一种禽用油乳剂疫苗及其制备方法

专利名称：：一种禽用油乳剂疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属于兽用生物制品
技术领域：
具体涉及禽用油乳剂疫苗及其制备方法。
背景技术：
：我国禽肉产品屡遭封关，1996年8月1日至2001年5月24日，欧盟以我国出口的禽肉中含有动物疫病和农药、兽药残留等为由对我国封关5年。2004年欧盟又以禽流感为由全面禁止进口我国禽肉产品，直到2008年8月才宣布解除我国禽肉产品禁令。刚解除禁令又遇“配额”难题。解决所有问题的先决条件就是要提高我国禽产品质量。为减少禽病害发生，同时为避免长期应用抗生素、激素类产品所造成的菌群失调，耐药菌株增加及药物残留等负面影响，以发展优质，无公害的禽产品，保证我国家禽产业持续健康发展并参与国际市场的竞争，具有良好免疫效果的疫苗将起极其重要的作用。目前，预防和控制家禽传染病除生物安全措施外，主要依靠疫苗免疫，特别是通过油乳剂疫苗的免疫。油性佐剂疫苗是已公认的可有效强化免疫性的疫苗。油乳剂疫苗的生物安全性高，具有用最小量的抗原，最少的接种次数，延长免疫刺激时间，使机体产生足够量的抗体的特点，所以乳化品质优良的油乳剂苗是保证免疫效果的前提。在现有的油乳剂疫苗(简称“油苗”)生产过程中，通常添加2%的硬脂酸铝来增加其稳定性，但其粘度较大引起免疫注射的应激反应较大，如导致严重接种反应、形成无菌性化脓损害和接种部位周围形成肉芽肿等，可产生外部可见的浮肿、肿胀、硬结和坏死。而且人们怀疑在接种部位有残留的可能，这便妨碍了疫苗的使用，这种现象在种鸡免疫中表现得尤为明显。基于这个原因，使用含有矿物油的油性佐剂的疫苗有时是受到一定限制的。对于油性佐剂疫苗而言，已知这种疫苗不仅在免疫强化作用方面，而且在药物制剂的稳定性方面，都在相当大的程度上受到乳剂类型、所用油性成分以及所结合的表面活性剂种类等因素的影响。尤其就灭活疫苗来说制备出一种具有在较长时间内能诱导产生充分免疫保护作用，并有着良好再现性的疫苗，是非常困难的。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种禽用油乳剂疫苗，该疫苗不含硬脂酸铝，能在较长时间内保持较高的抗体产生能力，并解决注射疫苗引起的动物的应激反应以及疫苗残留问题。本发明要解决的另一技术问题是提供一种该疫苗的制备方法。本发明提供的油乳剂疫苗是油包水油性佐剂疫苗，水相的体积分数为33.3%，油相的体积分数为66.7%，其中水相含有一种生物学上可接受的有效量抗原和亲水性非离子型表面活性剂；油相含有矿物油、卵磷脂、丙二醇、异甘露醇单油酸脂和亲油性非离子型表面活性剂。所述生物学上可接受的抗原，如禽用禽流感抗原、新城疫抗原、支气管炎抗原、减蛋综合症抗原、法氏囊抗原及其混合物等。所述亲水性非离子型表面活性剂常温下呈液态为好，优选吐温-80。所述亲油性非离子型表面活性剂常温下呈液态为好，优选司盘-80。所述油相中所含的卵磷脂最好为脱油型的。适于本发明的矿物油如常规的白油佐剂等。本发明提供的油乳剂疫苗可以是以下质量组成水相生物学上可接受的有效量的抗原20%水性非离子型表面活性剂水70%-79%油相卵磷脂丙二醇异甘露醇单油酸脂亲油性非离子型表面活性剂2%-15%矿物油70%-95%本发明的疫苗可以采用下列技术步骤制备1.水相的制备将亲水性非离子型表面活性剂用水做3倍稀释，然后121°C高压灭菌30min后冷却至室温，再加入一定量的抗原使亲水性非离子型表面活性剂最终浓度为1%_10%，抗原最终浓度为20%，混合均勻备用。2.油相的制备将一定量的矿物油、丙二醇、卵磷脂和异甘露醇单油酸脂混合均勻为佐剂，再与亲油性非离子型表面活性剂混勻为油相，经121°C灭菌30min，冷却至室温，使亲油性非离子型表面活性剂最终浓度为2%-15%、丙二醇最终浓度-5%、卵磷脂最终浓度_5%、异甘露醇单油酸脂最终浓度-5%。3.乳化按油相水相=21的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为9000-13000rpm，温度10_20°C的情况下，将水相以0.6mL/s的速度加入油相中，再继续以速度13500-17500rpm乳化3_7min。