFNα型别应用案例比较多，以HuIFNα1b为例，可用于治疗病毒性疾病、恶性肿瘤、血液病等，尤其在慢性乙型、丙型病毒性肝炎的治疗上，给药途径多采用肌肉注射，用药量一般在100万-600万IU(国际单位)，有效率达到60％。通过国内许多医院的临床实践发现，采用对HuIFNα1b超声波雾化直接给药，对病毒性上呼吸道感染、病毒性疱疹、病毒性咽喉炎以及慢性口腔溃疡治疗效果显著。
在人α1b干扰素的生产过程中，工程菌经过传代培养和高密度发酵后，一道非常重要的工艺过程是蛋白质的分离纯化将人α1b干扰素从复杂的细菌表达环境中提取出来，去除各种杂质，包括颗粒、细菌、内毒素、核酸和各种杂蛋白等非目标蛋白物，以达到政府药监当局对该种生物制品要求的各项指标，满足临床需要。
目前人α1b干扰素的分离纯化主要步骤包括细菌破碎、初步纯化和精制纯化。因为在上述的工程菌中，人α1b干扰素为胞内可溶表达，所以分离纯化的第一步是破碎细菌，让干扰素从胞内释放出来，才能进行进一步的纯化。具体来说，初步纯化包括如下步骤离心1→酸化→离心2→碱中和→盐析1→离心3→盐析2→离心4共9步工艺，包括4步离心和3步沉淀法1步盐酸沉淀和2步(NH4)2SO4盐析沉淀，以及Sephadex G-50脱盐。精制纯化则包括3步柱层析CM-Sepharose F.F离子交换层析、单克隆抗体亲和层析、Sephacryl S-100分子筛。可以看出，整个纯化工艺相当复杂，特别是初步纯化部分，步骤繁多。
由于步骤繁多，工艺复杂，以及强酸强碱处理就使得现有的生产工艺存在以下问题由于在蛋白质的纯化过程中，每一步骤都会存在损失，从而必然导致总得率的降低；长时间的处理，导致生产效率的低下，再加上初步纯化中大量敞口操作，还容易造成产品污染，影响产品质量；步骤过多以及大量手工操作导致物料成本和人工成本过高，工艺经济性差。
另一方面，除了上述的蛋白沉淀和传统柱层析等技术，扩张床吸附技术开始应用于蛋白纯化处理。以Pharmacia的EBA系统(Expanded Bed Adsorption扩张床吸附)为例，它采用了独特的STREAMLINE凝胶及层析柱该凝胶是在普通琼脂糖凝胶的基础上结合了石英成分，从而增大了密度并且形成了一定的密度梯度；同时，设计了柱塞可自由升降又能保证密封的层析柱。这些独特的设计使得STREAMLINE凝胶可在从下向上的平衡缓冲液的作用下形成稳定的扩张柱床，因此，可以将未经澄清的带杂质的物料直接上样，在上样过程中，杂质如细胞碎片从凝胶颗粒之间洗掉，而蛋白质等生物分子则吸附在凝胶上。经清洗后，再将凝胶沉降下来，从而洗脱目标蛋白，达到纯化的目的。
从扩张床吸附原理可看出其优势在于可直接将未经澄清带杂质的物料直接上样，例如胞内表达的基因工程产品在细胞破碎后可以不必通过离心或超滤去除细胞碎片就可以直接上样，从而免除了离心或超滤的步骤。因此，扩张床吸附一步就起到了澄清、浓缩和初步纯化的作用。
是否能够把扩张床吸附技术应用于干扰素的纯化工艺？如何才能够把扩张床吸附技术应用于干扰素的纯化工艺，以达到简化工艺过程，提高生产效率的目的？现有技术似乎并没有这方面的考虑，也没有给出相应的解决方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于避免上述现有技术的不足之处，而提出一种能够使生产效率提高，生产成本降低的干扰素纯化工艺。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是，提出一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，用于从具备人干扰素α1b表达的工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括细菌破碎，以及目标蛋白的捕获、中间纯化和精制过程，并且所述目标蛋白的捕获过程采用扩张床吸附，中间纯化过程采用亲合层析，精制过程采用凝胶过滤。
所述细菌破碎是在Tris-HCl缓冲液中进行；所述扩张床吸附步骤中，选用阴离子凝胶，具体选用STREAMLINE DEAE；缓冲体系选用pH值为7.0-8.0，优选值为7.4的Tris-HCl，并采用盐浓度洗脱的方法；所述盐浓度洗脱选用含0.2-0.5，优选值为0.4MNaCl的pH7.450mM Tris-Hcl洗脱液一步洗脱。
所述亲和层析步骤中，选用α1b干扰素的单克隆抗体偶联的凝胶；平衡液采用PBS，洗脱液采用0.05-0.2，优选值为0.1MGly-HCl，再生液采用0.05-0.2，优选值为0.1M Tris-HCl和0.05-0.2，优选值为0.1MNaAc-HAc。
所述凝胶过滤步骤中，缓冲体系选用PBS；并选用Sephacryl凝胶。
与以蛋白沉淀为主的旧工艺比较，本发明中用扩张床吸附改造后的纯化新工艺具有明显的优势。具体体现在工艺周期缩短40％，纯化得率提高70％，生产成本降低40-50％等多方面。
同现有技术相比较，本发明重组人干扰素α1b的纯化工艺，生产效率可以大大提高，生产成本则大大降低。
图1为本发明重组人干扰素α1b的纯化工艺所采用扩张床吸附层析原理图。
图2-1至2-8为扩张床吸附操作系统阀门及管道原理图。
图3为扩张床吸附层析曲线。
图4为STREAMLINE DEAE凝胶吸附量测定曲线。
图5为扩张床吸附层析理论塔板数测定曲线。
图6为亲和层析曲线。
图7为凝胶过滤曲线。
具体实施例方式
以下对本发明作进一步详尽说明。
为什么要选用扩张床吸附技术？对纯化工艺的改进首先在于纯化策略和思路的变化。重组蛋白纯化的传统思路是将纯化分为初步纯化和高度纯化两部分，这种思路的出发点是从生产管理的角度来安排纯化生产工作，其弊端在于，从工艺技术的角度，这种分割并不具有明确的含义，分界处在那里？哪个单元是初步纯化，哪个单元是高度纯化。初步和高度纯化的概念很难用来确定一条工艺路线，从菌体开始逐步纯化获得符合各种要求的目标蛋白。一种新的纯化策略是从技术的角度出发，将重组蛋白从菌体到纯品的纯化工艺分成三部分目标蛋白捕获→中间纯化→精制。它的思路是首先从复杂的初始物料中将目标蛋白捕获出来，不要求高的纯度，而要求高回收率和大副减少处理体积，以及去除杂质颗粒。第二步中间纯化是提高纯度的关键步骤，将无颗粒和大幅减少体积后的物料采用高效的纯化手段，去除大部分杂质，大幅度提高目标蛋白纯度。第三步精制是将可能存在的小量杂质如聚体和异构体，以及前期纯化中可能带入的新杂质去除，以达到要求的纯度。
基于捕获→中间纯化→精制的纯化策略，和现有纯化工艺存在的问题，我们发现重要的是将原来低效复杂的初步纯化工艺以高效简单的手段代替。我们选用了Pharmacia的EBA系统(Expanded Bed Adsorption扩张床吸附)来进行此项改进。
自从1993年问世以来，扩张床吸附已广泛应用于基因工程产品的研究开发和生产。无论是大肠杆菌、酵母菌还是哺乳动物细胞，都有大量应用的实例。1998年，日本绿十字公司更将大规模扩张床吸附用于迄今为止最大的基因工程产品-重组白蛋白的生产，可见其应用之广泛。
采用EBA系统后，我们可以将干扰素的纯化工艺简化为细菌破碎→EBA→亲和层析→分子筛在细菌破碎后，只需要三步柱层析即可完成干扰素的分离纯化工作，获得符合质量要求的干扰素纯品。整个纯化工艺从原来的13步简化为4步，其中，EBA1步代替了旧工艺中的10步离心1→酸化→离心2→碱中和→盐析1→离心3→盐析2→离心4→脱盐→离子交换。整个纯化工艺被大大简化，生产效率得以提高。
与我们的纯化策略相一致，三步柱层析分别对应纯化策略的三个阶段。其中，EBA代替了离心、酸化、盐析、脱盐和离子交换的步骤，起到了样品澄清、浓缩和初步纯化的作用，将目标干扰素有效捕获，去除了细胞碎片等颗粒和部分杂蛋白、核酸，并且大大减少了物料体积。亲和层析作为一种高效的纯化手段，去除了大部分杂蛋白、核酸、内毒素等杂质，并进一步浓缩干扰素样品。最后一步分子筛则起到精制作用，去除了干扰素残存的少量杂蛋白、干扰素二聚体和可能从亲和层析脱落的IgG，并且起到交换缓冲液的作用。
如何具体运用扩张床吸附技术？我们通过一系列实验进行摸索，以确定有关的技术参数和指标。
实施例1扩张床吸附凝胶选择和层析参数优化
EBA的操作需要特殊的层析柱以产生稳定的扩张床。在工艺开发初期，首先采用装填床的形式进行实验摸索。采用装填床进行凝胶选择和参数优化，是因为，虽然扩张床的吸附效果比较好，但两种方式凝胶吸附所需的条件是保持一致的，对于选择凝胶和层析参数没有影响，而且可以节省小规模扩张床系统的投资。采用装填床，由于不能去除颗粒杂质，需要将样品先进行离心分离，以获得澄清物料。
实验方案在XK16×10(mm×cm)层析柱内进行，柱床体积20ml。分别选择一种阳离子凝胶STREAMLINE SP和一种阴离子凝胶STREAMLINE DEAE在不同的缓冲系统和不同的pH及离子强度条件下进行优化，结果如下表
其中，STREAMLINE SP凝胶采用pH4.7的柠檬酸及醋酸缓冲液，pH6.0、pH6.4的磷酸缓冲液进行了多次实验。可见最好的结果是采用pH6.4的磷酸缓冲液做为上样及洗脱条件，二次实验得率分别为45.9％以及43.8％，平均44.8％。
STREAMLINE DEAE在pH6.4的磷酸缓冲液，pH7.4和7.8的Tris缓冲液条件下进行了多次实验。可见pH7.8的两次实验，得率分别为35％和45％。PH7.4的两次实验，得率分别为54％和50.2％，平均52.1％，回收率较高，且较稳定。
分析以上实验结果，可知pH6.4的STREAMLINE SP和pH7.4的STREAMLINE DEAE都可以获得较好的结果，并且两者相比，pH7.4的STREAMLINE DEAE得率相对高出16％。选择何种条件，还要考虑的一个问题是前后工艺配合问题。由于菌体破碎是在pH7.8的Tris缓冲液中进行，匀浆液最终pH在7.4左右，正与STREAMLINE DEAE条件相符，而且在pH中性环境下，干扰素应最稳定。因此，pH7.4的STREAMLINE DEAE是理想条件。从另一个角度看，如果选用pH6.4的STREAMLINE SP，则匀浆需要更换缓冲体系，在酸性条件下，会出现蛋白沉淀，也可能存在其它意料不到的问题。因此，决定选用DEAE-STEAMLINE凝胶，并使用pH7.4的Tris-HCl作为层析缓冲液。
实施例2使用STREAMLINE DEAE装填床小柱进行干扰素纯化工艺摸索在实验室规模，使用XK16×10柱以装填床的形式，选用STREAMLINE DEAE和pH7.4的Tris缓冲液，用与旧工艺相同批的菌体匀浆液沿新工艺路线生产至干扰素纯品。新旧工艺比较中，旧工艺的数据取自实际生产。
实验材料1.设备层析柱XK16×10，凝胶STREAMLINE DEAE，层析系统Pharmacia GP-250梯度控制仪2.缓冲液平衡液pH7.4 50mM Tris-HCl，洗脱液0-0.5MNaCl pH7.450mM Tris-HCl实验程序1.装柱采用20ml/min的流速在平衡缓冲液体系中装柱，装柱体积20ml2.平衡采用10ml/min的流速，10个柱床体积的平衡液平衡柱床3.上样菌体匀浆液1000ml在10ml/min流速下上样，收集流穿4.清洗采用平衡液在10ml/min的流速下清洗柱床，洗至紫外吸收接近基线5.洗脱采用0-0.5MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl进行梯度洗脱，收集主峰6.再生采用多种CIP清洗液再生凝胶7.保存采用20％乙醇保存凝胶实验结果见下表，新工艺比旧工艺平均提高得率108％。
其中，Yn/Yo新工艺得率/旧工艺得率 At总活性
实施例3扩张床吸附手动纯化系统的建立在由实验规模向生产规模放大的过程中，面临着建立扩张床吸附纯化系统的问题。基于降低投资的考虑，我们与层析柱供应商一起建立扩张床吸附的手动纯化系统。
根据图2扩张床吸附操作原理图，扩张床吸附的步骤包括平衡扩张、样品上样、柱清洗、沉降洗脱，柱再生。为同时实现扩张和层析两个功能，必须采用双泵系统。一个泵负责柱床的扩张和沉降，另一个泵负责平衡、上样、洗脱、再生。同时，由于存在多种液体的更换，因此，需要较为复杂的阀门和管路系统。另外，需要基本的检测和记录系统。
根据以上分析，首先是确定在不同层析状态下，各种流体的流程图。如图2-1到2-8，分别包括初始状态、平衡扩张、柱塞上升、上样、清洗、柱塞下降、洗脱、再生等不同状态的流程图。其中，1-9为手动阀。A指初始缓冲液，B指洗脱缓冲液。在所有流程图中，黑线及箭头表示的路径是液体在该状态下的流动路程。如图2-4，上样流程图中，样品经过阀3、阀2、泵1、阀4、阀5、阀6、阀8进入层析柱内，上样产生的流穿从柱顶流出，经过阀7、阀6进入紫外检测仪，检测紫外吸收信号，再作为废液排走。
根据以上流程，选用了相应设备STREAMLINE200层析柱，WASTON-MARLOW蠕动泵两台，紫外检测仪及数据记录仪，手动阀门以及管道。将所有组件，根据工艺流程安装起来，形成了扩张床吸附的手动纯化系统。
实施例4扩张床吸附纯化干扰素新工艺的生产规模放大将实验规模的XK16/10小柱中摸索的条件直接放大至STREAMLINE200扩张柱，柱床体积由20ml放大到4.5L，为225倍一步放大。