上述技术方案步骤2中，异甘露醇单油酸脂可通过以下方式制备油酸甲酯、异甘露醇与甲醇钠在25-50mmHg真空度下加热至100°Clh，冷至室温，加入己烷，过滤除去异甘露醇，在218°C-220°C/0.175mmHg下蒸馏得到异甘露醇单油酸脂。本发明方法得到的禽用油乳剂疫苗，不含硬脂酸铝，降低了疫苗粘度更利于吸收，从而减少留存，在接种部位表现出优异的局部安全性，在较长时间内表现出较强的诱导抗体产生能力。通过调整油相和水相的配方及其比例，减少了免疫注射引起的应激反应，且不影响疫苗的稳定性及免疫效果，从而也就提高了疫苗质量。这种疫苗即使在低粘度区域稳定性也较高，副反应较小，诱导抗体产生能力以及保持高水平的抗体产生的能力都很强。本发明方法操作简单易行。具体实施例方式为了举例说明，以非限制性的方式提供下面的实施例。实施例11.将4份吐温-80以3倍水稀释，然后在121°C高压灭菌30min后冷却至室温；取HA效价为81og2的新城疫抗原60份与12份3倍水稀释、121°C灭菌30min吐温-80，加28份的水混合均勻为水相。2.先将88份的白油、2份的丙二醇、2份的卵磷脂和2份的异甘露醇单油酸脂混合均勻为佐剂，再与6份的司盘-80混勻为油相经121°C灭菌30min，冷却至室温备用。3.按油相水相=21的体积比例，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为1IOOOrpm,温度10-20V的情况下，水相加入油相的速度为0.6mL/s,再继续以速度15500rpm乳化5min，制备的疫苗分为三份，批号分别为0901、0902和0903。对比例11.取HA效价为81og2的同实施例1的新城疫抗原60份与12份3倍水稀释在121°C高压灭菌30min后冷却至室温的吐温_80，加28份水混合均勻为水相。2.将94份的白油、6份的司盘-80和2份(0.02g/mL)的硬脂酸铝混合均勻为油相，经121°C灭菌30min，冷却至室温备用。3.按油相水相=21的体积比例，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为1IOOOrpm,温度10-20V的情况下，水相加入油相的速度为0.6mL/s,再继续以速度15500rpm乳化5min，制备的疫苗分为三份，批号分别为0904、0905和0906。比较实施例1和对比例1制备疫苗的性状1.外观两者均为乳白色均勻乳剂。2.剂型两者均呈油包水型。在洁净的水面上，滴一滴油乳剂，观察其形态、是否分散、分散开的时间。结果显示两者形状均为规则圆形、不扩散。3.粘度用ImL吸管(上口内径2.7mm，下口内径1.2mm)，吸取25°C左右的疫苗ImL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需要的时间。结果显示两者3次流出时间均在5s内，符合规程要求，以无硬脂酸铝疫苗黏度更低，均在3s内。4.稳定性(1)取IOmL疫苗置于离心管中以3000r/min离心15min，管底析出的水相^0.5mL。(2)取疫苗在37°C左右放置21d，结果显示不分层，没有破乳现象。5.纯净性检验按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验，完全符合，安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。6.安全性检验用14日龄SPF(无特定病原体)鸡，每种疫苗免疫10只鸡，每只腿部肌肉注射疫苗lmL，空白对照10只。每天观察免疫鸡只，接种后14天剖检鸡只，观察局部及全身反应，观察局部疫苗吸收情况。两种疫苗检测性状对比见表1。表1两种疫苗检测性状对比<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>7.效力检验血清学方法用30-60日龄SPF(无特定病原体)鸡，每种疫苗免疫10只鸡，每只皮下或肌肉注射疫苗20μL，空白对照10只。接种后21-28日，每只鸡静脉采血，分离血清，进行HI抗体效价测定，评价结果见表2。表2两种疫苗效力检验结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从效力检验实验可以看出，无硬脂酸铝油苗与常规方法制备的疫苗效力无明显区另|J，在免疫后21天都能使抗体效价达到要求。