实验材料1.设备层析柱STREAMLINE200，凝胶STREAMLINE DEAE4.5L，层析系统扩张床吸附手动纯化系统2.缓冲液平衡液pH7.450mM Tris-HCl，洗脱液0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl，再生液0.5MNaOH-1MNaCl，WFI，30％异丙醇、25％醋酸、20％乙醇实验程序1.装柱在平衡缓冲液体系中装柱，直接将凝胶装入层析柱内，装柱体积4.5L2.平衡采用300CM/H的流速，10个柱床体积的平衡液平衡柱床3.上样菌体匀浆液100L在300CM/H流速下上样，收集流穿4.清洗采用平衡液在300CM/H的流速下清洗柱床，洗至紫外吸收接近基线5.洗脱采用0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl以100CM/H进行一步洗脱，收集洗脱峰
6.再生采用多种CIP清洗液再生凝胶7.保存采用20％乙醇保存凝胶实验结果扩张床吸附层析曲线如图3。检定数据如下表，新工艺比旧工艺平均提高得率82％。
其中，Yn/Yo新工艺得率/旧工艺得率 At总活性
实施例5STREAMLINE DEAE凝胶负载测试实验材料层析柱XK16/6.9，采用装填床的形式装填13.8ml STREAMLINE DEAE凝胶。
平衡液pH7.450mM Tris缓冲液上样采用干扰素菌体匀浆液离心去除颗粒，作为上样液实验程序1.用缓冲液平衡10个柱床2.以270CM/H的速度上样1000ML3.对流穿定点取样，流穿收集点为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000ML4.检测各流穿收集点的干扰素浓度C，除以上样中干扰素浓度Co，得到C/Co值，C/Co最大为1。
5.以C/Co值对响应的收集体积作图，如图4。
实验结果从图4可以看出，上样达到400ml时，干扰素流穿C/Co＝0.28，尚可接受。上样500ml时，C/Co＝0.44，已经完全不可接受。因此，以400ml点作为凝胶最大吸附量。计算STREAMLINEDEAE凝胶吸附量如下。
1.凝胶最大菌体负载＝400ml×50gcell/1000ml/13.8mlgel＝1.45gcell/ml gel2.凝胶最大菌体干扰素负载＝400ml×0.0252mg IFN/ml/13.8ml gel＝0.725mg IFN/ml gel根据以上凝胶负载，STEAMLINE200柱所装4.5L凝胶，其最大菌体上样量为6.5Kg菌体，按最大负载80％上样，上样量为5.2Kg干扰素菌体。
实施例6STREAMLLINE200柱床稳定性检测1.目检对玻璃制的扩张床柱，目检是检测柱床稳定性的重要步骤。在柱床平衡扩张后，进行目检。稳定的柱床中，悬浮的凝胶颗粒只在原地做小的旋转运动。如果出现紊流或沟流，会导致吸附效果不理想。柱床上部大的回旋运动，可能是柱子没有处于垂直的位置。柱床下部的沟流提示柱底的分布器中存在气泡或者分布系统部分堵塞。
2.柱床扩张倍数检测扩张倍数是扩张后柱床的高度H与沉降后柱床的高度Ho的比值，H/Ho。理想状态下，扩张倍数与流速，缓冲体系，温度有关，这三个指标确定的情况下，扩张倍数得以确定。异常情况下，扩张倍数的下降可能意味着分布板中存在气泡或堵塞，凝胶被污染，柱子不垂直等问题。
在STREAMLINE200柱中，使用STREAMLINE DEAE凝胶，50mM pH7.4的Tris缓冲液，20℃的工作温度，和300CM/H的平衡速度，扩张倍数＝H/Ho＝43.6/14.5＝3.0，为合理值。
3.理论塔板数检测保留时间分布实验可以用来确定理论塔板数，以评估扩张床中凝胶轴向分布的情况。将稀释的丙酮溶液上样到扩张好的柱内，同时检测流出物中丙酮的紫外吸收信号，根据层析图谱计算理论塔板数。具体程序如下(1).采用平衡缓冲液在300GM/H流速下充分扩张，记录扩张床高度。
(2).降低柱塞到离扩张床胶面0.5-1CM(3).启动记录仪和紫外检测仪。当基线稳定时，上样缓冲液-丙酮的混合物(0.25％V/V)并等待丙酮紫外吸收信号出现。
(4).当紫外信号稳定在最大吸收值(100％)时，换成缓冲液。在记录纸上作下标记。
(5).等待紫外信号下降并稳定在基线水平。
(6).根据图5所示，计算理论塔板数N。
N＝t2/σ2t＝平均保留时间，是从步骤4中的标记处到50％最大紫外信号的距离σ＝标准偏差是从最大紫外信号的15.85％到84.15％之间距离的一半在STREAMLINE200柱采用14.5CM的STREAMLINE DEAE凝胶，扩张到43.6CM，最后检测到t＝120.6，σ＝25.9，N＝t2/σ2＝120.62/25.92＝22为合理的理论塔板数实施例7扩张床吸附洗脱液上亲和层析操作程序实验材料1.设备层析柱90×70，蠕动泵，紫外检测仪和记录仪2.材料单抗胶MCAb-Sepharose F.F.，缓冲液PBS，0.1M Gly-HCl，0.1MTris-HCl，0.1MNaAc，0.5MNaOH实验程序1.平衡使用PBS平衡柱床2.上样根据扩张床吸附洗脱液的检测结果确定上样量，将洗脱液上样至柱内3.清洗使用PBS清洗柱内未吸附的杂质4.洗脱使用洗脱缓冲液将柱上吸附的干扰素清洗下来，收集洗脱峰，即图6中第2个峰5.再生使用Tris-HCl和NaAc缓冲液清洗残留的柱内杂质亲和层析图谱见图6，图中横坐标为时间，每一格是30分钟，图中纵坐标为280nm紫外线吸收相对值(百分数)。
实施例8凝胶过滤处理亲和层析洗脱液实验材料1.设备层析柱130×70，蠕动泵，紫外检测仪和记录仪2.材料Sephacryl S-100，缓冲液PBS，0.5MNaOH实验程序1.平衡使用PBS缓冲液平衡三个柱床体积
2.上样将亲和层析洗脱液按柱床体积4％的上样量上到柱内3.洗脱使用PBS缓冲液洗脱样品，收集干扰素主峰4.再生使用0.5MNaOH再生柱床凝胶过滤图谱见图7，图中横坐标为时间，每一格是60分钟，图中纵坐标为280nm紫外线吸收相对值(百分数)。
与现有技术相比较，采用本发明重组人干扰素α1b的纯化工艺，生产效率可以大大提高，生产成本则大大降低。具体体现在工艺周期缩短40％，纯化得率提高70％，生产成本降低40-50％等多方面。
(1).工艺周期比较 上表为干扰素新旧纯化工艺流程图和工期比较。从中可以看出，在旧工艺中，从菌体到原液的整个纯化工艺周期为5天时间，而新工艺仅为3天时间，工期缩短2天。纯化周期缩短40％，相应的纯化产能可以提高40％。而且由于通常纯化是整个生产的瓶颈所在，纯化产能提高40％，就意味着干扰素原料和制剂的生产能力提高40％。
(2).纯化得率比较从菌体开始，经过全部纯化路线，获得干扰素纯品。在不同规模情况下比较了新旧工艺的得率。
在实验室规模，用与旧工艺相同批的菌体匀浆液沿新工艺路线生产至干扰素纯品。其中，由于没有实验室规模扩张柱，实验室规模的扩张床吸附采用装填床的形式进行层析。而旧工艺的数据取自实际生产。从下表结果来看，新旧工艺活性得率之比为2.08，即新工艺得率提高1倍。
工艺放大后，在生产规模，采用STREAMLINE200柱进行扩张床吸附，与旧工艺采用相同的菌体匀浆液纯化至纯品。结果如下表，可以看出，同在生产规模，采用EBA的新工艺得率提高82％。
生产规模得率提高的幅度低于实验规模，主要原因有两点1.由于EBA得率远高于旧工艺中相应的初纯和离子交换步骤，因此EBA收集物上单抗时经常出现过量上样问题，导致干扰素流穿过多。而旧工艺不存在这个问题，在单抗步骤损失很少。2.EBA收集物由于只经过一步纯化，在样品保存过程中可能存在酶解问题。
(3).产品质量比较新旧工艺在质量指标上无明显差异，都完全满足生物制品规程的要求。所有指标包括比活、HPLC及电泳纯度、内毒素、外源DNA、宿主蛋白、IgG含量都全部合格，成品的动物实验等要求全部合格。
(4).生产成本比较A.新工艺固定资产投资降低。由于去除了离心分离、多步沉淀、柱层析脱盐和离子交换等步骤，因而减少了大型连续流离心机、多个反应罐和层析系统的投资。在年产1000万支干扰素的生产规模，纯化设备的投资可以减少260万人民币，减少幅度为41％。
B.物料成本降低。酸化沉淀、硫氨盐析、脱盐等步骤的减少，使得物料成本降低。在年产1000万支干扰素的生产规模，物料成本降低18万，降低幅度为58％。同时还伴随着水电等成本的下降。
C.人员成本下降。由于工艺的简化，劳动量的降低。使得完成相同任务所需人数大大降低。在年产1000万支干扰素的生产规模，纯化人数从14人减为8人，人员成本减少43％。
综合以上因素，可以看出，由于采用新工艺，整个纯化工艺的生产成本下降了40-50％。
以上各实施例意在具体说明本发明之设计思路在重组人干扰素α1b的纯化工艺中采用扩张床吸附技术取代传统的柱层析技术，以及如何实现该项技术。本发明之实施，并不限于以上各实施例所公开的方式，凡基于本发明之设计思路，进行简单推演与替换，得到的具体的重组人干扰素α1b的纯化工艺，都属于本发明的实施。
权利要求
1.一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，用于从表达人干扰素α1b的工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括细菌破碎，以及目标蛋白的捕获、中间纯化和精制过程，其特征在于所述目标蛋白的捕获过程采用扩张床吸附，中间纯化过程采用亲合层析，精制过程采用凝胶过滤。
2.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述亲合层析采用α1b干扰素的单克隆抗体偶联的凝胶。
3.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述亲合层析采用PBS做平衡液、0.05-0.2，优选值为0.1M Gly-HCl做洗脱液以及0.05-0.2，优选值为0.1MTris-HCl和0.05-0.2，优选值为0.1M NaAc做再生液。
4.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述凝胶过滤采用Sephacryl凝胶。
5.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述凝胶过滤采用PBS做缓冲液。
6.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述细菌破碎过程是在Tris-HCl缓冲液中进行。
7.如权利要求1至6任一所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述扩张床吸附采用阴离子凝胶。
8.如权利要求7所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述阴离子凝胶是STREAMLINE DEAE。
9.如权利要求1至6任一所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述扩张床吸附采用pH值为7.0-8.0，优选值为7.4的Tris-HCl缓冲液，并采用盐浓度洗脱的方法。
10.如权利要求9所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述盐浓度洗脱采用含0.2-0.5，优选值为0.4MNaCl的pH7.4 50mM Tris-Hcl做洗脱液。
全文摘要
一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，用于从表达人干扰素α1b的工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括细菌破碎、扩张床吸附、亲合层析和凝胶过滤步骤。细菌破碎是在Tris－HCl缓冲液中进行；所述扩张床吸附步骤中，选用阴离子凝胶，缓冲体系选用pH值为7.4的Tris－HCl，并选用0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris－Hcl洗脱液一步洗脱。所述亲和层析步骤中，选用α1b干扰素的单克隆抗体偶联的凝胶；平衡液采用PBS，清洗液采用PBS，洗脱液采用0.1M Gly－HCl，再生液采用0.1M Tris－HCl及0.1M NaAc－HAc缓冲液。所述凝胶过滤步骤中，选用Sephacryl凝胶，缓冲体系选用PBS。采用本重组人干扰素α1b的纯化工艺，生产效率可以大大提高，生产成本则大大降低。
文档编号C07K1/00GK1727361SQ20041005093
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月28日 优先权日2004年7月28日
发明者何询, 于德强, 张为 申请人:深圳科兴生物工程股份有限公司
技术领域：
本发明涉及含肽的医药配制品，特别是涉及蛋白质的分离纯化方法，尤其涉及重组人干扰素α1b的分离纯化工艺。
背景技术：
干扰素具有广泛的抗病毒活性，1957年Isaacs和Lindenmann在研究流感病毒的干扰现象时发现了这种物质用灭活的流感病毒作用于细胞后，细胞会产生一种可溶性物质，使得活病毒细胞的繁殖受到干扰，故称之为干扰素(Interferon，简写IFN)。干扰素具有三大功能抑制病毒繁殖活性、抑制细胞分裂活性和抑制免疫调节活性。
干扰素是一类调节细胞功能的蛋白质。根据抗原特异性和分子结构的不同，分为α、β、γ、ω等型别。而在一特定的干扰素型别内，再根据氨基酸序列或组成方面的差异，划分出不同的亚型，比如HuIFN(人干扰素)α1、α2等。而在一特定的干扰素亚型内，又会根据个别或少数氨基酸的变易，以a、b、c在亚型后面进行标记，比如HuIFNα1a，1b，2b等。