结论上述结果清楚地表明，本发明的油性佐剂疫苗即使不含硬脂酸铝，它所显示的免疫作用也与含硬脂酸铝疫苗的作用基本相同，且与含硬脂酸铝的油苗相比，本发明的疫苗有更好的局部反应能力。此外，这些结果也表明，按照本发明的方法制备的油性疫苗同样具有高稳定性，在长时间内显示出极好的功效，同时粘度更低，易于注射，注射引起的应激反应更小，对动物体更安全。不仅黏度降低免疫效果良好，而且不会产生常规油佐剂疫苗所引起的较大应激反应，常见的免疫注射部位浮肿、肿胀、硬结和坏死等问题都得以解决。另一方面，由于疫苗黏度降低，在接种家禽后，更容易吸收，不会产生药物残留的情况，符合生物安全的要求，有利于禽类产品的出口，提高产品的竞争力。对保证我国家禽产业持续健康发展，对发展绿色食品的生产和保证人民的身体健康具有重要意义。上列详细说明系针对本发明之一可行实施例之具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明之专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之等效实施或变更，均应包含于本案之专利范围中。权利要求一种禽用油乳剂疫苗，是油包水油性佐剂疫苗，水相的体积分数为33.3％，油相的体积分数为66.7％，其中水相含有一种生物学上可接受的有效量抗原和亲水性非离子型表面活性剂；油相含有矿物油、卵磷脂、丙二醇、异甘露醇单油酸脂和亲油性非离子型表面活性剂。2.按照权利要求1所述的禽用油乳剂疫苗，其特征是所述生物学上可接受的抗原是指禽用禽流感抗原、新城疫抗原、支气管炎抗原、减蛋综合症抗原、法氏囊抗原及其混合物；所述亲水性非离子型表面活性剂是指吐温-80；所述亲油性非离子型表面活性剂是指司盘-80；所述卵磷脂最好是脱油型；所述矿物油是指常规白油佐剂。3.按照权利要求2所述的禽用油乳剂疫苗，其特征是含有以下质量组成水相生物学上可接受的有效量的抗原20%水性非离子型表面活性剂水70%-79%油相卵磷脂丙二醇异甘露醇单油酸脂亲油性非离子型表面活性剂2%-15%矿物油70%-95%4.按照权利要求3所述的禽用油乳剂疫苗，其特征是异甘露醇单油酸脂通过以下方式制备油酸甲酯、异甘露醇与甲醇钠在25-50mmHg真空度下加热至100°Clh，冷至室温，加入己烷，过滤除去异甘露醇，在218°C-220V/0.175mmHg下蒸馏得到异甘露醇单油酸脂。5.一种权利要求14之一所述的禽用油乳剂疫苗的制备方法，包括下列步骤(1)水相的制备将亲水性非离子型表面活性剂用水做3倍稀释，然后121°C高压灭菌30min后冷却至室温，再加入一定量的抗原使亲水性非离子型表面活性剂最终浓度为1%_10%，抗原最终浓度为20%，混合均勻备用。(2)油相的制备将一定量的矿物油、丙二醇、卵磷脂和异甘露醇单油酸脂混合均勻为佐剂，再与亲油性非离子型表面活性剂混勻为油相，经121°C灭菌30min，冷却至室温，使亲油性非离子型表面活性剂最终浓度为2%-15%、丙二醇最终浓度-5%、卵磷脂最终浓度_5%、异甘露醇单油酸脂最终浓度-5%。(3)乳化按油相水相=21的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为9000-13000rpm，温度10_20°C的情况下，将水相以0.6mL/s的速度加入油相中，再继续以速度13500-17500rpm乳化3_7min。全文摘要本发明公开了一种禽用油乳剂疫苗及其制备方法，是油包水油性佐剂疫苗，水相的体积分数为33.3％，油相的体积分数为66.7％，其中水相含有一种生物学上可接受的有效量抗原和亲水性非离子型表面活性剂；油相含有矿物油、卵磷脂、丙二醇、异甘露醇单油酸脂和亲油性非离子型表面活性剂。该疫苗不含硬脂酸铝，能在较长时间内保持较高的抗体产生能力，并解决注射疫苗引起的动物的应激反应以及疫苗残留问题。文档编号A61K39/39GK101829323SQ20101015726公开日2010年9月15日申请日期2010年4月28日优先权日2010年4月28日发明者乔荣岑,习向锋,孙进忠,张海洋,张许科,李三,陶家权申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司