HuIFNα已经可以通过基因重组和其他生物工程技术，进行量产。而HuIFNα1b相对其他的诸如HuIFNα2来说，一个重要的区别在于，根据中国科学家多年的研究发现中国人白细胞经病毒刺激后，诱生的所有干扰素中最主要的亚型是α1b。并且试验还证明，中国人使用干扰素后，产生中和抗体的几率以α1b最低，所以α1b更符合中国人的自然状态。目前在中国普遍采用的由本申请人，深圳科兴生物工程股份有限公司生产的商品名称为赛若金的HuIFNα1b是由中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室的候云德教授等于1982年首次利用新城疫病毒F株(NDV-F)刺激脐血白细胞，提取mRNA，反转录成cDNA，成功克隆了IFNα1b cDNA无性繁殖系，并在大肠杆菌中得到了高效表达。
从干扰素的应用现状来看，HuIFNα型别应用案例比较多，以HuIFNα1b为例，可用于治疗病毒性疾病、恶性肿瘤、血液病等，尤其在慢性乙型、丙型病毒性肝炎的治疗上，给药途径多采用肌肉注射，用药量一般在100万-600万IU(国际单位)，有效率达到60％。通过国内许多医院的临床实践发现，采用对HuIFNα1b超声波雾化直接给药，对病毒性上呼吸道感染、病毒性疱疹、病毒性咽喉炎以及慢性口腔溃疡治疗效果显著。
在人α1b干扰素的生产过程中，工程菌经过传代培养和高密度发酵后，一道非常重要的工艺过程是蛋白质的分离纯化将人α1b干扰素从复杂的细菌表达环境中提取出来，去除各种杂质，包括颗粒、细菌、内毒素、核酸和各种杂蛋白等非目标蛋白物，以达到政府药监当局对该种生物制品要求的各项指标，满足临床需要。
目前人α1b干扰素的分离纯化主要步骤包括细菌破碎、初步纯化和精制纯化。因为在上述的工程菌中，人α1b干扰素为胞内可溶表达，所以分离纯化的第一步是破碎细菌，让干扰素从胞内释放出来，才能进行进一步的纯化。具体来说，初步纯化包括如下步骤离心1→酸化→离心2→碱中和→盐析1→离心3→盐析2→离心4共9步工艺，包括4步离心和3步沉淀法1步盐酸沉淀和2步(NH4)2SO4盐析沉淀，以及Sephadex G-50脱盐。精制纯化则包括3步柱层析CM-Sepharose F.F离子交换层析、单克隆抗体亲和层析、Sephacryl S-100分子筛。可以看出，整个纯化工艺相当复杂，特别是初步纯化部分，步骤繁多。
由于步骤繁多，工艺复杂，以及强酸强碱处理就使得现有的生产工艺存在以下问题由于在蛋白质的纯化过程中，每一步骤都会存在损失，从而必然导致总得率的降低；长时间的处理，导致生产效率的低下，再加上初步纯化中大量敞口操作，还容易造成产品污染，影响产品质量；步骤过多以及大量手工操作导致物料成本和人工成本过高，工艺经济性差。
另一方面，除了上述的蛋白沉淀和传统柱层析等技术，扩张床吸附技术开始应用于蛋白纯化处理。以Pharmacia的EBA系统(Expanded Bed Adsorption扩张床吸附)为例，它采用了独特的STREAMLINE凝胶及层析柱该凝胶是在普通琼脂糖凝胶的基础上结合了石英成分，从而增大了密度并且形成了一定的密度梯度；同时，设计了柱塞可自由升降又能保证密封的层析柱。这些独特的设计使得STREAMLINE凝胶可在从下向上的平衡缓冲液的作用下形成稳定的扩张柱床，因此，可以将未经澄清的带杂质的物料直接上样，在上样过程中，杂质如细胞碎片从凝胶颗粒之间洗掉，而蛋白质等生物分子则吸附在凝胶上。经清洗后，再将凝胶沉降下来，从而洗脱目标蛋白，达到纯化的目的。
从扩张床吸附原理可看出其优势在于可直接将未经澄清带杂质的物料直接上样，例如胞内表达的基因工程产品在细胞破碎后可以不必通过离心或超滤去除细胞碎片就可以直接上样，从而免除了离心或超滤的步骤。因此，扩张床吸附一步就起到了澄清、浓缩和初步纯化的作用。
是否能够把扩张床吸附技术应用于干扰素的纯化工艺？如何才能够把扩张床吸附技术应用于干扰素的纯化工艺，以达到简化工艺过程，提高生产效率的目的？现有技术似乎并没有这方面的考虑，也没有给出相应的解决方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于避免上述现有技术的不足之处，而提出一种能够使生产效率提高，生产成本降低的干扰素纯化工艺。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是，提出一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，用于从具备人干扰素α1b表达的工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括细菌破碎，以及目标蛋白的捕获、中间纯化和精制过程，并且所述目标蛋白的捕获过程采用扩张床吸附，中间纯化过程采用亲合层析，精制过程采用凝胶过滤。
所述细菌破碎是在Tris-HCl缓冲液中进行；所述扩张床吸附步骤中，选用阴离子凝胶，具体选用STREAMLINE DEAE；缓冲体系选用pH值为7.0-8.0，优选值为7.4的Tris-HCl，并采用盐浓度洗脱的方法；所述盐浓度洗脱选用含0.2-0.5，优选值为0.4MNaCl的pH7.450mM Tris-Hcl洗脱液一步洗脱。
所述亲和层析步骤中，选用α1b干扰素的单克隆抗体偶联的凝胶；平衡液采用PBS，洗脱液采用0.05-0.2，优选值为0.1MGly-HCl，再生液采用0.05-0.2，优选值为0.1M Tris-HCl和0.05-0.2，优选值为0.1MNaAc-HAc。
所述凝胶过滤步骤中，缓冲体系选用PBS；并选用Sephacryl凝胶。
与以蛋白沉淀为主的旧工艺比较，本发明中用扩张床吸附改造后的纯化新工艺具有明显的优势。具体体现在工艺周期缩短40％，纯化得率提高70％，生产成本降低40-50％等多方面。
同现有技术相比较，本发明重组人干扰素α1b的纯化工艺，生产效率可以大大提高，生产成本则大大降低。
图1为本发明重组人干扰素α1b的纯化工艺所采用扩张床吸附层析原理图。
图2-1至2-8为扩张床吸附操作系统阀门及管道原理图。
图3为扩张床吸附层析曲线。
图4为STREAMLINE DEAE凝胶吸附量测定曲线。
图5为扩张床吸附层析理论塔板数测定曲线。
图6为亲和层析曲线。
图7为凝胶过滤曲线。
具体实施例方式
以下对本发明作进一步详尽说明。
为什么要选用扩张床吸附技术？对纯化工艺的改进首先在于纯化策略和思路的变化。重组蛋白纯化的传统思路是将纯化分为初步纯化和高度纯化两部分，这种思路的出发点是从生产管理的角度来安排纯化生产工作，其弊端在于，从工艺技术的角度，这种分割并不具有明确的含义，分界处在那里？哪个单元是初步纯化，哪个单元是高度纯化。初步和高度纯化的概念很难用来确定一条工艺路线，从菌体开始逐步纯化获得符合各种要求的目标蛋白。一种新的纯化策略是从技术的角度出发，将重组蛋白从菌体到纯品的纯化工艺分成三部分目标蛋白捕获→中间纯化→精制。它的思路是首先从复杂的初始物料中将目标蛋白捕获出来，不要求高的纯度，而要求高回收率和大副减少处理体积，以及去除杂质颗粒。第二步中间纯化是提高纯度的关键步骤，将无颗粒和大幅减少体积后的物料采用高效的纯化手段，去除大部分杂质，大幅度提高目标蛋白纯度。第三步精制是将可能存在的小量杂质如聚体和异构体，以及前期纯化中可能带入的新杂质去除，以达到要求的纯度。
基于捕获→中间纯化→精制的纯化策略，和现有纯化工艺存在的问题，我们发现重要的是将原来低效复杂的初步纯化工艺以高效简单的手段代替。我们选用了Pharmacia的EBA系统(Expanded Bed Adsorption扩张床吸附)来进行此项改进。
自从1993年问世以来，扩张床吸附已广泛应用于基因工程产品的研究开发和生产。无论是大肠杆菌、酵母菌还是哺乳动物细胞，都有大量应用的实例。1998年，日本绿十字公司更将大规模扩张床吸附用于迄今为止最大的基因工程产品-重组白蛋白的生产，可见其应用之广泛。
采用EBA系统后，我们可以将干扰素的纯化工艺简化为细菌破碎→EBA→亲和层析→分子筛在细菌破碎后，只需要三步柱层析即可完成干扰素的分离纯化工作，获得符合质量要求的干扰素纯品。整个纯化工艺从原来的13步简化为4步，其中，EBA1步代替了旧工艺中的10步离心1→酸化→离心2→碱中和→盐析1→离心3→盐析2→离心4→脱盐→离子交换。整个纯化工艺被大大简化，生产效率得以提高。
与我们的纯化策略相一致，三步柱层析分别对应纯化策略的三个阶段。其中，EBA代替了离心、酸化、盐析、脱盐和离子交换的步骤，起到了样品澄清、浓缩和初步纯化的作用，将目标干扰素有效捕获，去除了细胞碎片等颗粒和部分杂蛋白、核酸，并且大大减少了物料体积。亲和层析作为一种高效的纯化手段，去除了大部分杂蛋白、核酸、内毒素等杂质，并进一步浓缩干扰素样品。最后一步分子筛则起到精制作用，去除了干扰素残存的少量杂蛋白、干扰素二聚体和可能从亲和层析脱落的IgG，并且起到交换缓冲液的作用。
如何具体运用扩张床吸附技术？我们通过一系列实验进行摸索，以确定有关的技术参数和指标。
实施例1扩张床吸附凝胶选择和层析参数优化
EBA的操作需要特殊的层析柱以产生稳定的扩张床。在工艺开发初期，首先采用装填床的形式进行实验摸索。采用装填床进行凝胶选择和参数优化，是因为，虽然扩张床的吸附效果比较好，但两种方式凝胶吸附所需的条件是保持一致的，对于选择凝胶和层析参数没有影响，而且可以节省小规模扩张床系统的投资。采用装填床，由于不能去除颗粒杂质，需要将样品先进行离心分离，以获得澄清物料。
实验方案在XK16×10(mm×cm)层析柱内进行，柱床体积20ml。分别选择一种阳离子凝胶STREAMLINE SP和一种阴离子凝胶STREAMLINE DEAE在不同的缓冲系统和不同的pH及离子强度条件下进行优化，结果如下表
其中，STREAMLINE SP凝胶采用pH4.7的柠檬酸及醋酸缓冲液，pH6.0、pH6.4的磷酸缓冲液进行了多次实验。可见最好的结果是采用pH6.4的磷酸缓冲液做为上样及洗脱条件，二次实验得率分别为45.9％以及43.8％，平均44.8％。
STREAMLINE DEAE在pH6.4的磷酸缓冲液，pH7.4和7.8的Tris缓冲液条件下进行了多次实验。可见pH7.8的两次实验，得率分别为35％和45％。PH7.4的两次实验，得率分别为54％和50.2％，平均52.1％，回收率较高，且较稳定。
分析以上实验结果，可知pH6.4的STREAMLINE SP和pH7.4的STREAMLINE DEAE都可以获得较好的结果，并且两者相比，pH7.4的STREAMLINE DEAE得率相对高出16％。选择何种条件，还要考虑的一个问题是前后工艺配合问题。由于菌体破碎是在pH7.8的Tris缓冲液中进行，匀浆液最终pH在7.4左右，正与STREAMLINE DEAE条件相符，而且在pH中性环境下，干扰素应最稳定。因此，pH7.4的STREAMLINE DEAE是理想条件。从另一个角度看，如果选用pH6.4的STREAMLINE SP，则匀浆需要更换缓冲体系，在酸性条件下，会出现蛋白沉淀，也可能存在其它意料不到的问题。因此，决定选用DEAE-STEAMLINE凝胶，并使用pH7.4的Tris-HCl作为层析缓冲液。
实施例2使用STREAMLINE DEAE装填床小柱进行干扰素纯化工艺摸索在实验室规模，使用XK16×10柱以装填床的形式，选用STREAMLINE DEAE和pH7.4的Tris缓冲液，用与旧工艺相同批的菌体匀浆液沿新工艺路线生产至干扰素纯品。新旧工艺比较中，旧工艺的数据取自实际生产。
实验材料1.设备层析柱XK16×10，凝胶STREAMLINE DEAE，层析系统Pharmacia GP-250梯度控制仪2.缓冲液平衡液pH7.4 50mM Tris-HCl，洗脱液0-0.5MNaCl pH7.450mM Tris-HCl实验程序1.装柱采用20ml/min的流速在平衡缓冲液体系中装柱，装柱体积20ml2.平衡采用10ml/min的流速，10个柱床体积的平衡液平衡柱床3.上样菌体匀浆液1000ml在10ml/min流速下上样，收集流穿4.清洗采用平衡液在10ml/min的流速下清洗柱床，洗至紫外吸收接近基线5.洗脱采用0-0.5MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl进行梯度洗脱，收集主峰6.再生采用多种CIP清洗液再生凝胶7.保存采用20％乙醇保存凝胶实验结果见下表，新工艺比旧工艺平均提高得率108％。
其中，Yn/Yo新工艺得率/旧工艺得率 At总活性
实施例3扩张床吸附手动纯化系统的建立在由实验规模向生产规模放大的过程中，面临着建立扩张床吸附纯化系统的问题。基于降低投资的考虑，我们与层析柱供应商一起建立扩张床吸附的手动纯化系统。
根据图2扩张床吸附操作原理图，扩张床吸附的步骤包括平衡扩张、样品上样、柱清洗、沉降洗脱，柱再生。为同时实现扩张和层析两个功能，必须采用双泵系统。一个泵负责柱床的扩张和沉降，另一个泵负责平衡、上样、洗脱、再生。同时，由于存在多种液体的更换，因此，需要较为复杂的阀门和管路系统。另外，需要基本的检测和记录系统。
根据以上分析，首先是确定在不同层析状态下，各种流体的流程图。如图2-1到2-8，分别包括初始状态、平衡扩张、柱塞上升、上样、清洗、柱塞下降、洗脱、再生等不同状态的流程图。其中，1-9为手动阀。A指初始缓冲液，B指洗脱缓冲液。在所有流程图中，黑线及箭头表示的路径是液体在该状态下的流动路程。如图2-4，上样流程图中，样品经过阀3、阀2、泵1、阀4、阀5、阀6、阀8进入层析柱内，上样产生的流穿从柱顶流出，经过阀7、阀6进入紫外检测仪，检测紫外吸收信号，再作为废液排走。
根据以上流程，选用了相应设备STREAMLINE200层析柱，WASTON-MARLOW蠕动泵两台，紫外检测仪及数据记录仪，手动阀门以及管道。将所有组件，根据工艺流程安装起来，形成了扩张床吸附的手动纯化系统。
实施例4扩张床吸附纯化干扰素新工艺的生产规模放大将实验规模的XK16/10小柱中摸索的条件直接放大至STREAMLINE200扩张柱，柱床体积由20ml放大到4.5L，为225倍一步放大。
实验材料1.设备层析柱STREAMLINE200，凝胶STREAMLINE DEAE4.5L，层析系统扩张床吸附手动纯化系统2.缓冲液平衡液pH7.450mM Tris-HCl，洗脱液0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl，再生液0.5MNaOH-1MNaCl，WFI，30％异丙醇、25％醋酸、20％乙醇实验程序1.装柱在平衡缓冲液体系中装柱，直接将凝胶装入层析柱内，装柱体积4.5L2.平衡采用300CM/H的流速，10个柱床体积的平衡液平衡柱床3.上样菌体匀浆液100L在300CM/H流速下上样，收集流穿4.清洗采用平衡液在300CM/H的流速下清洗柱床，洗至紫外吸收接近基线5.洗脱采用0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl以100CM/H进行一步洗脱，收集洗脱峰
6.再生采用多种CIP清洗液再生凝胶7.保存采用20％乙醇保存凝胶实验结果扩张床吸附层析曲线如图3。检定数据如下表，新工艺比旧工艺平均提高得率82％。
其中，Yn/Yo新工艺得率/旧工艺得率 At总活性
实施例5STREAMLINE DEAE凝胶负载测试实验材料层析柱XK16/6.9，采用装填床的形式装填13.8ml STREAMLINE DEAE凝胶。
平衡液pH7.450mM Tris缓冲液上样采用干扰素菌体匀浆液离心去除颗粒，作为上样液实验程序1.用缓冲液平衡10个柱床2.以270CM/H的速度上样1000ML3.对流穿定点取样，流穿收集点为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000ML4.检测各流穿收集点的干扰素浓度C，除以上样中干扰素浓度Co，得到C/Co值，C/Co最大为1。
5.以C/Co值对响应的收集体积作图，如图4。
实验结果从图4可以看出，上样达到400ml时，干扰素流穿C/Co＝0.28，尚可接受。上样500ml时，C/Co＝0.44，已经完全不可接受。因此，以400ml点作为凝胶最大吸附量。计算STREAMLINEDEAE凝胶吸附量如下。
1.凝胶最大菌体负载＝400ml×50gcell/1000ml/13.8mlgel＝1.45gcell/ml gel2.凝胶最大菌体干扰素负载＝400ml×0.0252mg IFN/ml/13.8ml gel＝0.725mg IFN/ml gel根据以上凝胶负载，STEAMLINE200柱所装4.5L凝胶，其最大菌体上样量为6.5Kg菌体，按最大负载80％上样，上样量为5.2Kg干扰素菌体。
实施例6STREAMLLINE200柱床稳定性检测1.目检对玻璃制的扩张床柱，目检是检测柱床稳定性的重要步骤。在柱床平衡扩张后，进行目检。稳定的柱床中，悬浮的凝胶颗粒只在原地做小的旋转运动。如果出现紊流或沟流，会导致吸附效果不理想。柱床上部大的回旋运动，可能是柱子没有处于垂直的位置。柱床下部的沟流提示柱底的分布器中存在气泡或者分布系统部分堵塞。
2.柱床扩张倍数检测扩张倍数是扩张后柱床的高度H与沉降后柱床的高度Ho的比值，H/Ho。理想状态下，扩张倍数与流速，缓冲体系，温度有关，这三个指标确定的情况下，扩张倍数得以确定。异常情况下，扩张倍数的下降可能意味着分布板中存在气泡或堵塞，凝胶被污染，柱子不垂直等问题。
在STREAMLINE200柱中，使用STREAMLINE DEAE凝胶，50mM pH7.4的Tris缓冲液，20℃的工作温度，和300CM/H的平衡速度，扩张倍数＝H/Ho＝43.6/14.5＝3.0，为合理值。
3.理论塔板数检测保留时间分布实验可以用来确定理论塔板数，以评估扩张床中凝胶轴向分布的情况。将稀释的丙酮溶液上样到扩张好的柱内，同时检测流出物中丙酮的紫外吸收信号，根据层析图谱计算理论塔板数。具体程序如下(1).采用平衡缓冲液在300GM/H流速下充分扩张，记录扩张床高度。
(2).降低柱塞到离扩张床胶面0.5-1CM(3).启动记录仪和紫外检测仪。当基线稳定时，上样缓冲液-丙酮的混合物(0.25％V/V)并等待丙酮紫外吸收信号出现。
(4).当紫外信号稳定在最大吸收值(100％)时，换成缓冲液。在记录纸上作下标记。
(5).等待紫外信号下降并稳定在基线水平。
(6).根据图5所示，计算理论塔板数N。
N＝t2/σ2t＝平均保留时间，是从步骤4中的标记处到50％最大紫外信号的距离σ＝标准偏差是从最大紫外信号的15.85％到84.15％之间距离的一半在STREAMLINE200柱采用14.5CM的STREAMLINE DEAE凝胶，扩张到43.6CM，最后检测到t＝120.6，σ＝25.9，N＝t2/σ2＝120.62/25.92＝22为合理的理论塔板数实施例7扩张床吸附洗脱液上亲和层析操作程序实验材料1.设备层析柱90×70，蠕动泵，紫外检测仪和记录仪2.材料单抗胶MCAb-Sepharose F.F.，缓冲液PBS，0.1M Gly-HCl，0.1MTris-HCl，0.1MNaAc，0.5MNaOH实验程序1.平衡使用PBS平衡柱床2.上样根据扩张床吸附洗脱液的检测结果确定上样量，将洗脱液上样至柱内3.清洗使用PBS清洗柱内未吸附的杂质4.洗脱使用洗脱缓冲液将柱上吸附的干扰素清洗下来，收集洗脱峰，即图6中第2个峰5.再生使用Tris-HCl和NaAc缓冲液清洗残留的柱内杂质亲和层析图谱见图6，图中横坐标为时间，每一格是30分钟，图中纵坐标为280nm紫外线吸收相对值(百分数)。
实施例8凝胶过滤处理亲和层析洗脱液实验材料1.设备层析柱130×70，蠕动泵，紫外检测仪和记录仪2.材料Sephacryl S-100，缓冲液PBS，0.5MNaOH实验程序1.平衡使用PBS缓冲液平衡三个柱床体积
2.上样将亲和层析洗脱液按柱床体积4％的上样量上到柱内3.洗脱使用PBS缓冲液洗脱样品，收集干扰素主峰4.再生使用0.5MNaOH再生柱床凝胶过滤图谱见图7，图中横坐标为时间，每一格是60分钟，图中纵坐标为280nm紫外线吸收相对值(百分数)。
与现有技术相比较，采用本发明重组人干扰素α1b的纯化工艺，生产效率可以大大提高，生产成本则大大降低。具体体现在工艺周期缩短40％，纯化得率提高70％，生产成本降低40-50％等多方面。
(1).工艺周期比较 上表为干扰素新旧纯化工艺流程图和工期比较。从中可以看出，在旧工艺中，从菌体到原液的整个纯化工艺周期为5天时间，而新工艺仅为3天时间，工期缩短2天。纯化周期缩短40％，相应的纯化产能可以提高40％。而且由于通常纯化是整个生产的瓶颈所在，纯化产能提高40％，就意味着干扰素原料和制剂的生产能力提高40％。
(2).纯化得率比较从菌体开始，经过全部纯化路线，获得干扰素纯品。在不同规模情况下比较了新旧工艺的得率。
在实验室规模，用与旧工艺相同批的菌体匀浆液沿新工艺路线生产至干扰素纯品。其中，由于没有实验室规模扩张柱，实验室规模的扩张床吸附采用装填床的形式进行层析。而旧工艺的数据取自实际生产。从下表结果来看，新旧工艺活性得率之比为2.08，即新工艺得率提高1倍。
工艺放大后，在生产规模，采用STREAMLINE200柱进行扩张床吸附，与旧工艺采用相同的菌体匀浆液纯化至纯品。结果如下表，可以看出，同在生产规模，采用EBA的新工艺得率提高82％。
生产规模得率提高的幅度低于实验规模，主要原因有两点1.由于EBA得率远高于旧工艺中相应的初纯和离子交换步骤，因此EBA收集物上单抗时经常出现过量上样问题，导致干扰素流穿过多。而旧工艺不存在这个问题，在单抗步骤损失很少。2.EBA收集物由于只经过一步纯化，在样品保存过程中可能存在酶解问题。
(3).产品质量比较新旧工艺在质量指标上无明显差异，都完全满足生物制品规程的要求。所有指标包括比活、HPLC及电泳纯度、内毒素、外源DNA、宿主蛋白、IgG含量都全部合格，成品的动物实验等要求全部合格。
(4).生产成本比较A.新工艺固定资产投资降低。由于去除了离心分离、多步沉淀、柱层析脱盐和离子交换等步骤，因而减少了大型连续流离心机、多个反应罐和层析系统的投资。在年产1000万支干扰素的生产规模，纯化设备的投资可以减少260万人民币，减少幅度为41％。
B.物料成本降低。酸化沉淀、硫氨盐析、脱盐等步骤的减少，使得物料成本降低。在年产1000万支干扰素的生产规模，物料成本降低18万，降低幅度为58％。同时还伴随着水电等成本的下降。
C.人员成本下降。由于工艺的简化，劳动量的降低。使得完成相同任务所需人数大大降低。在年产1000万支干扰素的生产规模，纯化人数从14人减为8人，人员成本减少43％。
综合以上因素，可以看出，由于采用新工艺，整个纯化工艺的生产成本下降了40-50％。
以上各实施例意在具体说明本发明之设计思路在重组人干扰素α1b的纯化工艺中采用扩张床吸附技术取代传统的柱层析技术，以及如何实现该项技术。本发明之实施，并不限于以上各实施例所公开的方式，凡基于本发明之设计思路，进行简单推演与替换，得到的具体的重组人干扰素α1b的纯化工艺，都属于本发明的实施。
权利要求
1.一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，用于从表达人干扰素α1b的工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括细菌破碎，以及目标蛋白的捕获、中间纯化和精制过程，其特征在于所述目标蛋白的捕获过程采用扩张床吸附，中间纯化过程采用亲合层析，精制过程采用凝胶过滤。
2.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述亲合层析采用α1b干扰素的单克隆抗体偶联的凝胶。
3.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述亲合层析采用PBS做平衡液、0.05-0.2，优选值为0.1M Gly-HCl做洗脱液以及0.05-0.2，优选值为0.1MTris-HCl和0.05-0.2，优选值为0.1M NaAc做再生液。
4.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述凝胶过滤采用Sephacryl凝胶。
5.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述凝胶过滤采用PBS做缓冲液。
6.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述细菌破碎过程是在Tris-HCl缓冲液中进行。
7.如权利要求1至6任一所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述扩张床吸附采用阴离子凝胶。
8.如权利要求7所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述阴离子凝胶是STREAMLINE DEAE。
9.如权利要求1至6任一所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述扩张床吸附采用pH值为7.0-8.0，优选值为7.4的Tris-HCl缓冲液，并采用盐浓度洗脱的方法。
10.如权利要求9所述的重组人干扰素α1b的纯化工艺，其特征在于所述盐浓度洗脱采用含0.2-0.5，优选值为0.4MNaCl的pH7.4 50mM Tris-Hcl做洗脱液。
全文摘要
一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，用于从表达人干扰素α1b的工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括细菌破碎、扩张床吸附、亲合层析和凝胶过滤步骤。细菌破碎是在Tris－HCl缓冲液中进行；所述扩张床吸附步骤中，选用阴离子凝胶，缓冲体系选用pH值为7.4的Tris－HCl，并选用0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris－Hcl洗脱液一步洗脱。所述亲和层析步骤中，选用α1b干扰素的单克隆抗体偶联的凝胶；平衡液采用PBS，清洗液采用PBS，洗脱液采用0.1M Gly－HCl，再生液采用0.1M Tris－HCl及0.1M NaAc－HAc缓冲液。所述凝胶过滤步骤中，选用Sephacryl凝胶，缓冲体系选用PBS。采用本重组人干扰素α1b的纯化工艺，生产效率可以大大提高，生产成本则大大降低。
文档编号C07K1/00GK1727361SQ20041005093
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月28日 优先权日2004年7月28日
发明者何询, 于德强, 张为 申请人:深圳科兴生物工程股份有限公司
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